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    兩性霉素B制劑細(xì)胞毒性測定法

    2023-08-03 06:02:40毛文學(xué)余音李欣鈺余丹丹
    上海醫(yī)藥 2023年13期
    關(guān)鍵詞:脂質(zhì)體孵育制劑

    毛文學(xué) 余音 李欣鈺 余丹丹

    (上海研諾醫(yī)藥科技有限公司 上海 201114)

    兩性霉素B(AmB)是一種多烯類廣譜抗真菌抗生素,是治療敏感深部真菌感染的首選藥物之一[1-3],但AmB 的作用機(jī)制決定了其在破壞真菌細(xì)胞的同時也會導(dǎo)致人體正常細(xì)胞損傷,影響細(xì)胞膜的運(yùn)輸,長期使用還會造成腎損傷及循環(huán)系統(tǒng)的損傷,表現(xiàn)出蛋白尿、氮質(zhì)血癥、低血鉀、貧血等癥狀[4]。Kagan 等[5]在研究AmB制劑時以酵母細(xì)胞為模型,通過酵母的存活率和細(xì)胞內(nèi)K+濃度來評價AmB 制劑及AmB-阿拉伯半乳聚糖共軛物(AmB-arabinogalactan conjugate,AmB-AGC) 聯(lián)合用藥的毒性變化。Gruda 等[6]以紅細(xì)胞中K+的保留量為指標(biāo),證明蔗糖單月桂酸酯能夠在不降低AmB 抑制真菌能力的同時消除其對紅細(xì)胞的毒性。de Araújo 等[7]的研究表明AmB 膠束對紅細(xì)胞的毒性與K+的泄漏呈濃度依賴性。

    國內(nèi)外諸多圍繞AmB 劑型改良、聯(lián)合用藥及拓展應(yīng)用的研究都以其毒性為重要評價指標(biāo)[8-10],利用AmB增加細(xì)胞膜通透性導(dǎo)致單價陽離子泄漏的特點,以泄漏的K+含量表征AmB 制劑毒性。在其他相關(guān)研究中,K+含量的測定多使用火焰光度計、原子吸收分光光度計、電解質(zhì)分析儀及生化分析儀等設(shè)備[7,11-12]。實驗結(jié)果的精確度會受設(shè)備及樣本處理方法等因素的影響,如火焰光度計無法測出元素的絕對濃度值,而生化分析儀由于樣本處理中使用肝素抗凝劑,會影響靜脈血清K+測定,導(dǎo)致測得的K+含量偏高。本研究選擇紅細(xì)胞為載體,以HPLC 法對紅細(xì)胞滲漏的K+濃度進(jìn)行檢測,建立了一套針對AmB 制劑的毒性評價方法。此方法能夠準(zhǔn)確高效地評價工藝及處方對細(xì)胞毒性的影響,為AmB 制劑的研究應(yīng)用拓寬了道路。

    1 材料和方法

    1.1 材料與試劑

    10%大鼠紅細(xì)胞(批號:BC20200809、BC20200813、BC20200818,南京生航生物技術(shù)有限公司;批號:20200811、20200814、20200823,南京森貝伽生物科技有限公司);AmB 原料藥[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]、AmB 脂質(zhì)體凍干制劑(自制);其余化學(xué)制劑均為市售分析純。

    1.2 儀器

    E2695 高效液相色譜儀(Wasters 公司,帶檢測器2424 ELS Detector);XS205 型分析天平(Mettler Toledo公司);MX-RD-Pro 型旋轉(zhuǎn)混勻儀[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司];GNP-9050 型恒溫箱(上海精其儀器有限公司);TGL-16.5M 型離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

    1.3 溶液配制

    1)PBS 溶液 配制含147 mmol/L 氯化鈉、3 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 磷酸氫二鈉的PBS 溶液,以1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至7.4±0.1 保存?zhèn)溆肹9]。

    2)陽性對照液 準(zhǔn)確稱取AmB 原料藥50 mg、脫氧膽酸鈉41 mg、磷酸鈉 20.2 mg,加入純化水10 mL溶解,得5 mg/mL AmB 脫氧膽酸鹽溶液,以PBS 稀釋至1 mg/mL。

    3)供試品溶液 取AmB 脂質(zhì)體凍干制劑1 支(每支含AmB 50 mg),加入純化水10 mL 復(fù)溶,得約5 mg/mL AmB 脂質(zhì)體溶液,以PBS 分別稀釋至1 mg/mL、500 和250 μg/mL。

    4)陰性對照液 PBS 溶液。

    1.4 紅細(xì)胞預(yù)處理及樣品孵化

    1)紅細(xì)胞洗滌濃縮 取市售10%大鼠紅細(xì)胞45 mL,用PBS 溶液離心洗滌(500 g,10 min,4 ℃)4 次至上清澄清后加入PBS 溶液分散并定容至10 mL,得45%大鼠紅細(xì)胞懸液。

    2)紅細(xì)胞孵化 取45%大鼠紅細(xì)胞450 μL 于1.5 mL 離心管內(nèi),分別加入陽性對照、供試品或陰性對照50 μL,混勻。將離心管固定于旋轉(zhuǎn)混勻儀上,于37 ℃恒溫箱內(nèi)以12 r/min 水平旋轉(zhuǎn)孵化。于取樣時間點取出樣品,離心(1 000 g,10 min,4 ℃)后取200 μL 上清液于液相進(jìn)樣小瓶中,加超純水800 μL,混勻得稀釋5倍的供試品溶液,按HPLC 條件進(jìn)行分析。

    1.5 HPLC 鉀離子含量檢測色譜條件

    采用Waters XBridge Hilic 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為0.1 mol/L 乙酸銨- 乙腈=15 ∶85;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;載氣206.84 kPa;漂移管溫度80 ℃;運(yùn)行時間20 min。

    2 結(jié)果

    2.1 K+釋放與紅細(xì)胞孵育時間關(guān)系考察

    陰性對照的K+釋放濃度未隨孵育時間而增加,表明本研究采用的孵化條件對大鼠紅細(xì)胞細(xì)胞膜通透性無顯著影響,不會造成K+額外滲漏。作為陽性對照的1 mg/mL AmB 脫氧膽酸鹽溶液于孵育后0.5 h 內(nèi)快速釋放K+并于1 h 時達(dá)平臺濃度。相較于陽性對照,不同濃度的AmB 脂質(zhì)體對大鼠紅細(xì)胞的急性毒性顯著減小,且K+釋放呈時間與濃度依賴性,并于4 h 時達(dá)到最大K+釋放濃度(圖1)。為保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性,后續(xù)研究中將4 h 作為考察AmB 制劑細(xì)胞毒性的孵育時間。

    圖1 孵育時間對大鼠紅細(xì)胞K+釋放的影響

    2.2 大鼠紅細(xì)胞K+釋放重復(fù)性考察

    為考察方法重復(fù)性,分別使用了陽性對照液、不同濃度AmB 脂質(zhì)體溶液及陰性對照液按前述方法進(jìn)行實驗,并檢測紅細(xì)胞K+釋放濃度,實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過4 h 孵育,陽性對照組紅細(xì)胞K+釋放濃度最高,AmB 脂質(zhì)體引起的紅細(xì)胞K+釋放濃度隨AmB 濃度的降低而降低,表明大鼠紅細(xì)胞K+釋放濃度與供試品溶液中AmB濃度正相關(guān)(表1)。同組平行孵育的4 管樣品除AmB脂質(zhì)體250 μg/mL 組RSD 大于5%外,其余各組RSD均小于4%(表1),樣品組內(nèi)平行性好,證明本方法重復(fù)性良好,能夠滿足考察AmB 及其制劑細(xì)胞毒性評價的要求。

    表1 孵育4 h后不同濃度AmB脂質(zhì)體溶液對K+釋放的影響(n=4)

    2.3 大鼠紅細(xì)胞K+釋放批間差異考察

    為研究大鼠紅細(xì)胞質(zhì)量對實驗結(jié)果的干擾程度,我們分別對兩個公司各3 批市售10%大鼠紅細(xì)胞進(jìn)行了對比研究。實驗結(jié)果顯示,購自南京生航的3 批大鼠紅細(xì)胞在分別給予陽性對照液和陰性對照液4 h 后K+釋放濃度穩(wěn)定,批間差異小,僅1 mg/mL AmB 脂質(zhì)體溶液孵育的紅細(xì)胞樣品表現(xiàn)出了較大批間差異(表2);南京森貝伽3 批大鼠紅細(xì)胞K+釋放濃度均表現(xiàn)出較大批間差異,其中批次3 的AmB 脂質(zhì)體溶液組K+釋放濃度顯著高于同組其余2 批紅細(xì)胞且高于陽性對照組,導(dǎo)致批間RSD達(dá)26.69%;同時,批次3 陽性對照組K+釋放濃度低于同組另2 個批次(表3)。綜合對比南京森貝伽各組別實驗結(jié)果,提示批次3 大鼠紅細(xì)胞質(zhì)量可能是導(dǎo)致出現(xiàn)不符合不同AmB 制劑間細(xì)胞毒性規(guī)律結(jié)果的原因。

    表2 南京生航3批次大鼠紅細(xì)胞孵化4 h后K+釋放濃度

    表3 南京森貝伽3批次大鼠紅細(xì)胞孵化4 h后K+釋放濃度

    2.4 紅細(xì)胞儲存時間與細(xì)胞毒性變化考察

    對于細(xì)胞水平的體外毒性研究而言,除了細(xì)胞來源與批次之間的差異,細(xì)胞在儲存過程中的變化對于實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性也會產(chǎn)生一定影響。因此,對同一廠商的3 批大鼠紅細(xì)胞分別在入庫當(dāng)日于2 ~8 ℃保存7 d 后,與AmB 脫氧膽酸鹽溶液(1 mg/mL)孵育進(jìn)行對比。3批次紅細(xì)胞在入庫當(dāng)日(0 day)K+釋放濃度無顯著差異,保存7 d 后3 批次紅細(xì)胞K+釋放量均有不同程度的下降(圖2)。根據(jù)實驗結(jié)果推測,部分紅細(xì)胞在儲存過程中失活皺縮,且市售紅細(xì)胞的保存液不能完全阻止其緩慢釋放K+,致使部分K+在洗滌濃縮過程中被去除,從而導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)K+濃度隨儲存時間延長而下降。這可能是保存7 d 后大鼠紅細(xì)胞K+釋放濃 度整體降低的原因。

    圖2 大鼠紅細(xì)胞實驗前保存時間對K+釋放的影響

    3 討論

    實驗結(jié)果表明,本研究建立的方法可以精確測定出不同劑型、不同濃度、不同孵育時間紅細(xì)胞釋放的K+含量,并且不受其他雜質(zhì)離子的干擾。相較于使用實驗動物為模型的毒性半數(shù)致死劑量實驗、細(xì)胞毒性實驗的MTT 法、細(xì)胞毒性克隆實驗等傳統(tǒng)毒性評價手段[13],本方法不需要流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記物等特殊儀器設(shè)備及耗材,具有成本低、周期短、易操作、對實驗環(huán)境要求低等特點。同時,紅細(xì)胞作為血液中占比高達(dá)40%~45%的細(xì)胞,來源廣泛,易于獲?。黄渚哂型暾募?xì)胞膜結(jié)構(gòu),且細(xì)胞內(nèi)含有高濃度的K+,結(jié)合HPLC 檢測,實驗結(jié)果精確度高,更適合作為制劑處方、工藝變更的快速安全評價方法。

    值得注意的是,細(xì)胞作為一種活體評價載體,會因種屬來源、采集方式、儲存及運(yùn)輸?shù)炔煌蛩囟斐杉?xì)胞生理活性上的差異。因此,為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,應(yīng)在實驗中適當(dāng)增加空白樣、平行樣或?qū)φ諛?。還應(yīng)嚴(yán)格控制紅細(xì)胞從采集到使用的各中間環(huán)節(jié),包括避免長時間遠(yuǎn)距離運(yùn)輸、將紅細(xì)胞于2 ~8 ℃低溫保存但不可凍融、運(yùn)輸及使用過程中避免劇烈震蕩引發(fā)的溶血、保持無菌狀態(tài)并在開封后盡快使用完畢等注意事項。如有條件,宜從可靠的動物中心采購固定種屬的大鼠或采用固定來源的現(xiàn)制紅細(xì)胞,即于實驗當(dāng)日在無菌條件下采血提取紅細(xì)胞進(jìn)行藥物細(xì)胞毒性實驗,以消除種屬間差異及運(yùn)輸儲存條件對實驗結(jié)果的干擾。

    綜上所述,本方法不僅可以用于AmB 原料藥和脂質(zhì)體注射劑細(xì)胞毒性的快速測定,根據(jù)其實驗原理還能應(yīng)用于其他AmB 劑型和能夠?qū)е翶+泄漏的藥物及其制劑的研究中,是一種具有良好前景的藥物細(xì)胞毒性評價方法。

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