基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)西瓜中的噁霉靈

劉任 辛美果

摘 要：本文建立了基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)西瓜中的噁霉靈農(nóng)藥殘留的方法。結(jié)果表明，密度泛函計(jì)算與固體標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比得出噁霉靈在600 cm-1、924 cm-1、1 258 cm-1、1 489 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1和3 155 cm-1處有明顯的特征峰。當(dāng)硝酸銀與鹽酸羥胺按照5∶1體積比配制銀溶膠時(shí)，且在保持10 ?L噁霉靈農(nóng)藥體積不變的情況下，加入7.5 ?L的銀溶膠，噁霉靈的拉曼特征峰強(qiáng)度最大，表面增強(qiáng)效果最好。在實(shí)際食品基質(zhì)西瓜中，噁霉靈的最低檢出濃度為10-4 mol·L-1。該方法檢測(cè)限低，靈敏度高，無需復(fù)雜的前處理，可實(shí)現(xiàn)西瓜中噁霉靈的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：密度泛函理論；表面增強(qiáng)拉曼光譜；噁霉靈

Rapid Detection of Hymexazol in Watermelon Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy

LIU Ren， XIN Meiguo*

（Foshan University， Foshan 528000， China）

Abstract： In this paper， a method for rapid detection of hymexazol pesticide residues in watermelon was developed based on surface-enhanced Raman spectroscopy. The results showed that the density functional calculation compared with the solid standard product showed that hymexazol had obvious characteristic peaks at 600 cm-1，

924 cm-1， 1 258 cm-1， 1 489 cm-1， 1 623 cm-1， 2 937 cm-1 and 3 155 cm-1. When silver nitrate and hydroxylamine hydrochloride were prepared according to the volume ratio of 5∶1， the Raman characteristic peak strength of hymexazol ?was the highest and the surface enhancement effect was the best when the volume of hymexazol ?pesticide was kept unchanged at 10 ?L and 7.5 ?L silver sol was added. In the actual food substrate watermelon， the lowest detectable concentration of hymexazol ?was 10-4 mol·L-1. This method has low detection limit， high sensitivity and no need for complex pretreatment， and can achieve rapid detection of hymexazol ?in watermelon.

Keywords： density functional theory; surface-enhanced raman spectroscopy; hymexazol

農(nóng)藥是用來控制害蟲、抑制真菌、消滅雜草的具備多種物理或化學(xué)特性的有機(jī)化合物[1]。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)[2]，殺菌劑類農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用極其廣泛[3]。但是，過多地使用殺菌劑類農(nóng)藥，很容易在農(nóng)作物中形成農(nóng)藥殘留，食用含農(nóng)藥殘留的農(nóng)作物可能會(huì)引發(fā)人體的慢、急性中毒。因此，有必要對(duì)食品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。噁霉靈的化學(xué)名稱是3-羥基-5-甲基異噁唑，CAS號(hào)是10004-44-1[4]，屬噁唑類殺菌劑[5]，是日本三共株式會(huì)社研發(fā)的一種效果極佳的內(nèi)吸性廣譜殺菌劑[6-7]。噁霉靈可被用于真菌引起的各種疾病的治療。目前文獻(xiàn)中關(guān)于噁霉靈殘留檢測(cè)的常規(guī)方法主要是液相、氣相、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，常規(guī)方法具有預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)、需要專業(yè)檢測(cè)人員檢測(cè)、不能滿足食品監(jiān)管部門的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的缺點(diǎn)[4]。因此，有必要研究噁霉靈的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。

密度泛函理論（Density Functional Theory，DFT）不僅能夠直觀地描述分子振動(dòng)情況，而且能夠極大地減少計(jì)算量，被廣泛應(yīng)用于分子的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、反應(yīng)機(jī)理、振動(dòng)光譜等方面的研究[8]。借助密度泛函理論，可以預(yù)測(cè)噁霉靈的理論拉曼光譜。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是基于表面增強(qiáng)拉曼散射現(xiàn)象發(fā)展而來的技術(shù)。SERS技術(shù)反映的是單個(gè)分子的振動(dòng)信息。因此，即使是極低濃度的樣品，也能通過具有超高靈敏度的SERS技術(shù)檢測(cè)出來[9]。而SERS技術(shù)作為一種高效的光譜檢測(cè)方法，已經(jīng)在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、醫(yī)藥及生物安全等多個(gè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了廣泛應(yīng)用。

本文基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，借助密度泛函理論預(yù)測(cè)噁霉靈的理論拉曼光譜，首次獲得了噁霉靈的表面增強(qiáng)拉曼光譜，同時(shí)優(yōu)化了表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)條件，實(shí)現(xiàn)了在實(shí)際食品基質(zhì)西瓜中，通過將噁霉靈加標(biāo)到西瓜基質(zhì)中檢測(cè)噁霉靈的表面增強(qiáng)拉曼光譜，該方法的最低檢出濃度低，為食品監(jiān)管部門快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)噁霉靈提供了有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

西瓜，學(xué)校超市。

乙腈（分析純）、硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）、鹽酸羥胺（分析純）、噁霉靈（純度99.8%），廣州春暢生物技術(shù)開發(fā)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

LabRAM HR Evolution顯微共焦拉曼光譜儀，HORIBA Scientific公司；BSA2202s電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MINI-10K迷你離心機(jī)，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 密度泛函理論計(jì)算

在Gaussian View 6.0軟件中繪制噁霉靈農(nóng)藥分子的幾何結(jié)構(gòu)圖，在Gaussian 16W中基于密度泛函理論，設(shè)置參數(shù)為b3lyp/6-31g（d，p），計(jì)算獲得噁霉靈分子的幾何優(yōu)化結(jié)構(gòu)圖和理論拉曼光譜圖。

1.2.2 噁霉靈固體標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜的檢測(cè)

取噁霉靈固體標(biāo)準(zhǔn)品適量于干凈的載玻片上，平鋪置于顯微共焦拉曼光譜儀的載物臺(tái)上，進(jìn)行檢測(cè)得到拉曼光譜圖。

1.2.3 表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱量噁霉靈標(biāo)準(zhǔn)品0.019 8 g溶解于1 mL乙腈中，得到10-1 mol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后依次稀釋得到10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1、10-4 mol·L-1、10-5 mol·L-1和10-6 mol·L-1系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（1）探究噁霉靈的特征峰峰強(qiáng)與按照不同體積比配制銀溶膠的關(guān)系。利用鹽酸羥胺還原法制備納米銀增強(qiáng)基底[10]，將硝酸銀與鹽酸羥胺分別按照1∶1、3∶1、5∶1、7∶1和9∶1比例配制1 000 ?L體系的銀溶膠增強(qiáng)基底，取配制好的7.5 ?L銀溶膠與10 ?L 10-2 mol·L-1的噁霉靈溶液，混合均勻，取

10 ?L上述混合均勻的銀溶膠與噁霉靈溶液滴加在干凈的載玻片上檢測(cè)拉曼光譜。

（2）探究噁霉靈的特征峰峰強(qiáng)與銀溶膠加入量的關(guān)系。選擇上述對(duì)噁霉靈增強(qiáng)效果最好的體積比銀溶膠，分別將2.5 ?L、5.0 ?L、7.5 ?L、10.0 ?L和

12.5 ?L的銀溶膠加入10 ?L 10-2 mol·L-1的噁霉靈標(biāo)準(zhǔn)溶液中，混合均勻，取10 ?L上述混合均勻的銀溶膠與噁霉靈溶液滴加在干凈的載玻片上檢測(cè)拉曼光譜。

1.2.4 表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)

將學(xué)校超市的西瓜切塊、榨汁、過濾和離心后取上清液，將配制好的系列濃度梯度噁霉靈標(biāo)準(zhǔn)溶液各取10 ?L分別加標(biāo)到10 ?L的上清液中作為待檢測(cè)溶液，將硝酸銀和鹽酸羥胺按照優(yōu)化后的體積比配制成銀溶膠，取優(yōu)化后的銀溶膠的加入量加入待檢測(cè)溶液中混合均勻，立即對(duì)噁霉靈進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噁霉靈分子的幾何優(yōu)化結(jié)構(gòu)和特征峰峰位歸屬

2.1.1 經(jīng)過DFT優(yōu)化后的噁霉靈分子結(jié)構(gòu)圖

根據(jù)密度泛函理論計(jì)算獲得優(yōu)化后的噁霉靈分子結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

2.1.2 噁霉靈密度泛函理論計(jì)算的拉曼光譜和固體標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)拉曼光譜

圖2為噁霉靈密度泛函理論計(jì)算拉曼光譜圖和固體標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖，從圖中可以明顯看出噁霉靈的拉曼特征峰有600 cm-1、924 cm-1、1 258 cm-1、1 490 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1和3 156 cm-1。

取上述7個(gè)特征峰的密度泛函理論計(jì)算的拉曼位移與固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜的拉曼位移，分析這7個(gè)特征峰拉曼位移的吻合程度。由圖3可知，實(shí)驗(yàn)拉曼光譜位移與密度泛函理論計(jì)算的拉曼光譜位移線性擬合的R2達(dá)到了0.999 36，R2數(shù)值越接近1，表示實(shí)驗(yàn)與理論計(jì)算的拉曼位移吻合程度越高，說明密度泛函理論計(jì)算得到的理論拉曼光譜與固體拉曼光譜位移非常接近，密度泛函理論預(yù)測(cè)的理論拉曼光譜的準(zhǔn)確性高，可作為較好的理論依據(jù)，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)噁霉靈固體標(biāo)準(zhǔn)品峰位的拉曼位移偏移進(jìn)行分析。

2.1.3 噁霉靈的峰位歸屬

根據(jù)密度泛函理論計(jì)算的拉曼光譜圖和優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)圖，可以指認(rèn)出噁霉靈的拉曼光譜峰位歸屬（表1），其中位于474 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的C-C面內(nèi)彎曲振動(dòng)和O-H彎曲振動(dòng)。位于600 cm-1處的拉曼位移是C-C的伸縮振動(dòng)和苯環(huán)上的C-C彎曲振動(dòng)。位于924 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的N-O伸縮振動(dòng)和CH3上的C-H彎曲振動(dòng)。位于997 cm-1處的拉曼位移是N-O伸縮振動(dòng)和CH3上的C-H彎曲振動(dòng)。位于1 031 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的N-O伸縮振動(dòng)和苯環(huán)上的C-C伸縮振動(dòng)。位于1 146 cm-1處的拉曼位移是C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)和C-C伸縮振動(dòng)。位于1 258 cm-1處的拉曼位移是O-H彎曲振動(dòng)和苯環(huán)上的C-N伸縮振動(dòng)。位于1 351 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H彎曲振動(dòng)。位于1 442 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)。位于1 490 cm-1處的拉曼位移是O-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)和苯環(huán)上的C-C伸縮振動(dòng)和苯環(huán)上的C-N伸縮振動(dòng)。位于1 623 cm-1處的拉曼位移是苯環(huán)上的C-C伸縮振動(dòng)和苯環(huán)上的C-N伸縮振動(dòng)。位于2 937 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H的對(duì)稱伸縮振動(dòng)。位于2 982 cm-1處的拉曼位移是CH3上的C-H非對(duì)稱性伸縮。位于3 156 cm-1處的拉曼位移是C-H的伸縮振動(dòng)。從理論光譜與實(shí)驗(yàn)光譜之間的位移對(duì)比，可以看到實(shí)驗(yàn)光譜和理論光譜之間的偏移量和偏移率都較小，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.2 表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1 銀溶膠體積的優(yōu)化

加入硝酸銀和鹽酸羥胺按照不同體積比配制銀溶膠增強(qiáng)基底后，噁霉靈的表面增強(qiáng)拉曼光譜見圖4。噁霉靈的表面增強(qiáng)拉曼光譜與固體拉曼光譜特征峰略有偏移。例如，600 cm-1處固體特征峰藍(lán)移到607 cm-1處，1 623 cm-1、2 937 cm-1處固體特征峰紅移到1 611 cm-1、2 928 cm-1。

選取特征峰最高的2個(gè)特征峰607 cm-1、

2 928 cm-1，探究特征峰峰強(qiáng)與不同體積比配制的銀溶膠關(guān)系。由圖5可知，隨著硝酸銀與鹽酸羥胺體積比的增大，兩個(gè)特征峰（607 cm-1、2 928 cm-1）的峰強(qiáng)在5∶1的體積比時(shí)峰強(qiáng)最大，因此按照5∶1體積比配制銀溶膠，對(duì)噁霉靈的表面增強(qiáng)效果最好。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將一直保持此體積比配制銀溶膠。

2.2.2 銀溶膠加入量的優(yōu)化

圖6是保持噁霉靈農(nóng)藥10 ?L不變，銀溶膠加入量的不同對(duì)噁霉靈的表面增強(qiáng)效果也不同。

選取峰強(qiáng)最大的兩個(gè)特征峰（600 cm-1、2 924 cm-1），探究特征峰峰強(qiáng)與銀溶膠不同加入量的關(guān)系。由圖7可知，銀溶膠加入量由2.5 ?L增加到12.5 ?L的過程中，特征峰峰強(qiáng)先增加后減小，在7.5 ?L時(shí)特征峰峰強(qiáng)最大，因此加入7.5 ?L的銀溶膠增強(qiáng)基底，在保持10 μL噁霉靈農(nóng)藥體積不變的情況下，噁霉靈的表面增強(qiáng)效果最好。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)

圖8是保持上述最優(yōu)條件，檢測(cè)不同濃度的噁霉靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖。由圖8可知，在噁霉靈標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10-1 mol·L-1、

10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1濃度時(shí)，噁霉靈的各個(gè)特征峰較為清晰可見，在10-4 mol·L-1時(shí)，604 cm-1、1 628 cm-1、2 941 cm-1處有微弱的特征峰，直到10-5 mol·L-1時(shí)，只剩下1 035 cm-1處的特征峰，由于至少需要兩個(gè)特征峰才能判斷這個(gè)物質(zhì)，因此噁霉靈的表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)限是10-4 mol·L-1。

圖9為在實(shí)際食品基質(zhì)西瓜中通過加標(biāo)噁霉靈，檢測(cè)噁霉靈的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖，在西瓜上清液中添加噁霉靈的濃度為10-1 mol·L-1、10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1和10-4 mol·L-1時(shí)，604 cm-1、1 628 cm-1、2 941 cm-1處的特征峰清晰可見。比固體拉曼特征峰600 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1向右發(fā)生極少的藍(lán)移，可能是西瓜中的成分略微影響了噁霉靈分子振動(dòng)，而加標(biāo)濃度為10-5 mol·L-1時(shí)已經(jīng)無法分辨出完整的特征峰峰形，由此得出噁霉靈加標(biāo)到西瓜中的檢測(cè)限為10-4 mol·L-1。

3 結(jié)論

食品中的農(nóng)藥殘留問題一直是影響蔬菜水果食品安全的重要因素，噁霉靈農(nóng)藥是一種廣泛應(yīng)用在瓜果中的殺菌劑，目前關(guān)于噁霉靈農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要是液相色譜、氣相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，本文首次使用基于表面增強(qiáng)拉曼光譜計(jì)算，通過密度泛函理論計(jì)算與固體標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，得到噁霉靈分子的拉曼特征峰和峰位歸屬，優(yōu)化表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)條件，獲得不同濃度梯度噁霉靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜，在實(shí)際食品基質(zhì)西瓜中加標(biāo)噁霉靈，得到檢測(cè)限為10-4 mol·L-1，該方法檢測(cè)限低，無需復(fù)雜的前處理，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，為監(jiān)管部門提供有效依據(jù)。

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