膳食纖維對蔬菜小米面條的類胡蘿卜素生物可及性和酵解特性的影響

高琳琳，鐘亞東，劉歡，胡婕倫

（南昌大學(xué)食品科學(xué)國家重點實驗室，中國-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實驗室（南昌），江西 南昌 330047）

學(xué)齡兒童對能量和營養(yǎng)素的需求量高于成年人，隨著生活水平的提高，我國學(xué)齡兒童的營養(yǎng)健康狀況逐步改善，但也面臨諸多問題[1]。例如食物過度精細化、膳食纖維攝入不足、超重肥胖檢出率不斷上升；用眼過度、兒童近視率不斷上升[2]；每日蛋白攝入不足。在改善上述問題的諸多途徑中，最具可得性、可及性和可負擔性的是通過健康的飲食來干預(yù)。

類胡蘿卜素廣泛存在于各種植物性食物中，賦予植物黃、橙和紅的色澤。天然類胡蘿卜素作為維生素A原對人體健康有益。特定類胡蘿卜素的攝入及其在血液中的濃度與一些慢性疾病的風險降低有關(guān)，如葉黃素在保護和緩解眼部疾病方面發(fā)揮有益作用[3]。對我國兒童維生素A 營養(yǎng)狀況的調(diào)查結(jié)果表明，近年來學(xué)齡兒童胡蘿卜素攝入水平整體有所下降，急需采取措施增加兒童對維生素A 的攝入[4]。每日攝入多種色彩鮮艷的蔬果和雜糧被認為是補充類胡蘿卜素最安全且有效的方式。

膳食纖維（dietary fiber，DF）指含有3 個或3 個以上單體單位的可食用碳水化合物聚合物，可以被特定的腸道菌群代謝并產(chǎn)生一系列有益的功能性代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），促進結(jié)腸對礦物質(zhì)（鈣和鎂）的吸收，改善腸道環(huán)境[5]。4～13 歲兒童膳食纖維的適宜攝入量為25～31 g/d[6]。然而，目前兒童的膳食纖維攝入量遠未達到推薦水平[7]。兒童時期飲食設(shè)計應(yīng)在滿足生長發(fā)育的基礎(chǔ)上，降低成年期飲食相關(guān)慢性疾病的風險。為了從日常飲食中獲得足夠的膳食纖維攝入量，需要額外補充膳食纖維。

面條是我國消費最多的主食，小米、南瓜和胡蘿卜均富含類胡蘿卜素，為獲得更多類胡蘿卜素對健康的益處，本研究制備富含類胡蘿卜素和膳食纖維的蔬菜小米面條，研究不同膳食纖維添加對面條中類胡蘿卜素生物可及性和酵解特性的影響，為改善兒童的維生素A 營養(yǎng)狀況和增加膳食纖維的攝入提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米粉、麥芯粉：朝陽市順和農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；谷朊粉：封丘縣華豐粉業(yè)有限公司；食鹽：四川久大制鹽有限責任公司；凍干胡蘿卜粉、凍干南瓜粉：漳州昌祿食品有限公司；高直鏈玉米淀粉（high-amylose corn starch，HACS）（直鏈＞65%）：美國Kang Biological Products 公司；阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）（含量≥95%）：江蘇瑞誠生物科技有限公司；菊粉、低聚果糖（fructo-oligosaccharides，F(xiàn)OS）、低聚半乳糖（galactose oligosaccharides，GOS）、燕麥β-葡聚糖（oat β-glucan，BG）、阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）、低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）（含量≥95%）：上海洺彧生物科技有限公司；α-淀粉酶（A3175）、胃蛋白酶（P6887）、胰酶（P1750）：美國Sigma 化學(xué)公司；菊粉標準品、淀粉葡萄糖苷酶、總淀粉檢測試劑盒（K-TSTA-100A）：愛爾蘭Megazyme 公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標品、維生素K1、氯化血紅素（均為分析純）：上海阿拉丁公司；蛋白胨：美國Becton Dickinson 公司；酵母膏粉：英國OXOID 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（XS205）、pH 計（FE-28）：瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數(shù)顯恒溫搖床（VOSHINCOS-100B）：無錫沃信儀器有限公司；小型臺式高速離心機（5418R）：德國Eppendorf 公司；全波長多功能酶標儀（Variouskan Flash）：美國Thermo 公司；厭氧手套箱（COY-8300600）：美國COY 公司；滅菌鍋（BXN-30R）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；冷凍干燥機（Free Zone）：美國LABCONCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 小米胡蘿卜南瓜面條的制備

未添加膳食纖維的面條（L）：在前期試驗的基礎(chǔ)上按照比例分別稱取適量的小米粉、麥芯粉、凍干胡蘿卜粉、凍干南瓜粉、谷朊粉和食鹽，緩慢加入適量水攪拌至形成面團，蓋上保鮮膜，在25 ℃醒發(fā)30 min 后，將面團分成小塊裝入自動面條機中，擠壓（2～3 mm 孔徑），水沸后煮3 min 得到熟面條，裝入自封袋冷藏以供后續(xù)試驗使用。

添加膳食纖維的面條：在上述配方的基礎(chǔ)上分別添加8% 菊粉、FOS、GOS、HACS、BG、AG、AX 和XOS，再用同樣的方法制作和儲存，所制得面條依次表示為LI、LFOS、LGOS、LHACS、LBG、LAG、LAX 和LXOS。

1.3.2 面條指標的測定

1.3.2.1 面條熟斷條率的測定

參考周民生等[8]的方法并稍作修改，隨機選取20根直徑2 mm、長20 cm 的面條，水沸后煮3 min 撈出，記錄斷條數(shù)（N），按下列公式計算面條斷條率（X，%）。

X=N/20×100

1.3.2.2 面條感官評定

選15 名經(jīng)過食品感官檢驗培訓(xùn)的人員作為評定人選，水沸騰后，把面條煮3 min 撈出，進行感官評定，結(jié)果以總分表示。面條的感官評價標準[8]見表1。

表1 面條的感官評價標準Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of noodles

1.3.3 面條基本理化性質(zhì)的測定

將制得熟面條經(jīng)冷凍干燥并研磨后得到均一粉末面條樣品，粗蛋白含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分含量的測定參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；粗脂肪含量的測定參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；總淀粉含量的測定參考總淀粉檢測試劑盒中提供的方法。

1.3.4 面條的體外消化特性

1.3.4.1 模擬消化的電解質(zhì)溶液成分

體外消化參考Brodkorb 等[9]的方法并略作修改。模擬口腔消化液（simulated salivary fluid，SSF）、模擬胃液（simulated salivary fluid，SGF）和模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）消化的電解質(zhì)溶液的配制如表2所示。

表2 模擬消化電解質(zhì)溶液配制Table 2 Composition of electrolyte solution for simulated digestion

1.3.4.2 面條的體外模擬消化模型

模擬口腔消化：將5 g 熟面條切成小塊模擬咀嚼，用1 mol/L HCl 溶液將pH 值調(diào)到7 后加入4 mL SSF、25 μL CaCl2·2H2O 溶液、0.5 mL α-淀粉酶（1 500 U/mL，SSF 溶解），最后補充蒸餾水至10 mL，置于搖床中避光振蕩（220 r/min、37 ℃）2 min。

模擬胃消化：模擬口腔消化后的樣品用1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值至3 后加入8mLSGF 和5μLCaCl2·2H2O 溶液，再加入0.5 mL 胃蛋白酶溶液（80 000 U/mL，SGF 溶解），最后加入蒸餾水至20 mL，置于搖床中避光振蕩（220 r/min、37 ℃）2 h。

模擬小腸消化：模擬胃消化后的混合物用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至7 后加入8.5 mL SIF、40 μL CaCl2·2H2O 溶液、5 mL 胰酶（基于胰蛋白酶：800 U/mL，SIF 溶解）和2.5 mL 膽汁（38.4 mg/mL，SIF 溶解），最后加入適量蒸餾水至40 mL，置于搖床中避光振蕩（220 r/min、37 ℃）2 h。

1.3.5 類胡蘿卜素生物可及性的測定

1.3.5.1 類胡蘿卜素的提取

消化前樣品中類胡蘿卜素使用有機萃取劑（正己烷、丙酮、無水乙醇體積比2∶1∶1）提?。簻蚀_稱取2 g 經(jīng)冷凍干燥、研磨并過篩（80 目）的面條粉末，加入8 mL萃取劑、5 mL 10%氯化鈉，渦旋混勻后超聲5 min 并離心（5 000 r/min，5 min），收集有機上清液，除不添加氯化鈉溶液，重復(fù)上述步驟至樣品顏色變成白色，之后收集并合并有機上清液并濃縮到10 mL，用紫外分光光度計在450 nm 處測定吸光度。

消化后樣品中類胡蘿卜素的提?。簠⒖糚etry 等[10]的方法并稍作修改，小米胡蘿卜南瓜面條經(jīng)體外模擬消化后的混合物先低速離心（5 000 r/min，10 min），之后取10 mL 上清液低溫高速離心（20 000 r/min，10 min，4 ℃）得到含有混合膠束的上清液，采用上述同樣方法進行萃取并測定吸光度。整個提取過程始終在暗環(huán)境下進行，每個樣品獨立消化，做3 個平行試驗。

1.3.5.2 類胡蘿卜素生物可及性的分析

面條中類胡蘿卜素的生物可及性是和未消化面條中類胡蘿卜素的初始含量相比，生物可及性的計算公式如下。

M=CX/CT×100

式中：M 為生物可及性，%；CX為膠束組分中類胡蘿卜素的濃度，μg/g；CT為樣品中初始的類胡蘿卜素濃度，μg/g。

1.3.6 面條的體外模擬酵解

1.3.6.1 糞便接種物的預(yù)處理

將從4 名6～12 歲的健康學(xué)齡兒童志愿者（體重指數(shù)18.5～23.9，飲食正常，過去6 個月未服用抗生素或益生元）的新鮮糞便迅速轉(zhuǎn)移到厭氧手套箱中。糞便樣品用含0.1% L-半胱氨酸鹽酸的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）按固液比1∶5（g/mL）稀釋，充分混勻后通過70 μm 細胞篩過濾得到糞便濾液。最后，將4 名志愿者的糞便濾液與適量等體積甘油混合，放入-80 ℃冰箱中保存[11]。

1.3.6.2 發(fā)酵樣品的制備

模擬體外胃腸消化后的樣品放入透析袋模擬小腸吸收和除去小分子物質(zhì)，之后將透析袋內(nèi)的樣品冷凍干燥，收集在自封袋并放在干燥器中保存以供后續(xù)試驗使用。

1.3.6.3 培養(yǎng)基的配制

參考Ayimbila 等[12]的方法稍作修改，每升培養(yǎng)基中含蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、NaCl 0.1 g、KH2PO40.04 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl2·2H2O 0.01 g、NaHCO32 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g、膽鹽0.5 g、吐溫-80 2 mL、消泡劑0.5 mL、維生素K110 μL、氯化血紅素0.05 g、刃天青0.5 mL（0.2%）。消化透析后的樣品以0.5%的濃度加入培養(yǎng)基中，pH 值調(diào)至6.8 后，滅菌（121 ℃、15 min）。

1.3.6.4 體外酵解

每個無菌管中分別裝有5 mL 培養(yǎng)基和2%糞便濾液，在37 ℃的厭氧環(huán)境中（5%H2、5% CO2、90% N2）發(fā)酵48 h。收集發(fā)酵不同時間點的樣品后立即轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱儲存。菊粉標準品和滅菌超純水分別作為陽性對照和陰性對照。每個樣品和每個時間點均設(shè)置3個平行，每個平行單獨進行。

1.3.6.5 pH 值的測定

采用臺式FE-28 pH 計測定發(fā)酵樣品在不同時間點的pH 值。

1.3.6.6 糖消耗率的測定

參照Yue 等[13]的方法并適當調(diào)整。試管中加入蒸餾水490 μL、發(fā)酵上清液10～100 μL、3%苯酚500 μL和濃硫酸2 mL，渦旋混勻后靜置30 min，最后在490 nm處測定吸光度。配制0.1 mg/mL 標準葡萄糖溶液，梯度稀釋，繪制標準曲線。糖消耗率計算公式如下。

M=（CO-CT）/CO×100

式中：M 為糖消耗率，%；CO為初始糖濃度，mg/mL；CT為發(fā)酵結(jié)束時的糖濃度，mg/mL。

1.3.6.7 短鏈脂肪酸的分析

參考Birkeland 等[14]的方法并做修改，發(fā)酵液經(jīng)離心（13 000 r/min、5 min、4 ℃）后，取上清液0.5～0.7 mL、10%硫酸0.2 mL、無水乙醚0.4 mL 至EP 管。充分渦旋混勻后靜置30 min，上層有機相通過0.22 μm 有機過濾器。上清液（2 μL）注入裝有熔融石英（HP-FFAP，30 m×320 μm×0.25 μm，）和火焰電離檢測器（GC-FID 7890B）的毛細管柱中進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗所得數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，采用SPSS 軟件（版本26.0）進行單因素方差分析，用鄧肯兩兩比較，使用Graph Pad Prism 8.0 軟件制圖，p＜0.05 為有差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 面條的營養(yǎng)成分

面條的營養(yǎng)成分信息如表3 所示。

由表3 可知，9 種面條的蛋白質(zhì)、灰分、總淀粉和粗脂肪的含量分別為18.72%～21.62%、1.08%～1.88%、53.18%～62.53%和0.40%～0.80%。膳食纖維添加對面條脂肪含量無顯著影響。和未添加膳食纖維的蔬菜小米面條相比，8 種膳食纖維添加均顯著降低面條灰分和蛋白質(zhì)含量（p＜0.05）。HACS 面條的總淀粉含量顯著高于其他面條（p＜0.05）。綜上，添加膳食纖維后面條仍有較高的蛋白質(zhì)含量，該面條有利于保證兒童每日蛋白質(zhì)的充足攝入和促進兒童生長發(fā)育。

2.2 面條品質(zhì)的分析

不同膳食纖維添加的面條品質(zhì)見表4。

表4 不同膳食纖維添加的面條品質(zhì)Table 4 Quality of noodles added with different dietary fiber

由表4 可知，添加膳食纖維對面條的感官評分無影響，但BG 和HACS 的添加顯著改善面條的斷條率（p＜0.05），這可能是由于β-葡聚糖的黏性較大以及玉米淀粉在蒸煮過程中的濕熱處理提升面條的黏合性從而減少了面條的斷條率[15]。

2.3 面條中類胡蘿卜素的生物可及性

食物成分的生物可及性是指可被小腸吸收細胞吸收的化合物比例。類胡蘿卜素生物可及性是指腸道部分膠束水相（上清液）中的類胡蘿卜素濃度與其在樣品中的初始濃度的比率[16]。9 種面條的類胡蘿卜素生物可及性見圖1。

圖1 9 種面條的類胡蘿卜素生物可及性Fig.1 Bioaccessibility of carotenoids in 9 kinds of noodles

由圖1 可知，不同膳食纖維對面條中類胡蘿卜素的生物可及性影響不同，BG 面條和FOS 面條經(jīng)消化后類胡蘿卜素生物可及性顯著高于其他面條（p＜0.05）。β-胡蘿卜素的絕對生物可及性受食物中β-胡蘿卜素的數(shù)量限制，一般認為膳食纖維的含量和種類可能通過增加食糜黏度和阻礙膠束的形成影響類胡蘿卜素在腸道的釋放[17-18]，但也有研究顯示，在含類胡蘿卜素和膳食纖維的蔬菜中添加牛油果作為脂質(zhì)來源能夠促進類胡蘿卜素的吸收[19]，可見膳食纖維食物基質(zhì)組分以及膳食纖維和脂肪比例的不同也會影響類胡蘿卜素的消化和其形成膠束的程度進而影響其生物可及性。因此，膳食纖維對類胡蘿卜素生物可及性的影響還有待進一步研究。

2.4 體外模擬發(fā)酵糖消耗率情況

膳食纖維是公認的有益人體健康的營養(yǎng)物質(zhì)，可被腸道纖維降解微生物獲取和代謝[20]。糖含量的變化可以反映腸道細菌對面條消化產(chǎn)物中碳水化合物的利用情況。圖2 為體外發(fā)酵48 h 健康兒童糞便菌群對9 種面條消化物中糖的利用情況。

圖2 體外發(fā)酵過程中健康兒童糞便菌群對預(yù)消化面條的碳水化合物利用情況Fig.2 Carbohydrates utilization of pre-digested noodles during in vitro fermentation using healthy children fecal microbiota

由圖2 可知，糖含量在酵解前12 h 被快速消耗，12～48 h 糖含量下降速度變緩?？赡苁且驗榻徒忾_始時微生物需要利用大量糖進行繁殖，12 h 后，隨著糖被大量消耗以及發(fā)酵體系中產(chǎn)生短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)，不利于微生物的生長，對糖的消耗也放緩。酵解面條組中糖消耗率顯著高于菊粉對照組（p＜0.05），這可能是因為蔬菜小米面條本身含有一定量比菊粉更易被菌群利用的膳食纖維，如Umar[21]發(fā)現(xiàn)每100 g 小米含有0.55～13.70 g 膳食纖維。在所有膳食纖維面條中，僅AX 面條的碳水化合物消耗量顯著低于面條L（p＜0.05）。研究結(jié)果表明，菊粉、低聚果糖、高直鏈玉米淀粉和β-葡聚糖[22-23]均易于被腸內(nèi)細菌發(fā)酵的膳食纖維，而AX 復(fù)雜的結(jié)構(gòu)基質(zhì)使酶降解變得困難，只有部分能夠產(chǎn)生內(nèi)切木聚糖酶的微生物群才能夠有效利用[24]，本研究所采用的兒童糞便菌群中可能缺乏能夠分解代謝這種膳食纖維的相關(guān)微生物群。綜上，膳食纖維添加的面條消化物均被糞便菌群有效利用。

2.5 體外發(fā)酵后pH 值變化

短鏈脂肪酸（SCFAs）由腸道微生物代謝膳食纖維產(chǎn)生[25]，可以降低pH 值，刺激結(jié)腸對電解質(zhì)液的吸收，并為宿主提供能量[26]。因此，pH 值作為體外發(fā)酵的重要指標，可以反映發(fā)酵過程中碳水化合物的消耗情況。預(yù)消化面條和健康兒童糞便菌群體外發(fā)酵過程pH值的變化見圖3。

圖3 預(yù)消化面條和健康兒童糞便菌群體外發(fā)酵過程pH 值的變化Fig.3 Changes of pH during in vitro fermentation of pre-digested noodles using healthy children fecal microbiota

由圖3 可知，發(fā)酵0～12 h 時pH 值迅速下降，12～24 h 時pH 值緩慢下降。面條組在發(fā)酵過程中pH 值變化顯著低于菊粉對照（p＜0.05），這可能是因為發(fā)酵12 h時面條組中糖含量幾乎被消耗完，而菊粉組依舊有充足的碳水化合物供菌群利用產(chǎn)生乳酸和琥珀酸等[27]并降低了pH 值，這與2.4 中糖的消耗速度一致。

2.6 體外發(fā)酵中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生情況

預(yù)消化面條和健康兒童糞便菌群體外發(fā)酵過程SCFAs 濃度的變化見圖4。

圖4 預(yù)消化面條和健康兒童糞便菌群體外發(fā)酵過程SCFAs 濃度的變化Fig.4 Change of SCFAs concentrations during in vitro fermentation of pre-digested noodles using healthy children fecal microbiota

研究表明，膳食纖維的攝入（提供SCFAs）對保持健康和預(yù)防非傳染性疾病非常重要[28]。如圖4 所示，隨著發(fā)酵過程的進行，不同面條組中SCFAs 的濃度逐漸升高，產(chǎn)物以乙酸、丙酸和丁酸為主。乙酸是各組中產(chǎn)生較多的SCFAs，高水平的乙酸生產(chǎn)可以通過改變菌群組成來緩解結(jié)腸炎[29]，菊粉組在發(fā)酵結(jié)束時乙酸濃度顯著高于面條組，I 組和HACS 組乙酸水平顯著高于L 組（p＜0.05）；在丙酸產(chǎn)量方面，BG 組的濃度最高；在丁酸產(chǎn)量方面，所有面條組的丁酸濃度顯著高于菊粉對照，I 組和HACS 組丁酸濃度顯著低于未添加膳食纖維的L 組。丁酸鹽作為一種促進健康的因子，能夠調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝和炎癥，其水平和兒童肥胖發(fā)生負相關(guān)[30]，該面條發(fā)酵產(chǎn)生大量丁酸可能在預(yù)防兒童肥胖方面發(fā)揮有益作用。飲食驅(qū)動微生物群多樣性變化產(chǎn)生不同的SCFAs，和未添加膳食纖維的面條相比，I 組和HACS 組發(fā)酵偏向于產(chǎn)生較多的乙酸和較少丁酸，而BG 組容易產(chǎn)生更多的丙酸。在本研究中，含有膳食纖維的面條在發(fā)酵后產(chǎn)生的SCFAs 水平和菊粉對照無顯著性差異，均降低了酵解體系的pH值，這可能對腸道健康有益。

3 結(jié)論

本研究以小米、南瓜和胡蘿卜為主要成分，分別添加8 種不同的膳食纖維制備面條。對面條基本營養(yǎng)成分分析和采用兒童糞便菌群體外模擬消化和酵解的試驗結(jié)果表明，BG 和HACS 添加顯著降低了面條斷條率。此外，BG 面條消化后的類胡蘿卜素生物可及性顯著高于其他面條。面條中不可消化糖類在與健康兒童糞便體外發(fā)酵24 h 過程中被充分利用，產(chǎn)生大量SCFAs，降低了發(fā)酵體系的pH 值，其中BG 添加的面條在體外發(fā)酵24 h 過程中產(chǎn)生了最多的短鏈脂肪酸。說明添加膳食纖維的面條能夠被兒糞便菌群發(fā)酵改善腸道環(huán)境從而發(fā)揮對兒童健康的益處，類胡蘿卜素的生物可及性因膳食纖維添加種類的不同表現(xiàn)不一。