宮頸癌及宮頸癌前病變組織中DEPDC1、miR-216a-5p的表達及其與高危型HPV感染的相關性

李穎，王佩紅，郭鳳，張婷，杜偉平，陳菊華，孫俊

1.漢中市中心醫(yī)院婦科，陜西 漢中 723000；

2.延安大學附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 延安 716000

在女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤是宮頸癌，雖然隨著宮頸癌篩查和疫苗接種的普及，宮頸癌的發(fā)病率逐漸下降，但每年仍有不少女性死于宮頸癌[1]。宮頸癌的治療仍局限于放化療以及手術，而且由于宮頸癌的早期癥狀并不明顯，所以大多數(shù)人確診時已是晚期[2]。人乳頭瘤病毒(HPV)可感染宮頸轉化區(qū)的基底上皮細胞，使其增殖，導致上皮增生或乳頭狀瘤病[3]。宮頸癌的發(fā)展與高危(HR)HPV 感染之間存在密切的關系[4]。因此，臨床迫切需要深入了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找新的分子靶點，以改善宮頸癌患者的早期確診。DEP 結構域蛋白1(DEPDC1)是在許多物種中高度保守的蛋白質[5]。它首先被報道在膀胱癌中異常上調，并在膀胱癌細胞的生長中發(fā)揮重要作用[6]。已在多種類型的癌癥中觀察到DEPDC1 表達呈異常上調，高水平的DEPDC1與癌癥進展密切相關，包括乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌，并且對于預測多發(fā)性骨髓瘤、肝細胞癌和肺癌患者的預后具有重要價值[7]。微小RNA(miRNA)是具有17~25 個核苷酸的小的非編碼RNA，其參與腫瘤發(fā)生[8]。MiR-216a-5p 已被證實是許多癌癥的腫瘤抑制因子[9]。miR-216a-5p 可以部分抑制HCP5 對宮頸癌細胞增殖的促進作用[10]。本研究旨在探討DEPDC1、miR-216a-5p 在宮頸癌及宮頸癌前病變組織中的表達及其與高危型HPV感染的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年12月至2022年4月漢中市中心醫(yī)院婦科收治的94 例宮頸病變患者為研究對象，其中62例宮頸癌前病變患者的宮頸病變組織納入癌前病變組，年齡22~45歲，平均(38.50±5.44)歲；體質量46~71 kg，平均(59.50±7.05)kg。32例宮頸癌患者的癌組織納入宮頸癌組，年齡22~46歲，平均(39.50±5.46)歲；體質量46~73 kg，平均(61.14±7.52)kg。同期選擇因患子宮肌瘤行子宮全切患者的正常宮頸組織30例作為對照組，年齡23~48 歲，平均(39.00±5.42)歲；體質量45~71 kg，平均(60.00±7.32)kg。三組受檢者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)癌前病變和宮頸癌患者均經(jīng)過手術病理確診。(2)對照組經(jīng)MRI 檢查及臨床確診為子宮肌瘤并住院行全子宮切除術。排除標準：(1)正在接收放化療者；(2)患有其他惡性腫瘤者；(3)合并心血管疾病、腎臟、肝臟疾病者；(4)無法正常交流的精神疾病患者；(5)處于妊娠期或者哺乳期者。本研究經(jīng)漢中市中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均知情并自愿簽署研究同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測宮頸組織miR-216a-5p 和DEPDC1 的表達水平 使用TRIzol 試劑(賽默飛世爾科技，貨號：15596018)提取術中獲取的組織總RNA。使用HiScript?ⅡQ RT SuperMix 試劑盒(上海信裕生物科技有限公司，貨號：XYR222)進行逆轉錄后，使用通用SYBR Green iTaq(上海恪敏生物科技有限公司，貨號：1725121)進行qRT-PCR。DEPDC1、miR-216a-5p的表達水平用2-ΔΔCt計算方法。GAPDH 和U6 分別作為基因的內參。由廣州日博生物科技有限公司合成引物，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.2 免疫組化檢測組織中DEPDC1 表達 采用免疫組化法進行組織DEPDC1蛋白表達的測定，各組織樣品分別切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2室溫處理10 min 后用蒸餾水清洗4 遍，滴加封閉液室溫下孵育15 min。加入一抗，4℃孵育過夜，沖洗；加入二抗(山羊抗兔lgG)37℃30 min；DAB顯色，蘇木素輕度復染，最后分化，封片進行鏡檢。免疫組化檢測試劑盒貨號為EY-24704，購自上海一研生物科技有限公司。判定方法為半定量評分法，當DEPDC1表現(xiàn)棕黃色則為陽性表達。染色指數(shù)(staining index，SI)為陽性細胞×染色強度比例。陽性細胞比例<25%：0 分，25%~50%：1 分，51%~75%：2 分，>75%：3 分。染色強度：無染色0 分，弱染色(淺黃色)：1 分，中染色(黃褐色)：2分，強染色(棕褐色)：3分。3名專業(yè)人員對結果進行評分，SI≤3分為陰性，SI>3分為陽性，總分為0~9分。

1.2.3 HR-HPV檢測 采集所有患者陰道宮頸脫落細胞行陰道鏡檢查，檢測HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68 等13 個HPVE6/E7 mRNA片段的高危亞型。使用Quanti Virus?HPV E6/E7 mRNA 診斷試劑盒檢測HR-HPV狀況。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS25.0軟件分析本研究數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以均值±標準差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；三組間的較采用單因素方差分析，使用SNK-q檢驗進一步兩兩比較。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。采用Pearson 法分析癌前病變組、宮頸癌組患者宮頸組織中DEPDC1 和miR-216a-5p 表達水平的相關性；采用Spearman 法分析DEPDC1和miR-216a-5p表達水平與癌前病變組以及宮頸癌組HR-HPV 感染的相關性。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的DEPDC1 蛋白表達水平比較 對照組、癌前病變組、宮頸癌組患者的DEPDC1陽性表達率分別為36.67% (11/30)、40.32% (25/62)、100.00%(32/32)，與對照組比較，癌前病變組、宮頸癌組患者的DEPDC1陽性表達率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DEPDC1在宮頸組織中的表達見圖1。

圖1 DEPDC1在宮頸組織中的表達(標尺：50 μm)Figure 1 Expression of DEPDC1 in cervical tissues(scale plate:50 μm)

2.2 三組宮頸組織中DEPDC1 和miR-216a-5p表達水平和HR-HPV 感染情況比較 與對照組比較，癌前病變組、宮頸癌組的DEPDC1 表達水平依次升高，miR-216a-5p表達水平依次降低，HPV感染率依次升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p表達水平和HR-HPV感染情況比較[，例(%)]Table 2 Expression levels of DEPDC1 and miR-216a-5p and HR-HPV infection in cervical tissues of the three groups[,n(%)]

表2 三組宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p表達水平和HR-HPV感染情況比較[，例(%)]Table 2 Expression levels of DEPDC1 and miR-216a-5p and HR-HPV infection in cervical tissues of the three groups[,n(%)]

注：與對照組比較，aP<0.05；與癌前病變組比較，bP<0.05。Note:Compared with that in the control group,aP<0.05;Compared with that in precancerous lesion group,bP<0.05.

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2.3 癌前病變組、宮頸癌組miR-216a-5p 與DEPDC1 表達水平的相關性 經(jīng)Pearson 相關性分析結果顯示，癌前病變組、宮頸癌組患者宮頸組織中miR-216a-5p與DEPDC1表達水平呈負相關(r=-0.442，P<0.01)，見圖2。

圖2 DEPDC1和miR-216a-5p表達水平相關性Figure 2 Correlation between expression levels of DEPDC1 and miR-216a-5p

2.4 癌前病變組、宮頸癌組宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p 的表達與HR-HPV感染的相關性 以癌前病變組、宮頸癌組所有患者DEPDC1 和miR-216a-5p 表達水平的平均值為界限，即<1.54(n=24)為低表達，≥1.54(n=70)為高表達和<0.79(n=65)為低表達，≥0.79(n=29)為高表達。經(jīng)Spearman 法分析結果顯示，宮頸組織中DEPDC1 表達水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV 感染呈正相關(P<0.05)，miR-216a-5p 表達水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV感染呈負相關(P<0.05)，見表3。

表3 宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p的表達與HR-HPV感染的相關性(例)Table3 Correlation between the expression of DEPDC1 and miR-216a-5p and HR-HPV infection in cervical tissues(n)

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與HR-HPV的持續(xù)感染密切相關[11]。在大多數(shù)HPV感染者中，免疫系統(tǒng)可以清除HPV病毒，而HPV 的持續(xù)感染發(fā)生在10%~15%的患者中，其中大約1%的HR-HPV感染最終會發(fā)展為宮頸癌[12]。

DEPDC1過度表達對幾種不同類型的癌癥具有預后評估價值，表明它具有致癌作用及其作為生物標志物的潛力[13]。肝細胞癌中DEPDC1表達增加與患者生存率低相關，并且DEPDC1 調節(jié)腫瘤增殖和轉移[14]。DEPDC1與E2F1相互作用并增加其轉錄活性，導致前列腺癌細胞中E2F 信號的過度激活，從而影響癌癥進展[15]。先前的研究表明DEPDC1可能作為乳腺癌的早期分子標記，DEPDC1 mRNA 和蛋白表達水平在乳腺癌組織中顯著增強，并觀察到腫瘤分期、腫瘤大小和遠處轉移的逐步增加[6，16]。本研究結果顯示，與對照組比較，癌前病變組、宮頸癌組DEPDC1 的陽性表達率顯著升高，隨著宮頸病變程度的增加，DEPDC1的水平顯著升高，宮頸病變情況也與HR-HPV 感染有關，宮頸癌組HR-HPV感染率最高，宮頸組織中DEPDC1 表達水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV 感染呈正相關關系，提示宮頸病變越嚴重，DEPDC1的表達水平越高，HR-HPV感染率越高，DEPDC1的表達水平與宮頸病變進程及HR-HPV感染有關，表明DEPDC1 的高表達能夠促進癌變作用，進而導致HR-HPV 感染率升高。

miR-216a-5p 通過靶向胰腺癌中的TPT1 來抑制腫瘤發(fā)生，還可靶向TCTN1 以阻止食管鱗狀細胞癌中的細胞增殖[17]。miR-216a-5p 在胰腺癌組織和細胞中被強烈下調，并起到腫瘤抑制因子的作用，其下調與胰腺癌患者的不良預后和轉移密切相關[18]。miR-216a-5p 的過表達可能會抑制細胞增殖和轉移，并降低嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的致瘤性和轉移[19]。miR-216a-5p通過調控乳腺癌和小細胞肺癌中的細胞凋亡家族蛋白促進腫瘤消退[20]。本研究結果顯示，伴隨著宮頸病變程度的增加，miR-216a-5p 水平顯著降低，表明miR-216a-5p 的表達與宮頸病變程度有聯(lián)系。miR-216a-5p 表達水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV 感染呈負相關關系，提示miR-216a-5p的表達水平可以作為監(jiān)測HR-HPV 感染狀況的潛在生物學指標。經(jīng)Pearson相關性分析結果顯示，癌前病變組以及宮頸癌組患者DEPDC1、miR-216a-5p 表達水平呈負相關關系，提示兩者共同參與宮頸病變的發(fā)生有關。

綜上所述，DEPDC1 在癌前病變以及宮頸癌患者宮頸組織中呈高表達，miR-216a-5p呈低表達，兩者負相關，且均與HR-HPV 感染有關，有望成為潛在的宮頸病變生物標志物。由于本次研究樣本數(shù)量較少，后期仍需要大規(guī)模的數(shù)據(jù)進一步研究。