宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)窖泥生態(tài)監(jiān)測

游玲 簡曉平 范方勇 楊智 王濤

（1.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜賓 644002；2.四川省宜賓高洲酒業(yè)有限責(zé)任公司，宜賓 645150；3.宜賓市南溪區(qū)今良造釀酒有限公司，宜賓 644117）

濃香型白酒是以糧谷為原料，采用濃香大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、陳釀、勾調(diào)而成［1］，泥窖發(fā)酵是濃香型白酒的典型特征。生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)及已有研究表明，好窖出好酒，窖泥質(zhì)量對原酒品質(zhì)有直接影響。窖泥作為原酒風(fēng)味物質(zhì)代謝的主要微生物工廠，其工作效率和質(zhì)量至少受3個方面因素的影響，一是微生物類群數(shù)量及比例是否合理，二是這些微生物是否處于適當(dāng)?shù)纳L代謝狀態(tài)，三是營養(yǎng)及環(huán)境條件是否足以維持這種穩(wěn)定的連續(xù)培養(yǎng)體系。目前對窖泥質(zhì)量的評價主要是通過感官特征、理化指標(biāo)、微生物區(qū)系等，尚未見通過原酒品質(zhì)來評價窖泥質(zhì)量或生態(tài)狀況的報道。

盡管窖泥微生物區(qū)系受窖齡［2-3］、窖池取樣位置［4］、是否退化［5］等多種因素的影響，安徽、河南、江蘇、川北、宜賓、瀘州等產(chǎn)區(qū)的窖泥微生物亦各具特色［6-13］，但總體上，己酸菌屬（Caproiciproducens）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、喜熱菌屬（Caloramator），沉積物菌屬（Sedimentibacter、Caldicoprobacter）、梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、氨基酸桿菌（Aminobacterium）、理研菌屬（Petrimonas）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）等屬細(xì)菌在各產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)頻率均較高。研究發(fā)現(xiàn)，窖泥菌群的總氫代謝有利于提高窖泥的pH值，進(jìn)而提高窖泥質(zhì)量［14］，多種屬微生物與白酒風(fēng)味物質(zhì)的生成顯著相關(guān)，如Caproiciproducens和Hydrogenispora與乳酸的生成相關(guān)；Caproiciproducens和Clostridium等與窖泥中己酸和己酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)，與乳酸呈負(fù)相關(guān)。這些研究為通過窖泥微生物區(qū)系來了解窖泥生態(tài)狀況提供了參考。

另外，窖泥中有機(jī)酸、pH的動態(tài)平衡對維持窖泥生態(tài)有重要意義。吳浪濤等［2］發(fā)現(xiàn)，窖泥中乳酸、己酸、乙酸、丁酸四大酸含量隨窖齡增加而增加，且百年老窖中己酸占總有機(jī)酸比例平均為55.5%，而一般窖池窖泥中己酸只占總有機(jī)酸比例平均為24.55%，因此認(rèn)為采用總有機(jī)酸含量及己酸占比來評價窖泥可行。但窖泥pH為4.0-6.5，更有利于己酸菌生長［15］，丁酸菌等在代謝過程中產(chǎn)生的氫需要被甲烷菌及硝酸鹽還原菌通過“種間氫轉(zhuǎn)移”利用掉，實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸與pH的動態(tài)平衡，故pH、有機(jī)酸含量均可作為窖泥生態(tài)監(jiān)測的重要指標(biāo)。同時，水分、氨態(tài)氮、速效鉀、磷、腐殖質(zhì)、鈣、鎂、鐵等也對窖泥微生物組成或窖泥質(zhì)量有重要影響。李學(xué)思等［16］發(fā)現(xiàn)，窖池老熟過程中水分、pH、速效鉀、速效磷、氨態(tài)氮、鈣含量均有明顯變化。鄧杰［9］認(rèn)為水分是對微生物群落影響最大的因子。吳浪濤等［2］認(rèn)為窖泥含水量、有效磷和有效鉀含量是影響窖泥中梭菌綱微生物組成和濃香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)己酸與己酸乙酯含量的關(guān)鍵因素。劉梅等［8］認(rèn)為總氮、氨態(tài)氮含量和pH可作為窖泥質(zhì)量的初步評定標(biāo)準(zhǔn)。王艷麗等［7］發(fā)現(xiàn)退化、正常新窖及優(yōu)質(zhì)窖泥僅水分、銨態(tài)氮、鈣和鐵含量存在顯著差異，pH值、腐殖質(zhì)、有效磷、有效鉀、鎂和細(xì)菌總量均無明顯差異。Chen等［10］認(rèn)為宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥微生物群落與有效磷、pH顯著相關(guān)。Zhou等［17］發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量窖泥中與碳水化合物代謝相關(guān)的酶的數(shù)量遠(yuǎn)高于退化窖泥。上述指標(biāo)中，水分、氨態(tài)氮、有效鉀、磷等主要通過影響營養(yǎng)供給影響窖泥微生物區(qū)系，pH、酸度、酶活性等與微生物區(qū)系變化互為因果，但這些指標(biāo)中哪些更能即時、準(zhǔn)確地反映窖泥質(zhì)量狀態(tài)，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究通過比較原酒感官有顯著差異的窖池窖泥的理化指標(biāo)、主要有機(jī)酸及細(xì)菌區(qū)系，探究其與原酒風(fēng)味物質(zhì)、風(fēng)味特征的關(guān)系，描繪宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)窖泥的基本特征，并評估各指標(biāo)用于窖泥生態(tài)監(jiān)測的可行性，為窖泥生態(tài)監(jiān)測體系的建立提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 為了使原酒品質(zhì)差異主要來源于窖泥，選擇6個制曲及發(fā)酵工藝（除1個企業(yè)采用機(jī)械化釀造外）相似、原料相似的企業(yè)取樣，所取32個窖池的窖泥及原酒樣品信息如表1所示。

表1 樣品來源及基本信息Table 1 Source and information of samples

試劑與藥品：2-乙基丁酸（sigma公司，色譜純），氫氧化鈉、乙醇、酚酞、氨水、硫酸鎂、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、半胱氨酸等試劑均來自國藥集團(tuán)（分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 電子分析天平：德國賽多利斯集團(tuán)，AR2130；電導(dǎo)率儀：般特公司，ECscan20；便攜式pH計(jì)：奧立龍公司，pHB-3；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司，AGILENT 7890A-5975C；搖床：濟(jì)南愛來寶儀器設(shè)備有限公司，OLB-211B；超凈工作臺：中國吳江市凈化設(shè)備總廠，JJ060387；土壤氮磷鉀傳感檢測儀：精訊暢通儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 窖泥質(zhì)量評價 分別對32個酒樣隨機(jī)3位數(shù)編碼，由11名長期從事濃香型白酒品評勾調(diào)的技術(shù)人員從色澤（10分）、香氣（25分）、口味（50分）、風(fēng)格（15分）4個方面分6輪次進(jìn)行獨(dú)立感官品評，將原酒感官品評總得分做為相應(yīng)窖泥樣品的質(zhì)量得分，并據(jù)此對窖泥進(jìn)行初步分類。

1.2.2 窖泥理化指標(biāo)檢測 5.00 g窖泥加入95 mL去離子水，充分?jǐn)嚢韬箪o置30 min過濾，收集濾液，先分別采用pH計(jì)、電導(dǎo)率儀測定pH、電導(dǎo)率，再采用滴定法測定酸度［18］，速效氮磷鉀含量采用土壤氮磷鉀傳感器直接測定，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，鈣、鐵離子含量分別采用邁凱威鈣硬度測試試劑盒及總鐵測試試劑盒測定。

1.2.3 窖泥揮發(fā)性成分檢測 準(zhǔn)確稱取2.00 g窖泥于20 mL頂空瓶中，加入磁力攪拌子、2 mL 內(nèi)標(biāo)（0.1 g/L的2-乙基丁酸）、1 g氯化鈉晶體，60℃水浴平衡30 min后，插入PDMS/CAR萃取針萃取30 min，240℃解析5 min后進(jìn)樣，色譜及質(zhì)譜條件：使用DB-heavywax色譜柱（30 m × 0.250 mm ×0.20 μm），高純氦氣，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣溫度240℃，初始柱溫40℃，保持3 min，以3℃/min升溫至100℃，保持30 min，再以5℃/min升溫至140℃，保持1 min，最后以10℃/min升溫至240℃，保持1 min，260℃后運(yùn)行20 min。EI電壓70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描參數(shù)30-350 amu。原酒風(fēng)味物質(zhì)含量直接采用氣相色譜檢測，檢測器為氫火焰離子檢測器，溫度為240℃，采用內(nèi)標(biāo)法通過混合標(biāo)樣定量分析。

1.2.4 窖泥細(xì)菌區(qū)系組成研究 按照Fast DNATMSpin Kit for Soil試劑盒說明書提供的方法提取樣品總DNA，電泳合格后送基因測序公司擴(kuò)增其16S rDNA序列，過濾尾部質(zhì)量值20以下的堿基及質(zhì)控后50 bp以下的序列，再拼接，按最大錯配比率0.2篩選不符合序列，對優(yōu)化后的序列提取非重復(fù)序列，利用Usearch（vsesion 7.1）軟件平臺（http://drive5.com/ uparse/），將相似性在97%以上的非重復(fù)序列（不含單序列）劃為1個操作分類單位（operational taxonomic units, OTU）并聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將測序獲得的所有OTU與GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的模式菌株對應(yīng)序列比對，獲取OTU前20種優(yōu)勢物種對應(yīng)的分類單元（包括門綱目科屬種）及其相應(yīng)的豐度信息，對豐度排名前20的屬構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，將測序得到的微生物組成映射到數(shù)據(jù)庫中，使用PICRUSt軟件（https://picrust.github.io/ picrust）對窖泥中細(xì)菌的基因功能進(jìn)行預(yù)測［19］，并參照基因功能數(shù)據(jù)庫京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）進(jìn)行注釋。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析，利用美吉公司的（http://www.majorbio.com/）云平臺計(jì)算各指標(biāo)的膨脹因子，并將膨脹因子小于5的指標(biāo)視為相互之間不存在共線性關(guān)系［20］，可用于相關(guān)性分析，采用派森諾公司的云平臺（https://www.bioincloud.tech/）及美吉公司的云平臺（http://www.majorbio.com/）進(jìn)行CCA、RDA等可視化分析［21-23］，采用GraphPad Prism 9.4.1繪圖。

2 結(jié)果

2.1 窖泥樣品對應(yīng)窖池原酒風(fēng)味特征及風(fēng)味物質(zhì)含量

目前窖泥質(zhì)量主要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)及感官，但感官具有一定主觀性，因此，我們按照原酒感官評分分別為85-90分、80-85分、75-80分、70-75分來將窖泥初步分為4類（圖1），顯著性分析表明，除總分具有顯著差異外，各類別窖泥的單項(xiàng)評分均無顯著差異，其主要風(fēng)味物質(zhì)含量也沒有顯著差異（圖2），表明在制曲及發(fā)酵工藝、原料相似的情況下，原酒的感官風(fēng)味差異不能僅通過原酒中的某一種成分來簡單定量描述，我們通過原酒感官評分對窖泥進(jìn)行初步分類，與濃香型白酒現(xiàn)行國標(biāo)強(qiáng)調(diào)感官舒適的導(dǎo)向是一致的。

圖1 對應(yīng)窖池原酒感官評分Fig.1 Sensory evaluation of Baijiu produced in the corresponding pit

2.2 窖泥理化指標(biāo)用于窖泥生態(tài)檢測的可行性

宜賓產(chǎn)區(qū)（C酒企除外）窖泥理化指標(biāo)分布情況如圖3所示。宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥的pH為（4.66±1.43），酸度為（1.04±0.75）mmol NaOH/10 g，電導(dǎo)率為（711±321）μs/cm，鈣離子含量為（32.6±67.0）mg/kg，鐵離子含量為（20.7±24.8）mg/kg，速效氮含量為（97.1±42.4）mg/kg，速效磷含量為（137±60）mg/kg，速效鉀含量為（275±122）mg/kg，其變異系數(shù)分別為30.85%、71.85%、45.21%、205.1%、119.7%、43.75%、43.77%、44.36%，可見本產(chǎn)區(qū)窖泥理化指標(biāo)波動較大，特別是酸度及鈣鐵離子含量，而相對穩(wěn)定的pH則為不同窖泥馴化富集到相似的釀造微生物提供了基本環(huán)境。

圖3 宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥理化指標(biāo)分布Fig.3 Physicochemical indexes of pit mud in Yibin production region

不同類別窖泥的理化指標(biāo)分布情況如表2所示，顯著性分析表明不同類別窖泥的鈣離子、鐵離子、速效氮磷鉀含量以及pH、酸度、電導(dǎo)率均無顯著差異。存在明顯老化情況（窖泥中有白色結(jié)晶）的2個窖泥樣品的鈣離子、鐵離子含量明顯較高，分別為360 mg/kg、30 mg/kg及120 mg/kg、30 mg/kg，且鈣、鐵離子含量的相關(guān)性僅0.178，說明鈣、鐵離子共同用于評價窖泥老化情況時具有不同含義，在實(shí)際工作中，應(yīng)同時監(jiān)測這兩個指標(biāo)來反映窖泥老化狀況。窖泥中氮、磷、鉀含量這3個指標(biāo)兩兩之間存在超過0.99的極顯著相關(guān)性，表明監(jiān)測這3個指標(biāo)之一即可了解窖泥內(nèi)微生物生長的營養(yǎng)環(huán)境。優(yōu)質(zhì)窖泥（一類）體現(xiàn)出相對較高的pH（6.17±1.57）及相對較低的酸度（1.14±0.92）mmol NaOH/10 g，且pH、酸度、電導(dǎo)率兩兩之間均存在極顯著的相關(guān)性，其中pH與酸度、電導(dǎo)率的相關(guān)性分別為-0.602、-0.356，酸度、電導(dǎo)率的相關(guān)性為0.514，但膨脹因子分析表明，三者的VIF值均小于5，表明其不存在明顯的共線性關(guān)系（附表1）。

表2 不同窖泥理化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of physicochemical indexes of different pit muds

窖泥理化指標(biāo)與原酒品質(zhì)的相關(guān)性如圖4所示，紅點(diǎn)大小表示分值或含量高低，兩個指標(biāo)之間的夾角為銳角表示具有正相關(guān)性。從圖中可以看出，窖泥酸度、pH對原酒風(fēng)味有較大影響，酸度及速效氮磷鉀含量對原酒主要風(fēng)味物質(zhì)含量有較大影響。較高的pH與原酒的“酸”味有關(guān)，推測主要是由于窖泥pH較高，己酸菌生長產(chǎn)酸較好，而長鏈脂肪酸可賦予白酒“酸”味；較高的窖泥酸度可使原酒口感更凈（clean），且與呋喃、乙酸、乳酸乙酯含量正相關(guān)，與己酸乙酯、乙酸乙酯負(fù)相關(guān)，表明酸度較高總體上對原酒風(fēng)味有不利影響，這與實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)也是相符的，鑒于當(dāng)前濃香型白酒生產(chǎn)過程中傾向于限制乳酸乙酯、乙酸的含量，酸度作為窖泥質(zhì)量檢測指標(biāo)具有重要意義，并且酸度與pH、電導(dǎo)率均存在顯著相關(guān)性，通過在線監(jiān)測pH及電導(dǎo)率有助于及時發(fā)現(xiàn)窖泥酸度異常，并進(jìn)行針對性處理；窖泥中速效氮磷鉀含量與正丙醇、正丁醇、丁酸、己酸等風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)，同時也可使原酒口感更凈。但對應(yīng)原酒感官風(fēng)味有顯著差異的窖泥樣品在4個象限分散出現(xiàn)，表明難以通過窖泥的某個理化指標(biāo)來預(yù)測原酒品質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)含量，實(shí)際工作中宜通過分析窖泥的多個理化指標(biāo)來了解窖泥質(zhì)量或生態(tài)狀況。

圖4 窖泥理化指標(biāo)與原酒風(fēng)味的相關(guān)性分析Fig.4 RDA analysis between physicochemical indexes of the pit mud and the flavor of Baijiu

2.3 窖泥主要有機(jī)酸及己酸酯含量用于窖泥生態(tài)檢測的可行性

宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥主要有機(jī)酸及己酸酯含量分布情況如圖5所示，宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥中的己酸、乙酸、己酸乙酯、丙酸、己酸己酯、丁酸的含量分別為（6.49±2.84）、（0.04±0.05）、（1.15±1.07）、（0.04±0.05）、（0.97±0.98）和（0.20±0.13）g/100 g，可以看出，宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥中的己酸含量遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸或己酸酯，所產(chǎn)原酒感官風(fēng)味有顯著差異的窖池窖泥己酸、乙酸、己酸乙酯、丙酸、丁酸含量沒有顯著差異（表3），但丁酸含量與原酒感官評分呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），原酒感官評分較高的窖池窖泥的己酸己酯含量顯著高于其他窖泥，這可能是由于己酸、正己醇酯化反應(yīng)的空間位阻更大，己酸己酯的生成比己酸乙酯更依賴于酯化酶活力，其生成量可同時反映窖泥中己酸含量及酯化酶活力。

圖5 宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥樣品有機(jī)酸及己酸酯含量分布Fig.5 Content of organic acid and hexanoate in the pit mud samples from Yibin region

表3 不同窖泥主要有機(jī)酸及己酸酯含量Table 3 Contents of main organic acids and hexanoate in the different pit mud

經(jīng)計(jì)算，窖泥中己酸、乙酸、己酸乙酯、丙酸、己酸己酯、丁酸含量的VIF值分別為2.25、1.70、2.06、1.79、2.66、1.52，相互間不存在明顯的共線性關(guān)系（附表2），均可單獨(dú)作為RDA分析的環(huán)境因子。窖泥中主要有機(jī)酸及己酸酯含量與原酒品質(zhì)的相關(guān)性如圖6所示，紅點(diǎn)大小表示含量高低。窖泥中的己酸含量與原酒中糠醛、乙酸含量呈正相關(guān)，窖泥中的己酸含量對原酒中的己酸乙酯含量影響有限；窖泥中丁酸含量與原酒中的乳酸乙酯、乙酸含量呈正相關(guān)，窖泥中乙酸、丁酸含量與原酒的窖香、糧香、凈、爽、甜、酸、風(fēng)格等感官指標(biāo)也呈明顯負(fù)相關(guān)，且丁酸含量與原酒感官評分達(dá)到顯著負(fù)相關(guān)，這與乙酸、丁酸含量過高對濃香型白酒風(fēng)味有不利影響的報道一致。綜上，可將窖泥中己酸、乙酸、丁酸、己酸己酯的含量納入窖泥生態(tài)監(jiān)測范圍。

圖6 窖泥主要有機(jī)酸及己酸酯與原酒風(fēng)味的相關(guān)性Fig.6 RDA analysis between the contents of main organic acids or hexanoate in the pit mud and the flavor of baijiu

2.4 窖泥細(xì)菌相關(guān)指標(biāo)用于生態(tài)監(jiān)控的可行性

窖泥微生物組成對窖泥品質(zhì)有重要影響，目前細(xì)菌多樣性測序技術(shù)非常成熟，價格也已大幅降低至每個樣品100-200元，選擇細(xì)菌區(qū)系組成作為窖泥生態(tài)監(jiān)控的指標(biāo)已不存在技術(shù)、成本限制，本研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)窖泥在細(xì)菌區(qū)系組成方面存在一定共性。

不同類別窖泥的細(xì)菌多樣性指數(shù)如圖7所示。所產(chǎn)原酒感官評分較低的窖池窖泥（四類）的chao指數(shù)顯著高于其他窖泥，表明此類窖泥細(xì)菌種屬數(shù)量顯著較多，但不同類別窖泥的shannon指數(shù)及simpson指數(shù)沒有顯著差異，表明從細(xì)菌區(qū)系的豐富性及均勻度來看，所產(chǎn)原酒感官質(zhì)量差異較大的窖池窖泥細(xì)菌群落穩(wěn)定性無顯著差異。

圖7 不同窖泥的細(xì)菌多樣性指數(shù)Fig.7 Alpha diversity of bacteria in different levels of pit mud

不同類別窖泥細(xì)菌種屬分布情況如圖8所示。166個種屬細(xì)菌在四類窖泥中均有分布，一類窖泥中獨(dú)有9個細(xì)菌種屬，而四類窖泥中不僅獨(dú)有276個細(xì)菌種屬，還與三類窖泥共有56個一類、二類窖泥中沒有的細(xì)菌種屬，推測這些種屬細(xì)菌在濃香型白酒釀造過程中無足輕重，或可降低原酒品質(zhì)。窖泥生態(tài)監(jiān)測應(yīng)刪繁就簡，重點(diǎn)關(guān)注標(biāo)志性種屬的豐度波動。

圖8 不同類別窖泥細(xì)菌在屬水平的韋恩圖Fig.8 Venn diagram of the bacteria in the different pit mud at genus leve

優(yōu)勢細(xì)菌屬在不同類別窖泥中的豐度差異如圖9所示。本研究在宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥中發(fā)現(xiàn)的Caproiciproducens、Lactobacillus、Hydrogenispora、Syntrophaceticus、norank_f-Caloramatoraceae、Clostridium-_sensu_stricto_12、Caldicoprobacter、Sedimentibacter、Proteiniphilum、Petrimonas、Syntrophomonas等豐度較高的屬在其他產(chǎn)區(qū)亦較為常見，體現(xiàn)出濃香型白酒的共性特征，且原酒感官評分有顯著差異的窖池窖泥的優(yōu)勢細(xì)菌豐度沒有顯著差異。

這些優(yōu)勢細(xì)菌與原酒品質(zhì)的相關(guān)性如圖10所示，對3種以上白酒風(fēng)味成分的生成有顯著或極顯著影響較大的細(xì)菌包括Caproiciproducens、Caloramatoraceae、Sporosarcina以及Firmicute門的未定屬、Peptostreptococcales-Tissierellales。豐度較高的Lactobacillus僅對異戊醇、甲醇的生成有顯著影響，推測其盡管豐度較高，但對白酒風(fēng)味影響較小。Caproiciproducens、Caloramatoraceae顯著促進(jìn)了己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯的生成。Proteiniphilum、Petrimonas、Syntrophomonas、Eubacterium及Peptostreptococcales-Tissierellales顯著增加乙縮醛的生成。Sporosarcina顯著增加異戊醇的生成，同時顯著降低己酸、糠醛、正丁醇、仲丁醇、甲醇、乙醛的生成。Sedimentibacter顯著增加糠醛、乙醛的生成。但總體上，僅有Caproiciproducens、Caloramatoraceae、Peptostreptococcales-Tissierellales這3個屬細(xì)菌對白酒感官風(fēng)味的影響達(dá)到了顯著水平。從各種屬細(xì)菌對原酒風(fēng)味物質(zhì)影響程度及受影響的風(fēng)味物質(zhì)重要性來看，對應(yīng)窖池原酒品質(zhì)更佳的優(yōu)質(zhì)窖泥中，Caproiciproducens、Caloramatoraceae、Peptostreptococcales-Tissierellales豐度較高、Sporosarcina豐度較低，故Caproiciproducens、Caloramatoraceae、Sporosarcina、Peptostreptococcales-Tissierellales等屬豐度變化可作為窖泥微生物生態(tài)監(jiān)測指標(biāo)。

圖10 窖泥優(yōu)勢屬細(xì)菌對原酒風(fēng)味及風(fēng)味物質(zhì)含量的影響Fig.10 Effects on the flavor and the content of flavor substance of baijiu by the dominant bacterial genera in the pit mud

進(jìn)一步探討窖泥成分與上述優(yōu)勢屬細(xì)菌的相關(guān)性（圖11）?？梢钥闯?，優(yōu)勢細(xì)菌通過影響酸平衡、營養(yǎng)物質(zhì)含量、鹽離子濃度等影響窖泥生態(tài)環(huán)境，各優(yōu)勢屬細(xì)菌對至少1個窖泥理化指標(biāo)有顯著影響，這進(jìn)一步證實(shí)通過監(jiān)測上述細(xì)菌屬的豐度變化來監(jiān)測或評估窖泥生態(tài)狀況是可行的。

圖11 窖泥優(yōu)勢屬細(xì)菌與窖泥成分的相關(guān)性Fig.11 Correlation between dominant bacterial genera and the composition in the pit mud

Caloramatoraceae、Caloribacterium、Lactobacillus、Sporosarcina、Tepidimicrobium與窖泥電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)，Syntrophaceticus、Proteiniphilum、Syntropomonas與窖泥電導(dǎo)率呈顯著負(fù)相關(guān)，且Caloramatoraceae、Sporosarcina、Tepidimicrobium僅對電導(dǎo)率有顯著影響，對pH、酸度的影響較小，推測其主要通過增大鹽離子濃度來顯著提高電導(dǎo)率。鈣、鐵離子與窖泥老化密切相關(guān)，乳酸菌及梭菌的豐度與鈣、鐵離子濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，推測是由于這些微生物所產(chǎn)乳酸等有機(jī)酸與這些離子生成溶解度較高，可被淋溶帶走的鹽，從而顯著降低窖泥中的鈣、鐵離子濃度，延緩窖泥老化，但Hydrogenispora、Syntrophaceticus、norank_f_Caloramatoraceae、Proteiniphilum、Petrimonas、Syntrophomonas、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_Firmicutes等屬豐度與窖泥中鈣、鐵離子濃度呈顯著正相關(guān)，推測這些細(xì)菌可強(qiáng)化窖泥中鈣、鐵離子的固定。

多個細(xì)菌屬與窖泥中乙酸、己酸、丁酸、丙酸、己酸等有機(jī)酸的生成顯著相關(guān)，Caproiciproducens、norank_f_Caloramatoraceae可顯著減少乙酸的生成，Syntrophaceticus、Sedimentibacter、Petrimonas、Syntrophomonas、Tissierella、norank_f_norank_o_Peptostreptococcales-Tissierellales等與窖泥中的己酸含量顯著正相關(guān)，且這些屬細(xì)菌對窖泥中的己酸、丁酸、丙酸、己酸也有相似影響，這主要是由于這些有機(jī)酸具有相同或相似的代謝途徑。值得注意的是，Sporosarcina與窖泥中的速效氮磷鉀、己酸、己酸乙酯含量均呈顯著負(fù)相關(guān)，推測該屬細(xì)菌具有快速利用速效氮磷鉀的能力，可能對己酸菌等屬細(xì)菌形成營養(yǎng)競爭，這與圖7中該細(xì)菌對原酒中己酸、己酸乙酯的影響是一致的，表明窖泥中一旦該屬細(xì)菌豐度大幅上升，就要警惕窖泥質(zhì)量的下降，并及時進(jìn)行針對性處理。

Lactobacillus、Hydrogenispora、Syntrophaceticus、Proteiniphilum、Petrimonas、Syntrophomonas這6個屬的細(xì)菌同時對pH、酸度有顯著或極顯著影響。Lactobacillus是唯一與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)的細(xì)菌屬，推測其為導(dǎo)致窖泥酸化的主要原因，窖泥pH下降主要源于乳酸菌的作用，可通過監(jiān)測窖泥中乳酸菌的豐度變化來了解窖泥酸化情況，并及時進(jìn)行針對性的處理，而Hydrogenispora、Syntrophaceticus、Proteiniphilum、Syntophomonas、Patrimanas等屬與pH呈顯著正相關(guān)，推測其在H+代謝網(wǎng)絡(luò)中起重要作用，可顯著降低窖泥酸度，減少窖泥中H+對己酸菌生長的脅迫。從維持有機(jī)酸、pH動態(tài)平衡的角度來看，可以考慮通過監(jiān)測Lactobacillus、Hydrogenispora、Syntrophaceticus、Proteiniphilum、Petrimonas、Syntrophomonas等屬細(xì)菌的豐度變化來了解窖泥中H+代謝狀況，并通過針對性地改良窖泥細(xì)菌區(qū)系來改善己酸菌生長環(huán)境，提升窖泥質(zhì)量。

3 討論

3.1 利用原酒風(fēng)味評價窖泥質(zhì)量

原酒風(fēng)味作為窖泥質(zhì)量評價的間接標(biāo)準(zhǔn)，是與生產(chǎn)關(guān)系最為密切的標(biāo)準(zhǔn)，但已有研究均主要采用微生物及理化指標(biāo)作為窖泥質(zhì)量評價的客觀指標(biāo)［2-7］，僅有極少研究關(guān)注到窖池自然老熟過程中窖泥理化指標(biāo)與產(chǎn)酒質(zhì)量的關(guān)系［16］，這主要是由于原酒感官品質(zhì)同時受到大曲、糧食及生產(chǎn)工藝等眾多因素的影響，很難一一對應(yīng)地反映窖泥質(zhì)量。本研究選擇其他影響因素盡量一致的多個企業(yè)窖池取樣，使原酒盡可能地反映窖泥質(zhì)量，研究發(fā)現(xiàn)宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原酒的窖池窖泥具有如下共性特征：pH為（6.17±1.57），酸度為（1.14±0.92）mmol NaOH/10 g，己酸己酯含量相對較高，丁酸含量相對較低，Caproiciproducens、Caloramatoraceae、Peptostreptococcales-Tissierellales豐度相對較高，Sporosarcina豐度相對較低，這表明原酒品質(zhì)與窖泥理化及微生物指標(biāo)密切相關(guān)，針對宜賓產(chǎn)區(qū)建立“原酒-窖泥”數(shù)據(jù)庫將有助于窖泥、窖池質(zhì)量的客觀評價。

3.2 窖泥生態(tài)監(jiān)測指標(biāo)的選擇

利用原酒風(fēng)味評價窖泥質(zhì)量只能知道窖泥質(zhì)量等級，不能了解窖泥生態(tài)波動的具體情形，因此有必要選擇與原酒風(fēng)味關(guān)聯(lián)最密切的理化、微生物指標(biāo)來監(jiān)測窖泥生態(tài)狀況。已有研究普遍認(rèn)為應(yīng)建立基于理化、微生物等指標(biāo)的復(fù)合評價體系［8］，但監(jiān)測指標(biāo)過多又會增加監(jiān)測成本，且不同產(chǎn)區(qū)不同生產(chǎn)背景下的窖泥理化、微生物指標(biāo)可能相去甚遠(yuǎn)［24］，難以確定各生態(tài)檢測指標(biāo)的合理數(shù)值區(qū)域。本研究通過兩個途徑來解決這些問題，一是刪繁就簡，從眾多監(jiān)測指標(biāo)中抽取影響原酒品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，使測得數(shù)據(jù)能經(jīng)濟(jì)有效地反映窖泥生態(tài)狀況；二是針對特定產(chǎn)區(qū)（宜賓）選擇窖泥生態(tài)監(jiān)測指標(biāo)，減少因地理、氣候等因素造成的窖泥本身的異質(zhì)性，收窄各監(jiān)測指標(biāo)的數(shù)值范圍，使測得數(shù)據(jù)能快速反映窖泥生態(tài)波動，提升監(jiān)測體系的靈敏度。并且，針對選定的監(jiān)測指標(biāo)，后續(xù)還將兼顧窖泥生態(tài)監(jiān)測的準(zhǔn)確性及簡便快捷性，確定各指標(biāo)的監(jiān)測頻率，在多個企業(yè)驗(yàn)證、修正其合理數(shù)值范圍、權(quán)重，建立原酒品質(zhì)與窖泥指標(biāo)的對應(yīng)函數(shù)關(guān)系，同時選擇適宜傳感裝置，搭建實(shí)時在線的監(jiān)測平臺，及數(shù)據(jù)收集、分析平臺，開發(fā)相應(yīng)的窖泥生態(tài)監(jiān)測技術(shù)，為各企業(yè)窖池檔案管理提供方法參考，也為宜賓白酒產(chǎn)區(qū)釀造微生物生態(tài)監(jiān)測與保護(hù)提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)窖泥在理化指標(biāo)、微生物區(qū)系組成等方面具有共性，pH、酸度、主要有機(jī)酸及己酸酯含量、優(yōu)勢細(xì)菌豐度等指標(biāo)可在不同程度反映原酒感官品質(zhì)，適宜用于窖泥生態(tài)監(jiān)測。

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