• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變選育高產(chǎn)衣康酸菌株

    2023-08-12 02:06:56杜敬彩趙剛李自云許國峰張成虎
    生物化工 2023年3期
    關(guān)鍵詞:亞硝基突變率致死率

    杜敬彩,趙剛,李自云,許國峰,張成虎*

    (1.山東泓達(dá)生物科技有限公司,山東臨沂 276400;2.山東沂蒙山酒業(yè)有限公司,山東臨沂 276400)

    衣康酸學(xué)名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸,是不飽和二元有機酸。因為衣康酸分子內(nèi)含一個不飽和雙鍵,化學(xué)性質(zhì)活潑,可進行自聚合,也能與其他有機物共聚。衣康酸具有兩個羧基,還可以與醇發(fā)生酯化反應(yīng)。平臺化合物是指可進一步轉(zhuǎn)化為價值更高的目標(biāo)化工產(chǎn)品的基礎(chǔ)化學(xué)物,2004 年,衣康酸被美國能源部評選為12 種最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锘脚_化合物之一[1]。衣康酸酯類是生產(chǎn)腈綸、樹脂、塑料、橡膠、藥物、表面活性劑、無毒食品包裝材料、除草劑、除垢劑、粘著劑、除臭劑、紙張等的工業(yè)原料,廣泛用于化工行業(yè)[2-3]。因此,衣康酸是化學(xué)合成工業(yè)的重要原料,也是化工生產(chǎn)的重要原料。

    衣康酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和生物法,相比化學(xué)法生產(chǎn)衣康酸,生物發(fā)酵法具有原料來源豐富、成本較低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、工藝技術(shù)成熟等優(yōu)點,因此生物發(fā)酵法是目前衣康酸生產(chǎn)的主流方向。近年來報道的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸的主要菌種包括土曲霉[4](Aspergillus terreus)、玉米黑粉菌[5](Ustilago maydis)、黑曲霉[6](Aspergillus niger),這些菌株產(chǎn)生的衣康酸可自主分泌到胞外。目前,土曲霉(Aspergillus terreus)仍然是應(yīng)用最廣泛的衣康酸工業(yè)生產(chǎn)菌株,但菌種產(chǎn)量較低、產(chǎn)酸不穩(wěn)定成為制約衣康酸生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要因素。因此,利用傳統(tǒng)誘變育種或基因重組對菌種進行改良已成為衣康酸生產(chǎn)領(lǐng)域的重要研究方向。

    傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法可以促進誘發(fā)突變,提高突變率,并且因其便捷、快速、有效等優(yōu)點,迄今為止仍是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變方法不同對菌株產(chǎn)生的誘變效應(yīng)也不同。如紫外誘變是一種常用的物理誘變因素,可使DNA 形成嘧啶二聚體[7],而亞硝基胍(NTG)是烷化劑的一種,被喻為“超誘變劑”[8],它主要在DNA 鏈的復(fù)制區(qū)引起GC →AT 的轉(zhuǎn)換,即使在致死率很低的條件下也能使微生物產(chǎn)生高頻率的突變。單一誘變方法雖可得到高產(chǎn)菌株,但突變概率偏低;復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng),比單一誘變效果好[9]。

    本研究采用亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變對本實驗室一株產(chǎn)衣康酸菌株進行菌種選育,加大菌株突變率,有效提高高產(chǎn)菌株的選育效率,并對高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性進行了研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株

    土曲霉KYK-031,本實驗室篩選保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    (1)傳代斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g/L,胰蛋白胨1.0 g/L,玉米漿3.0 g/L,硫酸鎂1.0 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,瓊脂20.0 g/L,pH 自然。

    (2)種瓶培養(yǎng)基:葡萄糖40.0 g/L,硫酸銨5.0 g/L,玉米漿2.5 g/L,硫酸鎂1.0 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,硝酸調(diào)pH 值至3.0。

    (3)搖瓶培養(yǎng)基:葡萄糖130.00 g/L,硫酸銨5.00 g/L,玉米漿2.50 g/L,硫酸鎂1.00 g/L,磷酸二氫鉀0.50 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,硫酸鋅0.01 g/L,氯化鈣0.50 g/L,硝酸調(diào)pH 值至3.0。

    (4)初篩顯色平板培養(yǎng)基:葡萄糖100.00 g/L,硫酸銨5.00 g/L,玉米漿2.50 g/L,硫酸鎂1.00 g/L,磷酸二氫鉀0.50 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,硫酸鋅0.01 g/L,溴甲酚綠0.10 g/L,瓊脂20.00 g/L。

    1.1.3 試劑

    亞硝基胍,分析純,上海源葉生物科技有限公司;溴甲酚綠,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白胨,生化試劑,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;玉米漿,生化試劑,魯洲生物科技(山東)有限公司;瓊脂,生化試劑,上海沃凱藥業(yè)有限公司;酚酞,分析純,天津市北辰區(qū)方正試劑廠;其余試劑均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑。

    1.1.4 儀器與設(shè)備

    ZWY-2112B 型恒溫?fù)u床、ZXDP-B2270 型電熱恒溫培養(yǎng)箱和ZHJH-C1112C 型超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司;LDZM-80L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;SBA-40E 型生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 單孢子懸液制備

    甘油管菌種接種新鮮斜面培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)6 ~7 d,待長出孢子,取出斜面加入6 mL 磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.0),用接種環(huán)刮下孢子,振蕩試管立即通過帶濾紙漏斗過濾,調(diào)整孢子懸液的濃度為106個/mL,得到單孢子懸液[10]。

    1.2.2 亞硝基胍(NTG)溶液的制備

    使用磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.0)配制1 mg/mL亞硝基胍溶液,于暗處振蕩溶解后備用。

    1.2.3 亞硝基胍誘變

    亞硝基胍溶液與單孢子懸液以1 ∶1 的體積比例混合,30 ℃振蕩20 ~60 min,20 min 時取樣1 次,之后每10 min 取樣1 次,取樣后立即稀釋1 000 倍終止反應(yīng);梯度稀釋后,于初篩顯色平板進行分離培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)3 d 后計數(shù)。未處理的單孢子懸液與pH 6.0的磷酸緩沖液以1 ∶1 的體積比例混合,梯度稀釋后于初篩顯色平板進行分離培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)3 d 后計數(shù)。

    根據(jù)處理前后的孢子數(shù)按公式(1)計算致死率。根據(jù)Hc 值(變色圈直徑與菌落直徑的比值),處理后的單菌落比處理前的單菌落Hc值高的為正突變菌株,按公式(2)計算正突變率。

    式中:B0和By分別為每1 mL 未處理和誘變處理孢子液中孢子數(shù);J為每1 mL 對照組菌液中菌株數(shù)。

    1.2.4 紫外誘變

    取單孢子懸液8 mL 至直徑為9 cm 的無菌培養(yǎng)皿中,置于磁力攪拌器上,15 W 紫外線下30 cm 處。在正式照射前,應(yīng)先開啟紫外燈預(yù)熱10 ~20 min,待光波穩(wěn)定后,開啟皿蓋和磁力攪拌,分別照射1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min。操作全過程在紅燈下進行,避免白熾光。誘變單孢子懸液放入黑暗冰箱中保存1 h,抑制突變體中的修復(fù)酶活,提高誘變突變率。取未照射的制備孢子液和照射后冰箱保存的孢子液各1 mL,梯度稀釋至合適濃度,取0.1 mL 單孢子懸液均勻涂布于初篩顯色平板,于37 ℃避光培養(yǎng)3 d。計算致死率和正突變率。

    1.2.5 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變

    以亞硝基胍和紫外線誘變的最佳參數(shù)進行復(fù)合誘變。取經(jīng)亞硝基胍誘變的單孢子懸液8 mL 至直徑為9 cm 的無菌培養(yǎng)皿中,進行紫外誘變,稀釋分離后涂布于初篩顯色平板,于37 ℃避光培養(yǎng)3 d。根據(jù)孢子液中活孢子數(shù)和Hc 值,以未經(jīng)處理的單孢子懸液為對照,計算致死率和正突變率。

    1.2.6 篩選方法

    (1)平板初篩

    衣康酸單菌落生長過程中產(chǎn)生衣康酸,滲透進周圍培養(yǎng)基中,導(dǎo)致pH 降低,初篩顯色平板在溴甲酚綠酸堿指示劑的作用下,藍(lán)綠色的平板上產(chǎn)生黃色變色圈,根據(jù)初篩顯色平板上的Hc 值,選取10%的高產(chǎn)菌株傳代于試管斜面培養(yǎng)基,37 ℃下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d 進入復(fù)篩。

    (2)搖瓶復(fù)篩

    將平板初篩獲得菌株斜面孢子接種瓶培養(yǎng)基,37 ℃下200 r/min 回旋式搖床培養(yǎng)36 h,按10%接種量轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)基,500 mL 三角瓶裝液量為60 mL,每株菌株做3 個平行,在37 ℃下200 r/min 回旋式搖床培養(yǎng)3 d。

    (3)誘變篩選路線

    根據(jù)選定誘變條件,確定如下誘變路線[11]。第一輪:以土曲霉HYK-031 為出發(fā)菌株,經(jīng)亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后,初篩顯色平板上根據(jù)Hc 值從500 株顯色菌株進行初篩,選取50 株Hc 值較大菌株進行搖瓶復(fù)篩,篩選出5 株高產(chǎn)菌株。第二輪:分別以5 株高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株,每株出發(fā)菌株經(jīng)亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后,分別從初篩顯色平板上長出的100 株顯色菌株(共500 株)中進行初篩,選取50 株Hc 值較大菌株進行搖瓶復(fù)篩,篩選出5 株高產(chǎn)菌株。第三輪:與第二輪步驟相同。第四輪:與第三輪步驟相同。

    1.2.7 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性考察

    將亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后復(fù)篩選育的衣康酸高產(chǎn)菌株,連續(xù)傳5 代,并將5 代全部進行搖瓶發(fā)酵驗證,根據(jù)發(fā)酵結(jié)果確定高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

    1.2.8 分析方法

    (1)衣康酸含量檢測

    發(fā)酵完畢,取出搖瓶加水恢復(fù)至原體積60 mL,取發(fā)酵液用濾紙進行過濾后,稱取濾液0.2 g,精確到0.2 mg,用約50 mL 水溶解并全部移入250 mL 錐形瓶中,加酚酞指示液2 ~3 滴,以0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至淡粉色,并保持30 s不褪色為終點,記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V1,同時做空白試驗,記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V2。衣康酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)W按公式(3)計算。

    式中,c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的準(zhǔn)確濃度,mol/L;65.05 為衣康酸的摩爾質(zhì)量,g/mol;m為試樣的質(zhì)量,g。

    (2)糖酸轉(zhuǎn)化率

    生物傳感分析儀檢測初始糖濃度和殘?zhí)菨舛?,糖酸轉(zhuǎn)化率按公式(4)計算。

    1.3 統(tǒng)計與分析

    利用Excel 2007 軟件對數(shù)據(jù)進行平均數(shù)和方差的統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 亞硝基胍誘變時間的確定

    對出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進行亞硝基胍誘變后,計算致死率和正突變率,結(jié)果如圖1 所示。亞硝基胍在500 μg/mL 濃度下,隨著亞硝基胍誘變時間的延長,致死率逐漸升高,正突變率則先上升后下降。當(dāng)亞硝基胍誘變時間為40 min 時,正突變率達(dá)到最高(15%),此時的致死率為81.6%。因此,選擇亞硝基胍誘變時間為40 min。

    圖1 NTG 誘變的影響

    2.2 紫外誘變時間的確定

    對出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進行了紫外誘變后,計算致死率和正突變率,結(jié)果如圖2 所示。在相同紫外照射強度下,隨著誘變時間的延長致死率逐漸升高,正突變率則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)紫外誘變時間為2 min 時,正突變率達(dá)到最高(17.3%),此時的致死率為75.2%。因此,選擇紫外誘變時間為2 min。

    圖2 紫外誘變的影響

    2.3 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變

    對出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進行亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變,選擇亞硝基胍誘變濃度為500 μg/mL,亞硝基胍誘變時間為40 min,15 W 紫外線照射時間為2 min,亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后,進行致死率和正突變率的計算。三次重復(fù)實驗結(jié)果見表1,致死率達(dá)到93.5%,正突變率也達(dá)到了26.1%,比單一誘變正突變率高。

    表1 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變對土曲霉的影響

    2.4 高產(chǎn)菌株的篩選

    以土曲霉KYK-031 為出發(fā)菌株,進行三輪亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后,根據(jù)平板初篩和搖瓶復(fù)篩結(jié)果,篩選出5 株衣康酸高產(chǎn)菌株KYK-1035、KYK-1165、KYK-1352、KYK-1483 和KYK-1494,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量結(jié)果如圖3 所示。KYK-1035 菌株搖瓶發(fā)酵衣康酸產(chǎn)量最高,為73.7 g/L,比出發(fā)菌株(41.8 g/L)提高了76.3%,糖酸轉(zhuǎn)化率為63.4%。

    圖3 土曲霉突變株產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率

    2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性

    篩選出的衣康酸高產(chǎn)菌株要符合生產(chǎn)菌株穩(wěn)定性的要求。對篩選出的衣康酸高產(chǎn)菌株KYK-1035傳代5 次,對5 代菌株的遺傳穩(wěn)定性進行考察,結(jié)果見表2。由結(jié)果可知,KYK-1035 菌株搖瓶發(fā)酵衣康酸的產(chǎn)量維持在72.4 ~73.9 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率維持在62.6%~63.6%,衣康酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都較穩(wěn)定,遺傳穩(wěn)定性良好。

    表2 土曲霉突變株KYK-1035 的遺傳穩(wěn)定性

    3 結(jié)論

    通過對衣康酸出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進行傳統(tǒng)的化學(xué)、物理誘變,獲得高產(chǎn)衣康酸菌株。分別對亞硝基胍誘變和紫外誘變的致死率和正突變率進行研究,確定了亞硝基胍在500 μg/mL 濃度下的最佳誘變時間為40 min,15 W 紫外誘變的最佳誘變時間為2 min。最佳誘變條件下對土曲霉KYK-031 進行亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變,比單一誘變的正突變率更高。進行三輪亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后,篩選出一株衣康酸高產(chǎn)菌株KYK-1035,搖瓶發(fā)酵衣康酸產(chǎn)量水平為73.7 g/L,比出發(fā)菌株(41.8 g/L)提高了76.3%,糖酸轉(zhuǎn)化率為63.4%。對KYK-1035 菌株進行遺傳穩(wěn)定性驗證,該菌株穩(wěn)定性良好,為今后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。后期將繼續(xù)對該菌株進行逐步放大優(yōu)化,使其作為生產(chǎn)菌株更適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。

    猜你喜歡
    亞硝基突變率致死率
    低毒高效空倉煙霧殺蟲技術(shù)應(yīng)用探究
    基于有限突變模型和大規(guī)模數(shù)據(jù)的19個常染色體STR的實際突變率研究
    遺傳(2021年10期)2021-11-01 10:30:08
    內(nèi)源性NO介導(dǎo)的Stargazin亞硝基化修飾在腦缺血再灌注后突觸可塑性中的作用及機制
    臺灣致死率升至5.2%
    南寧市1 027例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果分析
    非小細(xì)胞肺癌E19-Del、L858R突變臨床特征分析
    端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子熱點突變的ARMS-LNA-qPCR檢測方法建立
    月圓之夜車禍致死率高
    S. longicaudum X—7線蟲對草坪地下害蟲小云斑鰓金龜幼蟲的致病力
    L-精氨酸高產(chǎn)菌株的亞硝基胍誘變選育和種子培養(yǎng)基的優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:08
    成人av一区二区三区在线看| 中文字幕熟女人妻在线| 成人性生交大片免费视频hd| 中文在线观看免费www的网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 我要看日韩黄色一级片| 亚洲成人久久爱视频| 日韩欧美在线二视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | bbb黄色大片| 老司机福利观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩精品中文字幕看吧| 少妇被粗大猛烈的视频| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产探花极品一区二区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本免费a在线| 美女 人体艺术 gogo| 免费人成在线观看视频色| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆国产av国片精品| 十八禁国产超污无遮挡网站| 999久久久精品免费观看国产| 热99在线观看视频| 久久久久国内视频| 九色国产91popny在线| 婷婷亚洲欧美| 精品国产三级普通话版| 88av欧美| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品人妻1区二区| 搡老岳熟女国产| 一进一出好大好爽视频| 国产成年人精品一区二区| 长腿黑丝高跟| 久久久久久国产a免费观看| 天堂√8在线中文| 极品教师在线免费播放| 偷拍熟女少妇极品色| 天美传媒精品一区二区| 午夜福利在线观看吧| 国产麻豆成人av免费视频| 老女人水多毛片| 国产视频一区二区在线看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 91av网一区二区| 亚洲av一区综合| 国产视频内射| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 嫩草影院新地址| 色视频www国产| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久精品国产自在天天线| 51午夜福利影视在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 一区福利在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品国产亚洲在线| 精品久久久久久久久av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日韩欧美免费精品| 国产单亲对白刺激| 免费av不卡在线播放| 国产精品av视频在线免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 在线播放国产精品三级| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久九九精品影院| 亚洲三级黄色毛片| ponron亚洲| 国产成人福利小说| 欧美3d第一页| av福利片在线观看| 久久精品影院6| 一进一出抽搐动态| 伊人久久精品亚洲午夜| 在线免费观看的www视频| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美日本视频| 亚洲片人在线观看| 久久久色成人| 91九色精品人成在线观看| 午夜免费成人在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲不卡免费看| 欧美日韩综合久久久久久 | 午夜a级毛片| 天天躁日日操中文字幕| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品一区二区三区人妻视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 免费人成在线观看视频色| 熟女电影av网| 欧美一区二区国产精品久久精品| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人永久免费在线观看视频| 国产主播在线观看一区二区| 欧美色视频一区免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本五十路高清| 制服丝袜大香蕉在线| 99久国产av精品| 日韩有码中文字幕| 免费看光身美女| 午夜a级毛片| 日韩高清综合在线| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 69人妻影院| 国产成人啪精品午夜网站| 久久国产精品影院| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费黄网站久久成人精品 | 成人av在线播放网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩欧美国产一区二区入口| 男女视频在线观看网站免费| 99精品在免费线老司机午夜| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 中文字幕高清在线视频| 午夜a级毛片| 毛片女人毛片| 欧美乱色亚洲激情| 97超视频在线观看视频| xxxwww97欧美| 99视频精品全部免费 在线| 变态另类丝袜制服| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产三级黄色录像| 精品日产1卡2卡| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美乱妇无乱码| 国产亚洲精品av在线| 欧美bdsm另类| 美女 人体艺术 gogo| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 天堂√8在线中文| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 深爱激情五月婷婷| 在线看三级毛片| 国产在视频线在精品| eeuss影院久久| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美一区二区亚洲| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 婷婷亚洲欧美| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美黑人巨大hd| 最新在线观看一区二区三区| 美女被艹到高潮喷水动态| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 搡老岳熟女国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 岛国在线免费视频观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜两性在线视频| 色在线成人网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美乱妇无乱码| av黄色大香蕉| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品久久视频播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品一区二区免费观看| 久99久视频精品免费| 搞女人的毛片| 变态另类丝袜制服| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费搜索国产男女视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲一区高清亚洲精品| 女同久久另类99精品国产91| 一级毛片久久久久久久久女| 免费人成在线观看视频色| 欧美在线黄色| av女优亚洲男人天堂| 99国产精品一区二区三区| 国产精品,欧美在线| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲内射少妇av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 日韩av在线大香蕉| 韩国av一区二区三区四区| 欧美午夜高清在线| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲自拍偷在线| 禁无遮挡网站| 国产伦在线观看视频一区| 99热只有精品国产| 中文字幕免费在线视频6| 1000部很黄的大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线国产一区二区在线| 欧美精品国产亚洲| 日本在线视频免费播放| 国产野战对白在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 熟女电影av网| 欧美黑人巨大hd| netflix在线观看网站| 欧美午夜高清在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美一区二区精品小视频在线| 成人午夜高清在线视频| 看黄色毛片网站| 亚洲av.av天堂| 首页视频小说图片口味搜索| 嫩草影视91久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 9191精品国产免费久久| 色哟哟·www| 亚洲第一电影网av| 成人三级黄色视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美日本视频| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲第一电影网av| avwww免费| 51国产日韩欧美| 国产精品98久久久久久宅男小说| 深爱激情五月婷婷| 色综合婷婷激情| 国产91精品成人一区二区三区| 日本黄色片子视频| 嫩草影视91久久| 亚洲欧美清纯卡通| 一级黄色大片毛片| 夜夜爽天天搞| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久精品综合一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 88av欧美| 日韩欧美在线二视频| 国产三级在线视频| 一进一出抽搐动态| 91久久精品电影网| 日本一二三区视频观看| 亚洲av二区三区四区| 成年女人永久免费观看视频| 午夜福利成人在线免费观看| 悠悠久久av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产精品不卡视频一区二区 | 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久国产精品影院| 久久精品国产自在天天线| 最近最新免费中文字幕在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 舔av片在线| 国产日本99.免费观看| 在线播放无遮挡| 日韩欧美国产一区二区入口| 性色av乱码一区二区三区2| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日本熟妇午夜| 一区福利在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产在视频线在精品| 亚洲精品在线美女| 免费高清视频大片| 国产中年淑女户外野战色| 少妇高潮的动态图| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文字幕av在线有码专区| 宅男免费午夜| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲五月婷婷丁香| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲精品影视一区二区三区av| 91在线观看av| 极品教师在线免费播放| 人人妻人人看人人澡| 精品午夜福利在线看| 久久伊人香网站| 成人三级黄色视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 国产美女午夜福利| 身体一侧抽搐| 国产淫片久久久久久久久 | 成人午夜高清在线视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久国产乱子免费精品| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 两人在一起打扑克的视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲精品日韩av片在线观看| 露出奶头的视频| 99热这里只有是精品在线观看 | 欧美一区二区亚洲| 色综合欧美亚洲国产小说| av福利片在线观看| 哪里可以看免费的av片| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 毛片一级片免费看久久久久 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 特级一级黄色大片| 午夜a级毛片| 一级作爱视频免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 简卡轻食公司| 成人国产一区最新在线观看| 三级毛片av免费| 日韩欧美 国产精品| 禁无遮挡网站| 欧美日韩黄片免| 一本久久中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 嫩草影院入口| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲色图av天堂| 男女之事视频高清在线观看| 国产毛片a区久久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 国产成人影院久久av| 伦理电影大哥的女人| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久久九九精品影院| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 天天躁日日操中文字幕| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精华国产精华精| 白带黄色成豆腐渣| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲欧美日韩东京热| 一个人免费在线观看电影| 国产免费男女视频| 欧美成人性av电影在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 成人午夜高清在线视频| 国产乱人伦免费视频| 男女视频在线观看网站免费| av天堂中文字幕网| 毛片女人毛片| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩亚洲欧美综合| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲第一区二区三区不卡| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品国产亚洲在线| 久久久久久久午夜电影| 国产色婷婷99| 九色成人免费人妻av| 中文字幕久久专区| 床上黄色一级片| 怎么达到女性高潮| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产午夜精品论理片| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品免费久久久久久久清纯| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲色图av天堂| 在线观看午夜福利视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 毛片女人毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 三级毛片av免费| 最好的美女福利视频网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲激情在线av| 淫妇啪啪啪对白视频| 十八禁网站免费在线| 国产探花在线观看一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 超碰av人人做人人爽久久| 老司机深夜福利视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成年版毛片免费区| 禁无遮挡网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品无人区乱码1区二区| 日本五十路高清| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产真实伦视频高清在线观看 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 亚洲中文字幕日韩| 国产人妻一区二区三区在| 大型黄色视频在线免费观看| 国产69精品久久久久777片| 五月伊人婷婷丁香| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品色激情综合| 日日摸夜夜添夜夜添小说| a级毛片a级免费在线| 韩国av一区二区三区四区| 天美传媒精品一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 嫩草影院精品99| 99国产精品一区二区三区| 欧美黑人巨大hd| 熟女电影av网| 美女 人体艺术 gogo| 久久国产乱子免费精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产私拍福利视频在线观看| 免费人成在线观看视频色| 嫩草影院精品99| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日本黄色视频三级网站网址| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品亚洲美女久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99精品久久久久人妻精品| 波多野结衣高清无吗| 身体一侧抽搐| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 无遮挡黄片免费观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色吧在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 免费看光身美女| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品国产亚洲在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 美女免费视频网站| 级片在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 我的老师免费观看完整版| 两人在一起打扑克的视频| 欧美bdsm另类| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久久国内视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久国产乱子免费精品| 男女那种视频在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久久色成人| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久精品国产亚洲av天美| 国产成年人精品一区二区| 91在线观看av| 久久久久国内视频| 91字幕亚洲| 色av中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲av成人av| 搞女人的毛片| 一本一本综合久久| 午夜影院日韩av| 天堂影院成人在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产黄片美女视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲自拍偷在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 有码 亚洲区| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产淫片久久久久久久久 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产高潮美女av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 嫩草影视91久久| 简卡轻食公司| 日韩精品青青久久久久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲精品一区av在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 精华霜和精华液先用哪个| 国内精品久久久久久久电影| 精品一区二区三区人妻视频| 最近最新免费中文字幕在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品1区2区在线观看.| bbb黄色大片| 色噜噜av男人的天堂激情| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本a在线网址| 欧美三级亚洲精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 18+在线观看网站| 亚洲精华国产精华精| 97碰自拍视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 我要看日韩黄色一级片| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久性生活片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜老司机福利剧场| 人人妻人人澡欧美一区二区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩中文字幕欧美一区二区| 色视频www国产| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文资源天堂在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩欧美 国产精品| 色av中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 国产老妇女一区| 美女 人体艺术 gogo| 香蕉av资源在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 99riav亚洲国产免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 十八禁国产超污无遮挡网站| 男女之事视频高清在线观看| 日本黄大片高清| 中出人妻视频一区二区| 色哟哟·www| 看十八女毛片水多多多| 很黄的视频免费| 精品乱码久久久久久99久播| 中文字幕高清在线视频| 十八禁人妻一区二区| 色在线成人网| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日韩精品青青久久久久久| 国产综合懂色| 一个人免费在线观看电影| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品永久免费网站| 亚洲无线在线观看| 一区二区三区激情视频| 一级av片app| 国产av不卡久久| 黄色日韩在线| 欧美3d第一页| 一二三四社区在线视频社区8| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲激情在线av| 国产探花极品一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美高清成人免费视频www| 十八禁人妻一区二区| av中文乱码字幕在线| av黄色大香蕉| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 在线观看午夜福利视频| 村上凉子中文字幕在线| 欧美潮喷喷水| 一区二区三区免费毛片| 少妇人妻一区二区三区视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一区二区三区免费毛片| 美女大奶头视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲五月天丁香| 深夜a级毛片| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲五月天丁香| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人欧美大片| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品成人久久久久久|