固態(tài)納豆調(diào)味品的制備及其揮發(fā)性物質(zhì)分析

孫娜 王林林 朱秀娟 何九軍 王華

摘要：選取低溫核桃粕和黃豆為主要原料，利用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)納豆調(diào)味品制備工藝，并利用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對(duì)固態(tài)納豆調(diào)味品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，以50 g納豆為基料，最優(yōu)制備工藝為辣椒粉添加量8.5%、食鹽添加量3.1%、花椒粉添加量2.4%、茴香粉添加量0.2%、丁香粉添加量0.1%、八角粉添加量0.1%，優(yōu)化后的固態(tài)納豆調(diào)味品色澤紅亮、椒麻鮮香、氨味低，綜合評(píng)分高達(dá)90.2。固態(tài)納豆調(diào)味品中共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)111種，相對(duì)含量較高的為烴類（33.73%）、雜環(huán)類化合物（32.54%）和醇類（8.21%）。

關(guān)鍵詞：低溫核桃粕；固態(tài)納豆調(diào)味品；制備工藝；納豆激酶；揮發(fā)性物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS214.9????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）08-0143-07

Preparation of Solid-State Natto Condiment and Analysis of Its Volatile Substances

SUN Na， WANG Lin-lin， ZHU Xiu-juan， HE Jiu-jun， WANG Hua

（Technique College of Agriculture and Forestry， Longnan Teachers College， Longnan 742500， China）

Abstract： The low-temperature walnut meal and soybean are selected as the main raw materials， the preparation process of solid-state natto condiment is optimized by single factor test and Box-Behnken test， and the volatile flavor substances of solid-state natto condiment are analyzed by headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS）. The results show that using 50 g natto as the basic material， the optimum preparation process is chili powder 8.5%， salt 3.1%， Zanthoxylum bungeanum powder 2.4%， fennel powder 0.2%， clove powder 0.1%， star anise powder 0.1%.The optimized solid-state natto condiment has bright red color， spicy and delicious taste， low ammonia odour， and the comprehensive evaluation score reaches 90.2. A total of 111 volatile flavor substances are detected in solid-state natto condiment， among which， the relative content of hydrocarbons （33.73%）， heterocyclic compounds （32.54%） and alcohols （8.21%） is higher.

Key words： low-temperature walnut meal; solid-state natto condiment; preparation process; nattokinase; volatile

substances

收稿日期：2023-02-11

基金項(xiàng)目：甘肅省青年科技基金項(xiàng)目（21JR7RK914）；隴南市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022-S·JH-17）；隴南師范高等專科學(xué)校校級(jí)教學(xué)改革項(xiàng)目（JXGG2021014）

作者簡(jiǎn)介：孫娜（1988－），女，甘肅慶陽(yáng)人，講師，碩士，研究方向：發(fā)酵食品加工與開(kāi)發(fā)。

納豆（natto）通常以黃豆為原料，經(jīng)納豆菌發(fā)酵而成，成熟的納豆色澤金黃，氣味獨(dú)特，表面會(huì)形成一種白色透明的納豆菌膜，攪拌后挑起會(huì)有長(zhǎng)長(zhǎng)的拉絲[1]。納豆是一種微生態(tài)健康食品，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有預(yù)防高血壓、降低膽固醇、改善血液循環(huán)等功效[2]。1987年，Sumi等[3]首次從納豆中提取到納豆激酶，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其屬于絲氨酸蛋白酶，具有顯著的溶栓活性。但納豆的特殊風(fēng)味很難被中國(guó)消費(fèi)者接受，在一定程度上阻礙了納豆在中國(guó)市場(chǎng)上的推廣，故進(jìn)行納豆制品風(fēng)味的改良是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

胡桃（Juglans regia L.）是胡桃科、胡桃屬植物，俗稱核桃，是一種藥食兼?zhèn)涞膬?yōu)良經(jīng)濟(jì)作物[4-6]。隨著核桃油市場(chǎng)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，除直接食用外，核桃多被加工成核桃油。低溫核桃粕是液壓冷榨工藝生產(chǎn)核桃油過(guò)程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量高達(dá)43%[7-9]，可為固態(tài)納豆調(diào)味品發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)的蛋白資源。由于核桃粕中殘余的油脂較高，開(kāi)發(fā)難度較大，多數(shù)被用作飼料或直接丟棄，造成了資源的極大浪費(fèi)[10-11]。目前關(guān)于固態(tài)納豆調(diào)味品制備工藝的研究還鮮有報(bào)道，因此本研究利用低溫核桃粕發(fā)酵制備固態(tài)納豆調(diào)味品，不僅可以改善傳統(tǒng)納豆固有的不良風(fēng)味，而且可為核桃粕和黃豆提供新的利用途徑，同時(shí)豐富了固態(tài)調(diào)味料的種類，以期提高中國(guó)消費(fèi)者對(duì)納豆的接受度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫核桃粕：由成縣九源農(nóng)林產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司提供；枯草芽孢桿菌：由隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；尿激酶、凝血酶、纖維蛋白原等試劑：購(gòu)自黑龍江迪龍制藥有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS） 美國(guó)安捷倫科技有限公司；UV1810S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 陜西恒盛儀器設(shè)備有限公司；LS-35L立式壓力蒸汽滅菌器 山東創(chuàng)美機(jī)械科技有限公司；LRHS-250-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱、SW-系列超凈工作臺(tái) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥烘箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-216WDPX海爾電冰箱 海爾智家股份有限公司；MJ-CF07X7-101全自動(dòng)食品真空封口機(jī) 美的電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：選取適量無(wú)損傷、無(wú)蟲(chóng)害、顆粒飽滿、色澤鮮亮的黃豆，加水至料液比為1∶1（體積和質(zhì)量比）浸泡過(guò)夜；由于塊狀和片狀的核桃粕不利于納豆發(fā)酵，將核桃粕粉碎后，過(guò)100目篩，保證粉末細(xì)膩無(wú)雜塊，顆粒均勻，裝瓶備用。

蒸煮：取適量浸泡好的黃豆與粉碎好的核桃粕粉末，分別裝至錐形瓶中，加棉塞，于121 ℃蒸煮30 min。

接種：當(dāng)處理好的核桃粕和黃豆降至一定溫度時(shí)，按黃豆和核桃粕粉末混合物料的1%，接入枯草芽孢桿菌菌液，使菌液充分與混合物料接觸。

發(fā)酵：將接種好的混合物料取出轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于40 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h。

后熟：將混合物料取出，置于4 ℃冰箱中后熟18 h。

攪拌：后熟結(jié)束后將混合物料取出，置于盆中，按比例加入辣椒粉、食鹽、花椒粉等調(diào)味料，攪拌均勻。

捏胚：用手將混合物料捏成大小統(tǒng)一的球形胚子。

干燥：將球形胚子放置于40～50 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中，烘至水分含量達(dá)到30%為止。

真空包裝、成品：用真空包裝機(jī)封口保存。

1.3.3 固態(tài)納豆調(diào)味品的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在基礎(chǔ)配方不變的條件下，以固態(tài)納豆調(diào)味品綜合評(píng)分為指標(biāo)，選取對(duì)固態(tài)納豆調(diào)味品綜合評(píng)分影響顯著的3個(gè)主要因素：辣椒粉添加量（6%、7%、8%、9%、10%）、食鹽添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、花椒粉添加量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%），進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 固態(tài)納豆調(diào)味品的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取影響固態(tài)納豆調(diào)味品綜合評(píng)分的主要影響因素辣椒粉添加量（A）、食鹽添加量（B）和花椒粉添加量（C）為試驗(yàn)因素，以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.4 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)

本試驗(yàn)以納豆激酶活力和感官評(píng)分的加權(quán)分值為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，納豆激酶活力與感官評(píng)分各占50%[12]，在此基礎(chǔ)上對(duì)固態(tài)納豆調(diào)味品制作工藝進(jìn)行優(yōu)化。綜合評(píng)分的具體計(jì)算公式如下：

綜合評(píng)分=0.5×（納豆激酶活力/納豆激酶活力最大值×100+感官評(píng)分）。

1.4.1 感官評(píng)價(jià)

選擇10名食品專業(yè)人員，從固態(tài)納豆調(diào)味品的組織狀態(tài)、氣味、色澤及口感4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)分[13]，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.4.2 納豆激酶活力測(cè)定

參照付文靜等[14]改良的分光光度法測(cè)定納豆激酶活力。

1.5 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

參照黃燕等[15]的方法，略作修改。

稱取研碎均勻的固態(tài)納豆調(diào)味品樣品3.00 g，置于15 mL固相微萃取儀采樣瓶中，加入1 g NaCl和6 mL超純水，加入攪拌磁子，快速密封。將SPME萃取纖維頭在GC-MS進(jìn)樣口于250 ℃老化至無(wú)雜峰，將樣品瓶置于固相微萃取裝置上，設(shè)定溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為500 r/min，將樣品預(yù)熱15 min，于250 ℃解吸3 min，進(jìn)行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱為HP-5MS（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；色譜柱起始溫度為40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升至150 ℃，以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持5 min；氣化室溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；載氣He；載氣流量1 mL/min；不分流。

質(zhì)譜條件：EI源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為Scan；掃描質(zhì)量范圍為10～500 u。

2 結(jié)果分析

2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)尿激酶溶液（2 000，1 000，500，250，125 U/mL），在37 ℃下與纖維蛋白作用1 h后，于655 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，以尿激酶活力對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以ΔOD655 nm/h為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，其線性回歸方程為y=0.010 7x－0.014 6，R2=0.996 1，見(jiàn)圖1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 辣椒粉添加量對(duì)納豆激酶活力及品質(zhì)的影響

由圖2可知，固態(tài)納豆調(diào)味品的綜合評(píng)分和感官評(píng)分均呈先上升后下降的趨勢(shì)，而納豆激酶活力則呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槔苯贩厶砑恿繉?duì)固態(tài)納豆調(diào)味品的組織狀態(tài)、氣味、色澤和口感影響較大。當(dāng)辣椒粉添加量過(guò)多時(shí)，辣味偏重，固態(tài)納豆調(diào)味品的固有風(fēng)味被完全遮蓋，導(dǎo)致感官評(píng)分下降；當(dāng)辣椒粉添加量過(guò)少時(shí)，辣味不明顯，不能與固態(tài)納豆調(diào)味品的其他成分較好協(xié)調(diào)，導(dǎo)致固態(tài)納豆調(diào)味品色澤暗淡，氨味明顯[15]。此外，因固態(tài)納豆調(diào)味品中納豆基量不變，隨著辣椒粉添加量的不斷增加，納豆激酶活力會(huì)逐漸下降。綜合考慮，辣椒粉添加量為8%時(shí)，綜合評(píng)分最高。

2.2.2 食鹽添加量對(duì)納豆激酶活力及品質(zhì)的影響

由圖3可知，固態(tài)納豆調(diào)味品綜合評(píng)分和感官評(píng)分均呈先上升后下降的趨勢(shì)，而納豆激酶活力則呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)食鹽添加量小于3%時(shí)，固態(tài)納豆調(diào)味品的咸度不夠，不能較好地與其他成分協(xié)調(diào)，導(dǎo)致固態(tài)納豆調(diào)味品的滋味不足，感官評(píng)分下降；當(dāng)食鹽添加量大于3%時(shí)，固態(tài)納豆調(diào)味品滋味太咸，影響口感。此外，一定濃度的食鹽對(duì)微生物和酶活力都有較強(qiáng)的抑制作用[16]。綜合考慮，食鹽添加量為3%時(shí)，綜合評(píng)分最高。

2.2.3 花椒粉添加量對(duì)納豆激酶活力及品質(zhì)的影響

由圖4可知，固態(tài)納豆調(diào)味品的綜合評(píng)分和感官評(píng)分均呈先上升后下降的趨勢(shì)，納豆激酶活力呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榛ń贩厶砑恿吭谝欢ǚ秶鷥?nèi)，能夠提升固態(tài)納豆調(diào)味品的風(fēng)味，但超過(guò)一定添加量，會(huì)帶有些許苦味，反而使固態(tài)納豆調(diào)味品的感官品質(zhì)下降。綜合考慮，花椒粉添加量為2.5%時(shí)，綜合評(píng)分最高。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固態(tài)納豆調(diào)味品制作工藝的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

以辣椒粉添加量（A）、食鹽添加量（B）和花椒粉添加量（C）為自變量，以綜合評(píng)分（Y）為因變量，得到二次多元回歸方程：Y=94.54－4.85A－1.25B－1.60C+2.05AB－2.50AC-6.75BC－12.07A2－6.62B2－7.87C2。

由表4可知，模型達(dá)到極顯著水平（P<0.01），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。方程一次項(xiàng)（A、B、C）、二次項(xiàng)（A2、B2、C2）和交互項(xiàng)（AB、AC、BC）對(duì)綜合評(píng)分的影響顯著（P<0.05），其決定系數(shù)R2=0.991 1，與校正系數(shù)RAdj2=0.979 8相近，表明試驗(yàn)誤差小，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值有較好的擬合度，可用于固態(tài)納豆調(diào)味品制作工藝優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)。

對(duì)辣椒粉添加量（A）、食鹽添加量（B）和花椒粉添加量（C）兩兩交互作用進(jìn)行分析，其響應(yīng)曲面和等高線見(jiàn)圖5。響應(yīng)曲面越陡峭，說(shuō)明影響越顯著；曲面越平坦，說(shuō)明影響越小[17]。

由圖5可知，辣椒粉添加量（A）對(duì)綜合評(píng)分的影響最大，花椒粉添加量（C）次之，食鹽添加量（B）的影響最小。等高線圖可直觀反映兩因素之間交互作用的顯著程度。等高線呈橢圓形，說(shuō)明交互作用顯著；等高線呈圓形，說(shuō)明交互作用不顯著[18]。由等高線圖可知，辣椒粉添加量和食鹽添加量（AB）、辣椒粉添加量和花椒粉添加量（AC）、食鹽添加量和花椒粉添加量（BC）等高線均呈橢圓形，交互作用顯著，這與表4方差分析的結(jié)果一致。

通過(guò)Design Expert 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各因素對(duì)固態(tài)納豆調(diào)味品制備工藝的影響順序?yàn)槔苯贩厶砑恿?花椒粉添加量>食鹽添加量。預(yù)測(cè)固態(tài)納豆調(diào)味品制備工藝為辣椒粉添加量8.5%、食鹽添加量3.1%、花椒粉添加量2.4%，在此優(yōu)化條件下，固態(tài)納豆調(diào)味品綜合評(píng)分的理論值為89.2。通過(guò)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得綜合評(píng)分為90.2，與預(yù)測(cè)值接近，表明采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的固態(tài)納豆調(diào)味品制備工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

2.4 固態(tài)納豆調(diào)味品揮發(fā)性物質(zhì)分析

由表5可知，固態(tài)納豆調(diào)味品通過(guò)HS-SPME-GC-MS技術(shù)共檢索鑒定出111種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烴類41種，占總含量的33.73%；醇類17種，占總含量的8.21%；醛類5種，占總含量的2.42%；酮類7種，占總含量的3.24%；酸類5種，占總含量的5.82%；酯類9種，占總含量的1.11%；雜環(huán)類化合物18種，占總含量的32.54%；酚類4種，占總含量的2.19%；其他化合物5種，占總含量的1.51%。在測(cè)得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，烴類物質(zhì)含量最高，這可能與加入的辣椒、花椒、茴香和丁香等香辛料有關(guān)。烴類物質(zhì)中角鯊烯相對(duì)含量高達(dá)15.55%，這可能與選用的核桃粕、黃豆等原材料有關(guān)，核桃粕和黃豆中均含有豐富的角鯊烯成分，角鯊烯具有令人愉悅的特殊香氣，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功效。雜環(huán)類化合物的含量次高，其中吡嗪類化合物含量最高，2，5-二甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪的相對(duì)含量分別為27.51%和2.47%。吡嗪類化合物是納豆香味物質(zhì)的主要成分，具有使血液不易凝固的作用[19]。醇類物質(zhì)含量也相對(duì)較高，固態(tài)納豆調(diào)味品中檢測(cè)到的大多數(shù)醇類都具有特征性的氣味，這可能與添加的外源物質(zhì)香辛料有關(guān)，亦或是糖類物質(zhì)在耐鹽酵母作用下生成的[19]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用低溫核桃粕和黃豆為主要材料，輔以辣椒粉、食鹽、花椒粉等調(diào)味料，以感官評(píng)分和納豆激酶活力為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)改良了固態(tài)納豆調(diào)味品的制作工藝及風(fēng)味。結(jié)果表明，以50 g納豆為基料，最優(yōu)制作工藝為辣椒粉添加量8.5%、食鹽添加量3.1%、花椒粉添加量2.4%、茴香粉添加量0.2%、丁香添加量0.1%、八角添加量0.1%。在此條件下，固態(tài)納豆調(diào)味品綜合評(píng)分高達(dá)90.2，固態(tài)納豆調(diào)味品實(shí)際測(cè)得綜合評(píng)分與模型預(yù)測(cè)值相近，可用于實(shí)際操作。所得產(chǎn)品色澤紅亮，辣味鮮香悠長(zhǎng)，椒麻香氣中帶有淡淡的核桃味，味道有麻與辣、鮮與香的層次感，口感、風(fēng)味更符合中國(guó)消費(fèi)者的需求。

通過(guò)頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)固態(tài)納豆調(diào)味品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)111種，相對(duì)含量較高的為烴類物質(zhì)（33.73%）、雜環(huán)類化合物（32.54%）和醇類物質(zhì)（8.21%），這3類物質(zhì)對(duì)固態(tài)納豆調(diào)味品的香氣具有重要貢獻(xiàn)。選用核桃粕和黃豆混合發(fā)酵生產(chǎn)固態(tài)納豆調(diào)味品，不僅可以使核桃粕得到高值化利用，而且可以改善傳統(tǒng)固態(tài)納豆調(diào)味品固有的不良風(fēng)味，加快納豆食品在中國(guó)市場(chǎng)的推廣，市場(chǎng)前景廣闊。

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