不同植物精油對畜禽呼吸道致病菌的影響

■ 吳貴富

（麗珠集團新北江制藥股份有限公司，廣東清遠(yuǎn) 511520）

隨著現(xiàn)代集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖模式的興起，加上季節(jié)性、地域性環(huán)境條件的變化，使得畜禽呼吸道感染成為畜禽主要的易患疾病之一[1]。常見的畜禽呼吸道感染中細(xì)菌感染是一個主要的誘因，引起細(xì)菌性支氣管炎的細(xì)菌主要有流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、沙門氏菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌等。目前用于支氣管炎臨床治療的抗菌藥物主要有三大類：大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類化學(xué)藥物，這些化學(xué)藥物雖然對細(xì)菌性支氣管炎都有治療作用，但缺點也不可忽視，如易產(chǎn)生耐藥性、藥物易殘留、藥物副作用大、治療費用高、易復(fù)發(fā)等。因此，國內(nèi)外科研人員更多地將目光聚焦到效果穩(wěn)定、副作用小、性價比高的植物抗菌劑上[2]。

植物精油是從植物中提取的油狀液體的總稱，具有一定的揮發(fā)性，廣泛分布于植物中，可從花、葉、根、皮或整個植物中提取，是不溶于水但能溶于有機溶劑和脂類的芳香化合物，具有天然綠色、安全無殘留、香味獨特等優(yōu)點。植物精油按化學(xué)成分分為四大類，以金合歡烯、茴香醇為主的萜類最常見；其次是芳香族化合物，含量在整個芳香族化合物中僅次于萜類，主要有酚類、醛類、酮類、酯類以及一些衍生物，如麝香草酚、桂皮醛等；第三類是脂肪族化合物，常見的有異戊醛、乙酸乙酯等，都是香茅精油中的一種；第四類是含氮、含硫的化合物，多存在于辛香料植物中，如洋蔥中的三硫化物等[3-4]。不同成分的植物精油所發(fā)揮的作用和功能也不盡相同，常見有抑菌、殺蟲、抗氧化、抗炎癥和抗癌活性等功能，目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)殺蟲劑、食用香精、食品保鮮防腐劑、化妝品以及醫(yī)療等領(lǐng)域[5]。其中，植物精油的抑菌功能應(yīng)用最為廣泛。植物精油具有優(yōu)良的抑菌效果，在國內(nèi)外眾多研究報道中均得到驗證，從替抗理念提出以來，人們一直沒有停止對植物精油抑菌效果的探索，何楚俐等[6]在不同種類的植物精油體外抑菌效果的研究中表明，多種植物精油（如香芹酚等）均對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌作用，張林會等[7]、張桂枝等[8]、黃梓煒等[9]、吳雨泉等[10]都從不同的試驗中表明，適宜的植物精油對不同的致病菌均有較好的抑菌效果，因此，篩選適宜的植物精油品種，開發(fā)好的替抗產(chǎn)品，并應(yīng)用到畜禽日常生產(chǎn)養(yǎng)殖中，是一個具有良好前景的替抗發(fā)展方向，然而目前植物精油應(yīng)用于畜禽呼吸道感染方面的研究相對較少。本試驗從綠色、安全、環(huán)保、有效的目的出發(fā)，運用天然的植物精油代替部分抗生素使用，防治常見的畜禽細(xì)菌性呼吸道感染疾病。通過體外平板打孔抑菌試驗、正交試驗以及動物試驗，在17 種天然植物精油中系統(tǒng)地篩選出對畜禽細(xì)菌性呼吸道感染常見致病菌有較好抑菌效果的精油品種及其組合，并通過動物試驗確定適宜的添加劑量，為植物精油對家禽養(yǎng)殖中細(xì)菌性呼吸道疾病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

LB培養(yǎng)基條件：pH為7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

材料：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂粉（均購自杭州百思生物技術(shù)有限公司）、去離子水由Smart-R15U超純水儀（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）實驗室自制。

指示菌：沙門氏菌（CVCC2218）、金黃色葡萄球菌（CVCC2257）來源于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，乙型溶血性鏈球菌[CMCC（B）32210]、大腸桿菌（CGMCC1.1252）來源于上海保藏生物技術(shù)中心。

植物精油：大蒜油、薄荷精油、迷迭香精油、檸檬精油、桉葉精油、牛至油、丁香精油、艾葉油、檸檬香茅草油、生姜精油、薰衣草油、乳香油、百里香酚、薄荷腦、茶樹精油購自深圳市國鑫香精香料有限公司，肉桂醛、香芹酚購自吉安博銳香料油有限公司，精油含量范圍均在95.0%～99.9%。

1.2 試驗動物及處理

試驗動物：取體重相近、健康狀況良好、雌雄各半的40日齡清遠(yuǎn)麻雞75只（購自清遠(yuǎn)市三源清遠(yuǎn)雞養(yǎng)殖有限公司），對其中60只受試雞均用1×106CFU/mL 濃度的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌接種液進(jìn)行氣囊攻毒感染，經(jīng)毒力測定及臨床癥狀表現(xiàn)，最終選用4 種接種液各0.5 mL 作為每只受試雞的攻毒劑量。

感染模型建立：攻毒感染24 h 后，受試雞出現(xiàn)氣喘、咳嗽、食欲不振等呼吸道臨床癥狀，即建立受試雞感染模型。

1.3 試驗設(shè)備

主要儀器有SW-CJ-2FD 凈化工作臺（上海昕儀儀器儀表有限公司）、BPP-7800 pH 儀[貝爾分析儀器（大連）有限公司]、WH-2 微型旋渦混合儀（常州市中貝儀器有限公司）、BKQ-B50Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋（山東博科醫(yī)療器械有限公司）、RW-2102C 雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海瑞穩(wěn)儀器設(shè)備廠）、SPX-80E智能型生化培養(yǎng)箱（上海靳瀾儀器制造有限公司）、DHG-9023A烘干箱（上海善志儀器設(shè)備有限公司）等。

1.4 單一植物精油對不同致病菌體外抑菌效果篩選

以1×106CFU/mL 0.1 mL的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌作為指示菌，均勻涂抹在LB 固態(tài)培養(yǎng)基上，試驗分為兩組，每組分別在同一平板、同一培養(yǎng)基、同一培養(yǎng)條件下，加入不同種類精油10 μL，培養(yǎng)24 h 后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌直徑，評判其抑菌性，篩選效果最佳的幾種精油，具體方法見1.7.1。

1.5 復(fù)合精油對不同致病菌體外抑菌效果篩選

將篩選出的精油按照2：1、1：1、1：2 不同比例復(fù)合后，分別加入大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌作為指示菌的培養(yǎng)基中，具體方法同1.4。通過正交試驗，確定最佳抑菌效果的精油組合。

1.6 最小抑菌濃度篩選

以2 倍稀釋法篩選出最佳抑菌作用精油及精油組合的最小抑菌濃度的最小抑菌圈直徑（MIC）。

1.7 測定方法和指標(biāo)

1.7.1 植物精油抑菌篩選

選取畜禽呼吸道感染致病菌作為指示菌體，通過抑菌圈的大小篩選出效果最佳的幾種植物精油和精油組合。運用濾紙片法對不同種類植物精油和復(fù)配精油進(jìn)行抑菌試驗。

抑菌試驗：濾紙片法測定抑菌作用。將滅菌后的LB 固態(tài)培養(yǎng)基按15～20 mL 每皿倒入培養(yǎng)皿中，置于超凈工作臺上。冷卻凝固后，在培養(yǎng)基中取菌原液（1×106CFU/mL）0.1 mL，均勻涂抹，然后在含菌的平板上貼上無菌濾紙片，每個培養(yǎng)皿3 張，呈三角形。然后將10 μL 的精油滴入每個濾紙片的中間，每個精油做3 次平行重復(fù)。同時設(shè)置空白對照，無需精油處理。待精油完全被濾紙片吸收后，在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中翻轉(zhuǎn)放入培養(yǎng)皿中，24 h后記錄結(jié)果。

1.7.2 不同植物精油的最小抑菌濃度

將篩選好的植物精油進(jìn)行復(fù)配，篩選出抑菌效果最好的精油復(fù)配組合，并判定出植物精油和復(fù)合精油的最小抑菌濃度。

2倍稀釋法：取滅菌試管若干，在第1個試管中加入2 mL精油或復(fù)合精油，其余試管加入1 mL液體培養(yǎng)基，1號試管中無水乙醇含量為2%，用以乳化精油，此無水乙醇濃度對菌種無明顯抑菌作用。取1 mL 1號試管精油混合液體加入到2號試管中，依次類推，做梯度稀釋，直到11號試管，向其中加入1 mL去離子水，作為陰性對照。最后，在每個試管中分別加入0.5 mL液體培養(yǎng)基和菌液，使最終濃度依次為50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.098 mg/mL，37 ℃，24 h后觀察試管溶液菌種變化。

MIC 判定標(biāo)準(zhǔn)：以陽性管溶液渾濁、陰性管溶液澄清的含菌表現(xiàn)，以此來指示細(xì)菌的MIC值。

1.7.3 動物試驗

將60只感染模型受試雞平均分成4組，每組15只，未攻毒感染的15 只受試雞為空白組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)5 只，即空白組、對照組和高、中、低三個劑量組，劑量組為前期體外抑菌試驗篩選出的、抑菌效果最佳的復(fù)合植物精油（肉桂醛∶百里香酚2∶1），具體見表1。保持在同一光照和飼養(yǎng)環(huán)境下，自由采食和飲水，連續(xù)飼喂7 d，觀察記錄各組受試雞的臨床癥狀、死亡情況和采食情況。

表1 動物試驗設(shè)計

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

測試數(shù)據(jù)由SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，試驗結(jié)果以平均值表示。測定抑菌的標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑在20 mm 以上的具有極強的敏感性；直徑為15～20 mm的為高敏；直徑10～15 mm 的為中敏；7～10 mm 的為低敏；7 mm以下的為不敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精油對畜禽呼吸道致病菌的體外抑菌效果

從表2中可以看出，在測試的17種精油中，對大腸桿菌抑制效果最好的是肉桂醛，其次是香芹酚、牛至油、茶樹精油、百里香酚、丁香精油；對沙門氏菌抑制效果最好的是肉桂醛，其次是牛至油、香芹酚、百里香酚、丁香精油、茶樹精油；對金黃色葡萄球菌抑制效果最好的是肉桂醛，其次是香芹酚、牛至油、百里香酚和茶樹精油；肉桂醛對乙型溶血性鏈球菌抑制效果最好，香芹酚次之，其次為牛至油、大蒜油、百里香酚、茶樹精油、檸檬香茅草油。

表2 不同精油對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的體外抑菌效果

2.2 不同比例復(fù)合精油對畜禽呼吸道致病菌的體外抑菌效果

由單一植物精油抑菌試驗得出肉桂醛、香芹酚、百里香酚、牛至油等對畜禽呼吸道致病菌有較好的抑菌效果，通過正交試驗得出不同比例復(fù)合精油對畜禽呼吸道致病菌的抑制效果。由表3 可知，精油組合中抑制大腸桿菌效果最好的是2∶1的肉桂醛∶牛至油，其次是2∶1的肉桂醛∶百里香酚、1∶2的肉桂醛∶香芹酚、2∶1的香芹酚∶牛至油、2∶1的肉桂醛∶香芹酚、1∶1的肉桂醛∶牛至油；精油組合中抑制沙門氏菌效果最好的是2∶1的肉桂醛∶百里香酚，其次是2∶1的肉桂醛∶香芹酚、2∶1 的肉桂醛∶牛至油、2∶1 的香芹酚∶百里香酚、1∶1的肉桂醛∶牛至油；精油組合中抑制金黃色葡萄球菌效果最好的是2∶1 的香芹酚∶牛至油，其次是2∶1 的肉桂醛∶百里香酚、2∶1 的肉桂醛∶香芹酚組合、2∶1 的香芹酚∶百里香酚、2∶1的肉桂醛∶牛至油組合以及1∶2 的香芹酚∶百里香酚和1∶1的肉桂醛∶牛至油；對乙型溶血性鏈球菌抑菌效果最好的精油組合為2∶1 的肉桂醛∶牛至油組合，其次為2∶1、1∶1的肉桂醛∶百里香酚。

表3 不同比例復(fù)合精油對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的體外抑菌效果(mm)

2.3 對畜禽呼吸道致病菌最具抑菌效果的植物精油及精油組合的最小抑菌濃度

由表4 可知，單個植物精油肉桂醛和香芹酚對畜禽呼吸道感染常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.391 mg/mL，對乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度均為0.781 mg/mL。精油組合中2∶1 的肉桂醛∶牛至油對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.195 mg/mL，對大腸桿菌、乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度均為0.391 mg/mL；2∶1的肉桂醛∶百里香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.195 mg/mL，對乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度為0.391 mg/mL。

表4 不同精油及精油組合的最小抑菌濃度（mg/mL）

2.4 動物試驗結(jié)果

由表5可知，當(dāng)2∶1的肉桂醛∶百里香酚復(fù)合精油的用量為100 mg/kg時，治愈率為53.33%；當(dāng)用量為200 mg/kg時，治愈率為86.66%；當(dāng)劑量加至300 mg/kg時，觀察到個別試驗雞有精神狀態(tài)不佳現(xiàn)象，并出現(xiàn)死亡情況，故將此濃度定為高劑量限度。綜合試驗結(jié)果，當(dāng)2∶1 的肉桂醛∶百里香酚復(fù)合精油的用量為200 mg/kg時，可達(dá)到最佳的抑菌效果。

表5 2∶1的肉桂醛∶百里香酚對畜禽細(xì)菌性呼吸道感染的治療效果（n=15）

3 討論

3.1 不同精油對畜禽呼吸道致病菌的體外抑菌效果

通過對市面上抑菌效果較好的17 種植物精油進(jìn)行畜禽呼吸道感染常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的抑菌試驗，試驗結(jié)果表明，篩選出有較好抑菌效果的植物精油是肉桂醛，其次是香芹酚、牛至油和百里香酚，這與相關(guān)研究表述一致。顧仁勇等[11]在對肉桂精油進(jìn)行抑菌試驗研究時指出，在對真菌和酵母菌有強烈抑制作用的同時，肉桂精油對細(xì)菌的抑菌作用顯著。郭新春等[12]在20 種中藥精華抑菌活性研究時顯示，肉桂、丹皮萃取精華有較好的抑菌效果。王改琴等[13]在研究不同植物精油的體外抑菌作用時指出，肉桂醛、香芹酚、丁香精油、百里香酚等對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較好的抑菌作用。

3.2 不同比例復(fù)合精油對畜禽呼吸道致病菌的體外抑菌效果

試驗結(jié)果表明，篩選出的單一植物精油在進(jìn)行正交試驗后，表現(xiàn)出對畜禽呼吸道感染常見致病菌綜合抑菌效果較好的植物精油組合是2：1 的肉桂醛：牛至油以及2：1 的肉桂醛：百里香酚。復(fù)合精油抑菌效果優(yōu)于單一植物精油抑菌效果，這與相關(guān)研究資料表述一致，但具體機制尚不明確，根據(jù)相關(guān)報道，可能與植物精油之間的協(xié)同作用和混合物生物多樣性的增加有關(guān)。郝文鳳等[14]在植物精油協(xié)同抑菌的研究進(jìn)展中表明，與任何單一的精油相比，不同精油組成的精油混合物可能具有更強的抗菌性能，這可能與混合物生物多樣性的增加有關(guān)。吳克剛等[15]在8種植物精油對常見微生物體外抑菌效果的研究中表明，肉桂醛與牛至油復(fù)合精油有著非常顯著的協(xié)同抑菌效果。同時，Sae-Eawa 等[16]也在相關(guān)試驗中表明，適宜比例復(fù)合后的植物精油，均表現(xiàn)出強烈的協(xié)同抑菌效果。

3.3 不同精油及精油組合對畜禽呼吸道致病菌的最小抑菌濃度

在本試驗結(jié)果中，單個植物精油肉桂醛和香芹酚對畜禽呼吸道感染常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.391 mg/mL，對乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度均為0.781 mg/mL。精油組合中2∶1的肉桂醛+牛至油對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.195 mg/mL，對大腸桿菌、乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度均為0.391 mg/mL；精油組合中2∶1的肉桂醛+百里香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.195 mg/mL，對乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度為0.391 mg/mL。這與相關(guān)試驗結(jié)果相近，但略有不同。黃灑[17]在對不同復(fù)配精油的抑菌試驗中表明，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、黑曲霉和產(chǎn)黃青霉，肉桂精油對所有菌種都具有較強的抑制作用，其次是丁香精油和百里香精油。趙丹等[18]在對金黃色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌4 個菌種進(jìn)行肉桂精油抑菌試驗中，分別顯示出200、200、200、400 μL/mL的最小抑菌濃度。

3.4 復(fù)合植物精油對畜禽呼吸道病的臨床治療效果

動物試驗結(jié)果顯示，在對雞呼吸道感染常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌攻毒模型的動物試驗中，高、中、低三個劑量組與對照組相比，均有不同程度的治療效果，在2∶1 的肉桂醛∶百里香酚復(fù)合精油200 mg/kg 劑量時，治療效果最好。同時，相關(guān)研究報道，不同種類復(fù)合精油還對雞的產(chǎn)蛋率和生產(chǎn)性能和腸道菌群有促進(jìn)作用。楊建平等[19]在對復(fù)合植物精油對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，飼喂時添加150 mg/kg 復(fù)合植物精油，能提高蛋雞的生產(chǎn)性能和蛋黃質(zhì)量，增加盲腸擬桿菌門豐度。因此，適量、適宜的復(fù)合植物精油，可對畜禽的細(xì)菌性呼吸道感染和產(chǎn)蛋性能等方面起到積極的效果。

4 結(jié)論

在17 種優(yōu)選植物精油對畜禽呼吸道感染常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的抑菌試驗結(jié)果表明，抑菌效果最佳的單一植物精油為肉桂醛和香芹酚，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.391 mg/mL，對乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度均為0.781 mg/mL。抑菌效果最佳的植物精油組合為2∶1 的肉桂醛∶牛至油和2∶1的肉桂醛∶百里香酚，2∶1的肉桂醛∶牛至油對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.195 mg/mL，對大腸桿菌、乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度均為0.391 mg/mL；2∶1 的肉桂醛∶百里香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.195 mg/mL，對乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度為0.391 mg/mL；在對雞大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌呼吸道感染動物模型試驗中，2∶1的肉桂醛∶百里香酚最佳的治療劑量為200 mg/kg。