傳統(tǒng)農(nóng)家醬產(chǎn)蛋白酶菌株的分離及其在豆?jié){的應(yīng)用

鮑 捷 ，任曉蕾 ，郭寶松 ，梁會(huì)朋 ，林心萍 ，張素芳

（1. 大連工業(yè)大學(xué)國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，大連 116034；2. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，大連 116034）

0 引 言

大豆是中國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物，其中2020 年遼寧地區(qū)大豆產(chǎn)量可達(dá)3 008.1 kg/hm2[1]。大豆中富含的大豆蛋白不僅可以作為添加劑改善食品起泡性[2]、乳化性[3]等功能特性，還因其氨基酸組成與牛奶相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均較豐富，可作為動(dòng)物蛋白的良好替代品[4]。與動(dòng)物蛋白相比，大豆蛋白的吸收利用率較低，需經(jīng)過(guò)水解成大豆多肽或氨基酸，才能提高其消化吸收效率[5]。此外，經(jīng)過(guò)水解的大豆蛋白溶解性、穩(wěn)定性等功能特性也明顯提高[6]。目前常用的大豆蛋白水解方法有酸法水解、堿法水解和酶法水解，其中酸堿水解法會(huì)對(duì)絲氨酸等氨基酸造成破壞，營(yíng)養(yǎng)成分損失大[7]，還會(huì)伴隨不良副反應(yīng)，不適用于食品加工。因此，常選用酶法水解獲取大豆多肽或氨基酸[8]，該方法廣泛應(yīng)用于食品[9]、工業(yè)[10]等領(lǐng)域。

研究表明，商業(yè)蛋白酶對(duì)底物的要求較高且生物利用度低，水解后的大豆蛋白含有苦味，商業(yè)蛋白酶并不完全適用于大豆蛋白的水解和加工[11]，從大豆發(fā)酵產(chǎn)品篩選產(chǎn)蛋白酶微生物進(jìn)行酶法發(fā)酵可有效解決這一問(wèn)題。傳統(tǒng)農(nóng)家醬是以大豆為主要原料的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，距今已有2000 余年歷史，隨著自然馴化，其中菌株天然適合大豆食品的加工，其經(jīng)由炒制、制磚、發(fā)酵、下醬等多個(gè)流程制得，具有濃郁豆香和獨(dú)特風(fēng)味[12]。且因傳統(tǒng)農(nóng)家醬常以家庭為單位進(jìn)行釀造，所以根據(jù)發(fā)酵環(huán)境的不同，微生物種類(lèi)豐富，包括曲霉屬（Aspergillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等[13]。從傳統(tǒng)農(nóng)家醬中篩選具有蛋白酶活性的菌株，對(duì)大豆蛋白適應(yīng)性更強(qiáng)，可提高大豆蛋白的水解效率，增強(qiáng)人體對(duì)大豆蛋白的消化吸收，具有很高的利用價(jià)值和良好的挖掘潛力。

本文從東北傳統(tǒng)農(nóng)家醬中篩選、分離出8 株產(chǎn)蛋白酶菌株，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株分類(lèi)鑒定及抗生素敏感性、溶血性和吲哚試驗(yàn)等安全性評(píng)價(jià)，并將8 株產(chǎn)蛋白酶菌株應(yīng)用于豆?jié){處理。分析了菌株發(fā)酵處理前后的豆?jié){中可溶性肽、氨基態(tài)氮、水解度3 項(xiàng)指標(biāo)的變化，探討了8 株產(chǎn)蛋白酶菌株對(duì)豆?jié){中大豆蛋白的水解效果。以期為大豆保健功能食品的開(kāi)發(fā)提供潛在應(yīng)用菌株及理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材 料

東北傳統(tǒng)農(nóng)家醬，購(gòu)自遼寧省撫順市；大豆，購(gòu)自北大荒旗艦店。

1.1.2 試 劑

LB 培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、脫纖維羊血、蛋白胨水，購(gòu)自高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)（青島）有限公司；引物27F、1492R，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Genview 瓊脂糖，購(gòu)自Genview Scientific Inc.；茚三酮（化學(xué)純），購(gòu)自大茂（天津）化學(xué)試劑廠；C8H5KO4、CuSO4、K2SO4、H2SO4、Na2CO3、NaOH、酚酞、甲醛溶液；福林酚試劑、酪蛋白等，購(gòu)自索萊寶科技（北京）有限公司。大豆分離蛋白，購(gòu)自源葉生物（上海）科技有限公司。藥敏紙片，購(gòu)自比克曼（湖南）生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基：培養(yǎng)基組分A：瓊脂40.0，121 ℃滅菌15 min，趁熱加入至平皿（約至平皿高度的1/8），冷卻至室溫后放置牛津杯（內(nèi)徑：6 mm，外徑：8 mm，高：10 mm）；培養(yǎng)基組分B：NaCl 20.0，胰蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，瓊脂40.0（固體培養(yǎng)基），pH 值為(7.0±0.1)，121 ℃滅菌15 min；培養(yǎng)基組分C：大豆分離蛋白 30.0，90℃滅菌5 min。培養(yǎng)基組分B、C 混合后冷卻至50℃左右，倒入放置好牛津杯的瓊脂平皿中，完全凝固后取出牛津杯；

溶血性驗(yàn)證培養(yǎng)基：參照哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配置；

稀福林試劑：福林酚試劑10 mL、去離子水定容至20 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

光學(xué)顯微鏡，德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)；PCR 儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀，以色列DNR 公司；全自動(dòng)凱氏定氮儀，歐萊博科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的篩選和分離純化

稱取豆醬樣品1 g，用5 mL 無(wú)菌水重懸，將懸液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?0-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度液體各100 μL，均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，選擇菌落數(shù)小于300 的平板，挑取不同形態(tài)的單菌落，于LB 固體培養(yǎng)基劃線分離純化3 代，直至獲得純培養(yǎng)。挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6。取1.5 mL 菌液12 000 r/min 離心3 min，取上清10 μL 滴加于產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基加樣孔內(nèi)，置于37 ℃靜置培養(yǎng)，每4 h 觀察一次，挑取透明水解圈直徑最大的8 株菌，保藏備后續(xù)分析。

1.3.2 蛋白酶粗酶活的測(cè)定

將上述8 株菌培養(yǎng)至OD600=0.6，12 000 r/min 離心3 min，取上清參考國(guó)標(biāo)SB/T 10 317-1999 中的福林法，測(cè)定菌株發(fā)酵上清液的堿性蛋白酶酶活[14]，蛋白酶活力單位規(guī)定為：以酪蛋白為底物，每分鐘催化生成1 μg 酪氨酸的酶量為一個(gè)活力單位（U）。公式如下：

式中X為樣品的酶活力，U/mL；A為樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；K為吸光常數(shù)（K=97.59，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值）；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 菌株鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)篩選到的8 株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和光學(xué)顯微鏡觀察，記錄菌落大小、形狀、質(zhì)地、邊緣、光澤和顏色等形態(tài)特征，并采集顯微圖像。

2）分子生物學(xué)鑒定

菌株基因組提取方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行 [15] 。16S rDNA PCR 擴(kuò)增采用通用引物27F 和1492R[16]。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（20 μM）各1 μL，基因組模板（50 ng/μL）1 μL，滅菌水23 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

取4 μL 的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶清晰符合預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn。基于比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分離菌株分類(lèi)鑒定。

1.3.4 菌株安全性試驗(yàn)

1）抗生素敏感性試驗(yàn)

使用K-B 紙片法對(duì)芽孢桿菌的抗生素敏感性譜進(jìn)行了表征[17]。凍存菌株用LB 固體培養(yǎng)基活化兩代后，挑單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600=（0.6±0.1），取100 μL 菌液均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，液體吸收完全后將抗生素藥敏紙片貼于平板上，保持紙片間的距離不小于24 mm。靜置培養(yǎng)12 h 后測(cè)量并統(tǒng)計(jì)抑菌圈直徑，分析其是否耐藥。評(píng)價(jià)等級(jí)：耐藥R（≤5 mm），中度敏感MS（＜5～＜11 mm）或敏感S（≥11 mm），每組試驗(yàn)3 個(gè)平行。

2）溶血性試驗(yàn)

為評(píng)價(jià)8 株菌的安全性，進(jìn)行溶血性試驗(yàn)[18]。溶血素可以將紅細(xì)胞破裂溶解，形成溶血環(huán)，許多細(xì)菌的致病性都與溶血特性相關(guān)。溶血性分為α溶血、β溶血與γ溶血，前兩者表現(xiàn)為有草綠色溶血環(huán)和完全透明溶血環(huán)，γ溶血無(wú)溶血環(huán)即不溶血。篩選出的8 株菌株在LB固體培養(yǎng)基上活化一代，挑單菌落劃線于溶血性驗(yàn)證培養(yǎng)基中，在37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，觀察是否溶血，以金黃色葡萄球菌ATCC 25 923 作為陽(yáng)性對(duì)照。

3）吲哚試驗(yàn)

大豆中富含色氨酸，產(chǎn)色氨酸酶的微生物能夠分解其中色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚的產(chǎn)生通常伴隨不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生，影響食品風(fēng)味[19]。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)8 株菌的安全性，進(jìn)行了吲哚試驗(yàn)分析[20]。篩選出的8 株菌株LB 固體培養(yǎng)基上活化一代后，挑單菌落接種蛋白胨水生化反應(yīng)管，置37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，加入Kovacs 氏靛基質(zhì)試劑8～10 滴，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照試驗(yàn)。觀察試驗(yàn)結(jié)果，如有吲哚存在，呈現(xiàn)玫瑰紅色，判定為陽(yáng)性反應(yīng)；滴加試劑后不變色為陰性反應(yīng)。

1.3.5 產(chǎn)蛋白酶菌株在豆?jié){中的應(yīng)用

1）豆?jié){制作

取200 g 已浸泡10 h 的大豆，加水至1000 mL，豆?jié){機(jī)研磨破碎后，采用0.3 mm 篩過(guò)濾豆?jié){于100 mL 錐形瓶（每瓶裝50 mL 豆?jié){）中，121 ℃滅菌15 min。接種篩選獲得的產(chǎn)蛋白酶菌株，接種前活化兩代，調(diào)節(jié)菌液濃度至OD600值為0.6，1%接種量接種于豆?jié){，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)18 h。

2）可溶性肽

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制選用酪蛋白。取1 mL 發(fā)酵豆?jié){，按照J(rèn)ITPAKDEE 的方法[21]進(jìn)行三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）可溶性肽測(cè)定。

3）氨基態(tài)氮與水解度

參考徐鑫等[22]的方法測(cè)定發(fā)酵豆?jié){的氨基態(tài)氮。取發(fā)酵豆?jié){，以去離子水做空白對(duì)照，利用甲醛滴定法，記錄使用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mol/L）的毫升數(shù)。并帶入公式：

式中V為樣品滴定消耗氫氧化鈉體積，mL；V0為空白樣品消耗氫氧化鈉體積，mL；N為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L。

按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：GB 5 009.5-2016》凱氏定氮法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，參考吳成[23]的方法進(jìn)行水解度的測(cè)定。其中，W0=0.178，以未處理豆?jié){氨基氮含量計(jì)，W1以產(chǎn)蛋白酶菌株處理豆?jié){氨基氮含量計(jì)，W2為豆?jié){凱氏定氮得到，結(jié)果為2.01 g/100 mL。公式如下：

式中W0為未發(fā)酵豆?jié){中游離氨基酸的濃度，g/100 mL；W1為發(fā)酵豆?jié){中酶解出的游離氨基酸的濃度，g/100 mL；W2為底物濃度，g/mL。4） 感官評(píng)定

感官評(píng)定分為5 個(gè)維度，4 個(gè)等級(jí)，使用的描述詞匯及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。招募34 名食品專(zhuān)業(yè)研究生（11 名男生、23 名女生）組成感官評(píng)定小組。測(cè)試樣品被盛裝于透明一次性杯中，杯上無(wú)樣品名稱，僅有數(shù)字編號(hào)，品評(píng)順序隨機(jī)。評(píng)分時(shí)去掉最高分與最低分后取算數(shù)平均值。

表1 發(fā)酵豆?jié){感官評(píng)定描述及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Description and scoring criteria for sensory evaluation of fermented soymilk

2 結(jié)果與分析

2.1 豆醬中產(chǎn)蛋白酶菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌落的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

以東北傳統(tǒng)農(nóng)家醬為原材料，通過(guò)蛋白酶活性篩選平板分離出24 株具有蛋白酶活性的菌株，取含蛋白酶的發(fā)酵上清滴加于產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基。編號(hào)后用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（法國(guó)）進(jìn)行水解圈直徑測(cè)量，結(jié)果如圖1 所示，菌株BJ-2 水解圈最大，直徑為28.7 mm。

圖1 傳統(tǒng)農(nóng)家醬中菌株水解大豆分離蛋白水解圈Fig.1 Hydrolysis ring of strains in traditional farmhouse sauce to hydrolyze soy protein isolate

選擇其中水解圈直徑最大的8 株菌，進(jìn)行了菌落形態(tài)觀察和顯微鏡檢，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察可知，8 株菌均呈乳白色，均不透明；6 株表面光滑且緣整齊，2 株表面粗糙且邊緣模糊；通過(guò)鏡檢可知，8 株菌均為短桿菌，且大多單個(gè)存在，具體的菌落形態(tài)學(xué)描述詳見(jiàn)表2。

表2 傳統(tǒng)農(nóng)家醬中菌株形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphological characteristics of strains in traditional soybean paste

2.2 蛋白酶酶活的測(cè)定

從圖2 可以看到，菌株產(chǎn)蛋白酶酶活范圍為15.03～35.24 U/mL，其中菌株BJ-15 產(chǎn)量最高，菌株BJ-2 產(chǎn)量最低。菌株測(cè)量酶活時(shí)選取的是堿性蛋白酶的測(cè)定方法，蛋白酶根據(jù)活性部位、生理功能、水解條件等分類(lèi)條件的不同種類(lèi)極多，其中堿性蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解效果相比其他蛋白酶更好[24]，且?guī)缀跛挟a(chǎn)蛋白酶微生物都能產(chǎn)生堿性蛋白酶[25-26]，應(yīng)用也更廣。芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶可總結(jié)為兩類(lèi)[27]，一種為只含有堿性蛋白酶的Carlsberg 型堿性蛋白酶；另一種為同時(shí)含有堿性蛋白酶和中性蛋白酶的Novo 型堿性蛋白酶。兩者相較，Carlsberg 型堿性蛋白酶底物專(zhuān)一性更廣泛，且更加穩(wěn)定。此外，菌株在測(cè)量酶活時(shí)，應(yīng)國(guó)標(biāo)要求，選取的底物為酪蛋白，試驗(yàn)結(jié)果表明菌株對(duì)酪蛋白也有水解能力，未來(lái)可對(duì)菌株所產(chǎn)蛋白酶的底物種類(lèi)進(jìn)一步研究，或?qū)⑦@些菌株應(yīng)用于含酪蛋白的食品中。

圖2 傳統(tǒng)農(nóng)家醬中菌株蛋白酶酶活Fig.2 Protease enzyme activity of strains in traditional soybean paste

2.3 菌株的分子學(xué)鑒定

提取8 株產(chǎn)蛋白酶菌株的基因組為模板，利用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rDNA 片段擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，所有泳道均在1 500 bp 左右出現(xiàn)了一條清晰條帶。PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行Blastn分析。

測(cè)序結(jié)果如表3 所示，8 株菌從屬層面來(lái)看，均為芽孢桿菌屬；從種層面看，可分為6 種，分別為漳州芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌和特基拉芽胞桿菌?？莶菅挎邨U菌、漳州芽孢桿菌[28]廣泛應(yīng)用于產(chǎn)堿性蛋白酶研究；貝萊斯芽孢桿菌[29]、暹羅芽孢桿菌[30]、特基拉芽胞桿菌[31]已報(bào)道具有抑菌活性，常用于農(nóng)業(yè)或食品保鮮；另外甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌[32]還具有降解有害物質(zhì)、保護(hù)治理環(huán)境的作用。董丹等[33]從發(fā)酵初期豆瓣醬中篩選出39 株芽孢桿菌，其中5 株產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和Sonorensis芽孢桿菌，本文篩選菌株與已報(bào)道的食源性產(chǎn)蛋白酶菌株在屬水平較為一致。

表3 傳統(tǒng)農(nóng)家醬中產(chǎn)蛋白酶菌株16S rDNA 序列分析結(jié)果Table 3 Results of 16S rDNA sequence analysis of proteaseproducing strains in traditional soybean paste

2.4 安全性試驗(yàn)

2.4.1 抗生素敏感性試驗(yàn)

因?yàn)榭股氐臑E用，菌株耐藥性逐漸提高，為避免超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，抗生素敏感試驗(yàn)至關(guān)重要。前文篩選得到的8 株芽胞桿菌的抗生素敏感性如表4 所示。8 株芽孢桿菌對(duì)受試抗生素敏感性基本一致，表現(xiàn)為對(duì)慶大霉素、氨芐西林和青霉素中度敏感，對(duì)其他抗生素敏感。本實(shí)驗(yàn)菌株均有抗生素敏感性，說(shuō)明安全性均較高，可以用于后續(xù)研究。

表4 傳統(tǒng)農(nóng)家醬中產(chǎn)蛋白酶菌株耐藥性評(píng)價(jià)Table 4 Evaluation of drug resistance of protease-producing strains in traditional soybean paste

2.4.2 溶血性、吲哚試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，所分離的8 株菌在血平板上37 ℃培養(yǎng)18 h 時(shí)，均無(wú)溶血圈產(chǎn)生，說(shuō)明8 株菌均不產(chǎn)溶血素；8 株菌在蛋白胨水生理生化管37 ℃培養(yǎng)18 h，加入Kovacs 氏靛基質(zhì)試劑后，均無(wú)顏色變化，說(shuō)明8 株菌均不會(huì)分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。

2.5 產(chǎn)蛋白酶菌株在豆?jié){中的應(yīng)用

2.5.1 可溶性肽

從圖3 得知，用選取的8 株芽孢桿菌處理后的豆?jié){可溶性肽含量范圍在170.4～200.9 μg/mL 之間，相較于未發(fā)酵豆?jié){增加了16.4%～37.2%。在確定可溶肽增加的基礎(chǔ)上，后續(xù)可以針對(duì)肽段的長(zhǎng)度、種類(lèi)等進(jìn)行更深入的研究，或是通過(guò)與其他酶活性菌株混合發(fā)酵，進(jìn)一步改善發(fā)酵豆?jié){品質(zhì)。通過(guò)微生物分泌的各種酶，傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品中的蛋白質(zhì)被水解成小肽，除了能方便吸收外，還能給豆?jié){增添保健效果，賦予獨(dú)特風(fēng)味[34]。如一些菌株可以產(chǎn)生大豆血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，這種酶具有降壓潛力，在調(diào)節(jié)血壓方面具有重要作用[35]；一些菌株還可以產(chǎn)生抗氧化肽[36]，起到抗氧化效果。

圖3 產(chǎn)蛋白酶菌株處理后豆?jié){可溶性肽變化Fig.3 Changes of soluble peptides in soymilk after treatment by protease-producing strains

與蛋白酶酶活結(jié)合來(lái)看，部分菌株在篩選平板上水解圈大，蛋白酶活力高，但可溶性多肽含量較低，主要有兩點(diǎn)原因。第一，本文測(cè)定的蛋白酶酶活為堿性蛋白酶酶活，酶活測(cè)定緩沖液pH 值為10，但實(shí)際豆?jié){處理體系大約pH 值為6，兩者pH 值不一樣，所以蛋白酶酶活較高的菌株在pH 值為6 的豆?jié){中應(yīng)用時(shí)，酶活并不一定最好。第二，蛋白酶的底物譜廣，但與不同底物的親和力不同。測(cè)定蛋白水解圈時(shí)底物是市售大豆分離蛋白（主成分是β-伴球蛋白和球蛋白），測(cè)定堿性蛋白酶酶活時(shí)所用底物是市售酪蛋白，但在實(shí)際豆?jié){發(fā)酵體系中，用的是大豆總蛋白，包括球蛋白[37]、清蛋白[38]等。底物不同，即使是同種酶，也會(huì)表現(xiàn)出不同的酶活差異。

2.5.2 豆?jié){氨基態(tài)氮及水解度測(cè)定

芽孢桿菌發(fā)酵豆?jié){時(shí)，蛋白質(zhì)水解主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與豆?jié){pH 值的變化、風(fēng)味等有關(guān)。如圖4a 為不同產(chǎn)蛋白酶菌株處理后豆?jié){氨基態(tài)氮變化，圖4b 為不同產(chǎn)蛋白酶菌株處理后豆?jié){水解度變化，蛋白酶處理后，豆?jié){的氨基態(tài)氮和水解度顯著增加，效果最好的為菌株BJ-6 處理豆?jié){，氨基態(tài)氮上升了10.87%，水解度為23.49%。本節(jié)數(shù)據(jù)趨勢(shì)同樣與水解圈大小及蛋白酶活力不一致，原因與2.5.1 相似，且現(xiàn)有許多文獻(xiàn)的結(jié)果也有類(lèi)似結(jié)果。王朋朋[39]篩選得到6 株產(chǎn)蛋白酶的曲霉，其中菌株A6、A8、A15、B3 的蛋白酶酶活分別為1 572.54、1 324.46、1 456.24、1 378.89 U/g，但氨基態(tài)氮含量分別為23.57、20.38、20.17、21.57 mg/g，可以看到其結(jié)論與本文類(lèi)似，蛋白酶酶活與氨基態(tài)氮含量也無(wú)相關(guān)性。鄧維琴等[40]從豆瓣醬中篩選出17 株曲霉，其中菌株P(guān)CSM002 的蛋白酶酶活大于菌株P(guān)CSM001，但在實(shí)際應(yīng)用中，PCSM001 發(fā)酵豆瓣醬的氨基態(tài)氮含量高于PCSM002 發(fā)酵豆瓣醬。

圖4 產(chǎn)蛋白酶菌株處理后豆?jié){氨基態(tài)氮、水解度變化Fig.4 Changes of amino peptide nitrogen and protein hydrolysis degree of soymilk after treatment by protease-producing strains

蛋白水解度除與菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶活有關(guān)外，還與菌株在豆?jié){中的生長(zhǎng)速度、微生物產(chǎn)酶種類(lèi)、豆?jié){的品質(zhì)等有關(guān)[41]。例如：微生物發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶，將蛋白水解為小肽和氨基酸的同時(shí)，微生物也會(huì)利用小肽和氨基酸進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，消耗水解產(chǎn)物；又或是微生物除產(chǎn)蛋白酶外，同時(shí)產(chǎn)生轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶等酶系，將氨基酸轉(zhuǎn)化為胺類(lèi)化合物；而豆?jié){的品質(zhì)則會(huì)影響豆?jié){中的蛋白含量，從而影響水解度。在發(fā)酵豆制品中，水解度是監(jiān)測(cè)蛋白水解的重要參數(shù)，能夠反映蛋白質(zhì)的變化情況、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特征。

2.5.3 感官評(píng)定

從組織狀態(tài)、色澤、氣味、口感和滋味5 個(gè)方面對(duì)不同菌株發(fā)酵的豆?jié){進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖5。其中發(fā)酵后豆?jié){的組織狀態(tài)和色澤較發(fā)酵前均有所提高，但氣味，滋味下降。所有感官評(píng)定員反饋，豆?jié){發(fā)酵后豆腥味顯著減少，并有酸味生成，品嘗時(shí)入口略苦，但有回甘，類(lèi)似豆汁口感。其中，豆?jié){的豆腥味主要源于脂肪氧化生成的醇、醛、酮類(lèi)化合物[42]，經(jīng)菌株處理后能有效降低這些具有異味的小分子化合物[43]。而入口略苦可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在水解過(guò)程中，隨著小分子多肽的生成，疏水性氨基酸殘基暴露，苦味的程度與疏水氨基酸含量有關(guān)，疏水氨基酸在多肽中含量越多，苦味越重[44]。而酸味的生成與回甘滋味可能與大豆蛋白水解后，游離氨基酸含量上升，風(fēng)味物質(zhì)的釋放有關(guān)[45-46]。

圖5 產(chǎn)蛋白酶菌株處理后豆?jié){感官評(píng)定結(jié)果Fig.5 Sensory evaluation of soymilk after treatment of proteaseproducing strains

總體來(lái)看，菌株BJ-2、BJ-20 為發(fā)酵劑的兩個(gè)發(fā)酵組評(píng)價(jià)較好。其中，BJ-2 發(fā)酵豆?jié){的組織狀態(tài)和色澤分別得分9.5 和8.3 分，BJ-20 發(fā)酵豆?jié){的組織狀態(tài)和色澤分別得分9.5 和8.0 分，較發(fā)酵前相比明顯改良。感官評(píng)定員反饋，兩種發(fā)酵豆?jié){的組織狀態(tài)均勻，未見(jiàn)懸浮顆粒物，且呈顯乳白色，略帶光澤。這可能是因?yàn)殡S著水解度的提高，大豆分離蛋白的相對(duì)分子量逐漸減小，其平均粒徑、黏度、持水性降低，溶解性和持油性顯著提高[47]。

3 結(jié) 論

本文從東北傳統(tǒng)農(nóng)家醬中篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株8 株，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)8 株菌均為芽孢桿菌。在確定其安全性后，利用8 株芽孢桿菌處理豆?jié){。發(fā)現(xiàn)相較處理前，豆?jié){處理后可溶性肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了16.4%～37.2%，處理效果最佳的豆?jié){氨基態(tài)氮含量上升了10.87%，水解度為23.49%。此外，這8 株菌還可有效改良豆?jié){口感，為豆?jié){賦予獨(dú)特風(fēng)味。

本文為應(yīng)用于豆類(lèi)產(chǎn)品功能菌劑的開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)，還可作為潛在回添菌劑，應(yīng)用于東北傳統(tǒng)農(nóng)家醬工廠化生產(chǎn)。除此之外，本文還驗(yàn)證了篩選菌株應(yīng)用于豆?jié){時(shí)的酶解特性，確定菌株對(duì)豆?jié){的水解效果良好，為后續(xù)豆?jié){的營(yíng)養(yǎng)改良提供了數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)，在未來(lái)也可針對(duì)蛋白、多肽、氨基酸進(jìn)行更深入的研究，為豆?jié){的改良提供更多選擇與研究方向。