基因修飾骨組織工程技術(shù)研究進(jìn)展

許杰男 喬永杰 鄒慶芳 馬東洋

骨組織工程技術(shù)的三大要素為生物支架、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子，其中生長(zhǎng)因子的應(yīng)用方式主要為重組蛋白和基因修飾。重組蛋白應(yīng)用是將成骨相關(guān)蛋白與支架復(fù)合后植入體內(nèi)，其操作簡(jiǎn)單，不足之處在于價(jià)格昂貴且生物半衰期短，通常需要大劑量應(yīng)用以維持長(zhǎng)時(shí)間的作用，且超劑量外源性蛋白可導(dǎo)致異位成骨、毒性反應(yīng)，甚至癌癥的發(fā)生[1]?；蛐揎椆墙M織工程（GMBTE）是將目的基因?qū)敕N子細(xì)胞內(nèi)，利用細(xì)胞作為生長(zhǎng)因子的發(fā)生器，使生長(zhǎng)因子持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)，此方式有望實(shí)現(xiàn)有效濃度下生長(zhǎng)因子的持續(xù)局部表達(dá)[2]。由于可克服局部應(yīng)用重組蛋白的缺點(diǎn)，GMBTE 在骨缺損修復(fù)重建治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

本文圍繞GMBTE 目的基因選擇、載體選擇以及基因投遞方式進(jìn)行綜述，旨在為GMBTE 的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 目的基因選擇

GMBTE 目的基因一般為表達(dá)生長(zhǎng)因子的基因或調(diào)控生長(zhǎng)因子表達(dá)的基因，靶基因通過(guò)表達(dá)生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)分泌。

1.1 表達(dá)生長(zhǎng)因子的基因

GMBTE 靶基因表達(dá)的生長(zhǎng)因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）- 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等。BMP 屬于TGF- 超家族的分泌信號(hào)因子，在骨修復(fù)再生的所有階段都發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7 和BMP-9 的成骨能力較強(qiáng)[3]。VEGF 是功能最強(qiáng)大的促血管生成發(fā)育的生長(zhǎng)因子，也可以通過(guò)趨化和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化來(lái)加速骨愈合[4]。上述生長(zhǎng)因子基因以互補(bǔ)DNA（cDNA）或化學(xué)修飾信使RNA（mRNA）的形式應(yīng)用于GMBTE 中，可在不同程度上提高骨缺損的治療效果。

此外，多基因聯(lián)合修飾擁有良好的協(xié)同作用，可在體內(nèi)顯著提高骨修復(fù)作用。負(fù)載共表達(dá)BMP-2 和FGF-2 的膠原支架可通過(guò)激活Smad 信號(hào)通路和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶（ERK）信號(hào)通路，共同促進(jìn)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)轉(zhuǎn)錄以增強(qiáng)成骨[5]。BMP 和VEGF 分別是骨生成和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，BMP-2和VEGF雙基因遞送支架可顯著促進(jìn)血管化骨再生[6]。多基因修飾存在一定局限性，需進(jìn)一步研究不同基因比例對(duì)骨缺損修復(fù)效果的影響。

1.2 調(diào)控生長(zhǎng)因子表達(dá)的基因

調(diào)控生長(zhǎng)因子表達(dá)的基因應(yīng)用于骨組織工程技術(shù)時(shí)，可作為調(diào)控因子來(lái)調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)，主要包括轉(zhuǎn)錄因子Runx2[7]與Osterix（Osx）、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)、信號(hào)素3A[8]、含LIM 結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸富集蛋白1[9]和微RNA (miRNA)等。Runx2 是BMP 信號(hào)通路下游端的轉(zhuǎn)錄因子，其過(guò)表達(dá)可上調(diào)非成骨細(xì)胞中多個(gè)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)；而Osx 是一種含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，作用于Runx2 信號(hào)通路下游。Runx2 和Osx 對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨形成均至關(guān)重要。HIF 可啟動(dòng)血管生成-成骨級(jí)聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，HIF 作為上游調(diào)節(jié)因子可激活包括TGF-β、血管生成素1、干細(xì)胞因子和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子等數(shù)百個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄[10]。miRNA 是小型非編碼RNA，其發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確，可能是通過(guò)抑制特定mRNA 來(lái)調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程。眾多研究表明，miRNA 在成骨分化和骨再生中發(fā)揮重要作用[11-12]，是當(dāng)前GMBTE 中靶基因研究的熱點(diǎn)。

2 構(gòu)建載體選擇

GMBTE 技術(shù)需要將靶基因?qū)敕N子細(xì)胞并在較高水平持續(xù)表達(dá)一段時(shí)間，為了攜帶基因以及保護(hù)基因免受核酸酶和基因負(fù)電荷的影響，外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞通常需要借助載體。

2.1 病毒載體

病毒載體是將病毒的致病基因去除，保留其成骨或成血管基因。常見(jiàn)的病毒載體包括腺病毒（Ad）載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）載體、慢病毒(LV)載體和腺相關(guān)病毒(AAV)載體等。Ad 載體的基因轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平較高，是最早應(yīng)用于基因修飾的載體之一[13]。Ad 載體介導(dǎo)BMP[14-17]和HIF-1α[10]等基因可成功轉(zhuǎn)入種子細(xì)胞并獲得包括目的基因、相關(guān)mRNA 和蛋白質(zhì)的高表達(dá)。Ad 載體攜帶的基因組游離于宿主基因組外獨(dú)立表達(dá)，體內(nèi)表達(dá)時(shí)間只有6 周左右，但足以誘導(dǎo)骨形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并可避免長(zhǎng)期分泌蛋白產(chǎn)生的不良反應(yīng)。RV載體可將外源基因整合到細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)靶基因永久的高水平表達(dá)，宿主細(xì)胞后代也可持續(xù)表達(dá)靶基因[18]。LV 是一種能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞的特殊逆轉(zhuǎn)錄病毒[19]。通過(guò)LV 載體可將 防御素3 和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子成功轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定，并可獲得目的基因的高表達(dá)[20]。AAV 載體攜帶的基因不會(huì)整合到宿主基因組，即使在高載體劑量下，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染也是相當(dāng)安全的。但是，AAV 載體的制造成本高且純度較低，若能克服這些缺點(diǎn)，其可成為GMBTE 最理想的載體。

病毒載體通常有進(jìn)入細(xì)胞的自然傾向，因具有高轉(zhuǎn)染效率成為GMBTE 中最常見(jiàn)的選擇，但其安全問(wèn)題應(yīng)引起重視，如Ad 載體可引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和毒性反應(yīng)[21]，RV 載體有激活細(xì)胞原癌基因而引發(fā)腫瘤的可能[18]，LV 載體也被報(bào)道可引起造血干細(xì)胞的惡性克隆擴(kuò)增[22]。為了提高載體安全性，學(xué)者們采用消除載體中的病毒基因并使用特異性啟動(dòng)子減少細(xì)胞反應(yīng)的方法[23]。近期，Bougioukli 等[24]將激活線(xiàn)粒體凋亡途徑的誘導(dǎo)型半胱天冬酶9 基因插入LV-BMP-2 中，二聚化的化學(xué)誘導(dǎo)劑激活后可選擇性地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞凋亡，阻斷骨形成。這種“自殺”式時(shí)空調(diào)控，可降低基因修飾相關(guān)不良反應(yīng)和載體誘變基因突變的發(fā)生可能。

2.2 非病毒載體

非病毒載體具有制備簡(jiǎn)單、免疫原性低和毒性低的優(yōu)點(diǎn)，通?？煞譃槲锢磔d體和化學(xué)載體。

2.2.1 非病毒化學(xué)載體

非病毒化學(xué)載體一般由基因與聚合物、脂質(zhì)體或無(wú)機(jī)納米粒子等組合而成。

聚乙烯亞胺(PEI)及其衍生物是體內(nèi)和體外都有效的轉(zhuǎn)染劑，被廣泛應(yīng)用于 GMBTE 中。PEI 是一種強(qiáng)大的陽(yáng)離子聚合物，可通過(guò)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，促進(jìn)基因內(nèi)小體逃逸及DNA 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，被作為評(píng)價(jià)其他非病毒載體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但PEI 會(huì)破壞細(xì)胞膜而引起細(xì)胞毒性。近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高鈣濃度下可溶性PEI 相互聚集，從而減少了破壞細(xì)胞膜的游離PEI，降低了PEI 的細(xì)胞毒性；同時(shí)，鈣離子濃度為10 mmol/L 時(shí)可增強(qiáng)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，提高PEI 轉(zhuǎn)染效率[25]。

脂質(zhì)體可與細(xì)胞膜相融合，介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。Nishikawa 等[26]對(duì)比了脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體-RNA 和RV-DNA 3 種轉(zhuǎn)染方式，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體-RNA 與RV-DNA 的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，但脂質(zhì)體-RNA 轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)時(shí)間更早，表達(dá)細(xì)胞數(shù)更多。脂質(zhì)體-RNA 轉(zhuǎn)染具有與病毒載體轉(zhuǎn)染相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效率，具有較高的安全性，同時(shí)其對(duì)目的基因片段大小和靶細(xì)胞生理狀態(tài)的限制較低，是一種簡(jiǎn)單快捷的轉(zhuǎn)染方式。

2.2.2 非病毒物理載體

非病毒物理載體技術(shù)主要包括基因槍法、聲穿孔法、電穿孔法和磁轉(zhuǎn)染法等。

基因槍法又稱(chēng)生物彈道技術(shù)或微粒轟擊技術(shù)，其利用微粒加速裝置，將載有基因的重金屬元素顆粒打入細(xì)胞或組織。聲穿孔法和電穿孔法可提高細(xì)胞膜滲透性，以增加基因進(jìn)入細(xì)胞的效率。Kawai 等[1]將BMP-2/7基因通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)移到大鼠牙周組織中，于轉(zhuǎn)染后第3 天檢測(cè)到2 種基因的表達(dá)，第5 天檢測(cè)到牙槽部位的新骨形成。電穿孔法和聲穿孔法作為物理載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞已經(jīng)得到廣泛研究，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，電穿孔法的轉(zhuǎn)染效率更高且更為穩(wěn)定，而聲穿孔法對(duì)組織細(xì)胞的侵入性小，更為安全。

近年來(lái)，肽修飾物因穿過(guò)細(xì)胞膜能力強(qiáng)被廣泛用于藥物遞送系統(tǒng)的研究中，其可負(fù)載多種大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮作用，肽修飾的非病毒載體[6,12,27]和病毒載體[28]等新型載體同樣在GMBTE 中展現(xiàn)出巨大潛力。細(xì)胞穿透肽是一類(lèi)較小的短多肽序列，具有高穿透活性和穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，為GMBTE 更安全地應(yīng)用提供了可能性[29]。

未來(lái)的載體開(kāi)發(fā)將不斷優(yōu)化病毒載體的安全性和非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，理想載體應(yīng)為高轉(zhuǎn)染效率、低毒性和無(wú)免疫原性的合理統(tǒng)一。

3 基因投遞方式

GMBTE 的核心問(wèn)題是如何將基因載體導(dǎo)入宿主骨缺損部位進(jìn)行過(guò)表達(dá)，按其投遞方式可分為體內(nèi)基因投遞和體外基因投遞。

3.1 體內(nèi)基因投遞

體內(nèi)基因投遞是將基因載體直接注射入宿主體內(nèi)。此方式操作簡(jiǎn)單、成本低廉，并可避免因采集自體細(xì)胞引起的相關(guān)并發(fā)癥。Betz 等[30]開(kāi)展研究將Ad-BMP-2 經(jīng)皮注射到病灶內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可在8 周內(nèi)誘導(dǎo)大鼠5 mm 股骨缺損愈合，修復(fù)組織是以骨小梁為主的礦化骨。Ishihara 等[31]對(duì)直接注射Ad-BMP-2 與細(xì)胞介導(dǎo)的Ad-BMP-2 兩種方式治療馬肋骨骨缺損進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)組能更有效地促進(jìn)骨生成，這可能是因?yàn)榧?xì)胞介導(dǎo)組擁有較高的轉(zhuǎn)染效率，且可增加骨缺損部位的細(xì)胞密度，而這些顯然是直接注射基因載體復(fù)合物所欠缺的。直接注射法還存在基因載體從植入部位擴(kuò)散而造成異位骨化或安全隱患的問(wèn)題。

為了避免或減輕基因和載體的異位擴(kuò)散，可將載體附著在基因活化基質(zhì)(GAM)上來(lái)完成體內(nèi)基因投遞。GAM 可保護(hù)基因免受細(xì)胞外屏障的攻擊，包括免疫系統(tǒng)的攻擊和血清核酸酶或蛋白酶的降解。Zhang 等[32]開(kāi)發(fā)了一種高度穩(wěn)定、無(wú)毒性作用且編碼BMP-2 的化學(xué)修飾RNA（cmRNA），當(dāng)將其加載到膠原海綿中時(shí)可持續(xù)釋放cmRNA。他們開(kāi)展的體內(nèi)研究證明，cmRNA 組骨缺損區(qū)擁有更成熟的骨結(jié)構(gòu)，且存在軟骨內(nèi)骨化過(guò)程。有學(xué)者對(duì)BMP-2質(zhì)粒投遞方式采用GAM 形式還是細(xì)胞介導(dǎo)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在基因投遞過(guò)程中，目的基因的產(chǎn)生量及產(chǎn)生時(shí)間對(duì)骨形成的作用比靶細(xì)胞的存在更為重要[33]，因此細(xì)胞接種或許不是轉(zhuǎn)基因表達(dá)的必要條件。

體內(nèi)基因投遞的發(fā)展仍需克服很多障礙，因?yàn)樗拗魈囟ń馄什课坏募?xì)胞種類(lèi)較多，基因轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞的難度較大，故此方式的轉(zhuǎn)染效率低且存在基因異位表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，體內(nèi)基因投遞需要受損部位的細(xì)胞數(shù)量充足，故不適用于大段骨缺損和大面積軟組織缺損的情況。

3.2 體外基因投遞

3.2.1 常規(guī)體外基因投遞

GMBTE 中的常規(guī)體外基因投遞是在體外將基因載體轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞擴(kuò)增后植入宿主體內(nèi)。由于可對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行選擇和測(cè)試，故此方式轉(zhuǎn)染效率高、可控性強(qiáng)且相對(duì)安全，是最常用的基因投遞方式。

Fan 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2 轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）可促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化作用，并分泌更多含鈣離子成分的細(xì)胞外基質(zhì)；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染基因組的炎性細(xì)胞明顯減少，支架消失，且血管生成。常規(guī)體外基因投遞需要進(jìn)行2 次手術(shù)和侵入性細(xì)胞采集，并需要在良好的生產(chǎn)規(guī)范設(shè)施下培養(yǎng)和擴(kuò)增細(xì)胞，這些步驟增加了成本和時(shí)間，且細(xì)胞特性發(fā)生變化和植入污染的風(fēng)險(xiǎn)也較高。

3.2.2 快速體外基因投遞

為了克服常規(guī)體外基因投遞的缺點(diǎn)，學(xué)者們開(kāi)發(fā)了快速體外基因投遞方式。

快速體外基因投遞是將基因轉(zhuǎn)染于組織而非單一的特定細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因組織為可生物降解的肌肉碎片[35]、脂肪碎片[36]、骨髓細(xì)胞[37]等，此方法因無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增，而使時(shí)間和成本均明顯減少。Virk 等[38]開(kāi)發(fā)了一種“當(dāng)日”快速體外基因投遞技術(shù)，即組織碎片的獲取、轉(zhuǎn)染和重新植入在1 次手術(shù)中完成。他們將大鼠骨髓細(xì)胞和LV-BMP-2 共培養(yǎng)1 h 后回植到大鼠骨缺損處，手術(shù)時(shí)間小于3 h。“當(dāng)日”組手術(shù)后8 周時(shí)，骨缺損完全愈合，與傳統(tǒng)組相比，其骨愈合時(shí)間更早，新生骨體積更大。與此不同，Bougioukli 等[37]分別采用快速體外基因投遞法與常規(guī)體外基因投遞法治療裸鼠臨界骨缺損，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)“兩步”組（采用常規(guī)體外基因投遞法）擁有更高的愈合率和新生骨質(zhì)量。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)后的骨髓細(xì)胞與新鮮分離的骨髓細(xì)胞體內(nèi)存活情況、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間不盡相同。

快速體外基因投遞法可能在較大的骨缺損治療中失敗，而失敗的代價(jià)往往是截肢，所以快速體外基因投遞法有必要進(jìn)一步完善。

4 展望

盡管GMBTE 已取得諸多進(jìn)展，但尚未真正應(yīng)用于臨床，基因修飾可能帶來(lái)的不良反應(yīng)尚需要進(jìn)一步優(yōu)化。編碼生長(zhǎng)因子基因的單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)取得眾多研究成果，miRNA 作為新的治療靶點(diǎn)展現(xiàn)出巨大潛力，但其骨再生作用的相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。載體的選擇多種多樣，各有優(yōu)劣，而新型載體（如細(xì)胞穿透肽）的研究剛剛起步，有望成為GMBTE 中最理想的載體。縱觀基因?qū)爰?xì)胞方式，從早期的基因載體直接皮下注射，到近年來(lái)基因載體復(fù)合支架或GAM 方式，GMBTE 技術(shù)逐漸成熟并在骨缺損治療中取得良好效果，而快速基因投遞為GMBTE 提供了新思路。未來(lái)GMBTE 技術(shù)靶基因的選擇需要針對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行個(gè)性化選擇，載體構(gòu)建和基因投遞方式需要兼顧安全性和轉(zhuǎn)染效率。

骨組織形成是復(fù)雜的級(jí)聯(lián)事件，涉及受損部位多因子的時(shí)間依賴(lài)性表達(dá)，因此基因表達(dá)的時(shí)間、空間和水平調(diào)控變得尤為重要。生物支架和GAM的設(shè)計(jì)應(yīng)模擬自然骨再生過(guò)程以促進(jìn)骨組織再生。此外，時(shí)空調(diào)控還可通過(guò)基因開(kāi)關(guān)系統(tǒng)如上述的“自殺式”時(shí)空調(diào)控系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。隨著GMBTE 研究的進(jìn)展，其有望應(yīng)用于臨床，為骨缺損修復(fù)重建帶來(lái)新的希望。