姜黃素對人結(jié)腸癌腫瘤樣干細(xì)胞中VEGF表達(dá)的作用

謝光洪 趙逵

(1.貴州省人民醫(yī)院急診內(nèi)科,貴州 貴陽 550001;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,貴州 遵義 563099)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1],其死亡率居惡性腫瘤死亡率第三位。近年來由于人們生活水平較前明顯改善,生活方式及飲食結(jié)構(gòu)較前有很大變化,如低纖維、高脂肪及高蛋白飲食等,導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)病率呈不斷上升趨勢,且發(fā)病年齡不斷趨于年輕化。研究認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多基因、多步驟共同參與的過程[2]。臨床上一旦診斷結(jié)腸癌常常采取手術(shù)及放化療、靶向治療等綜合治療措施。VEGF是一種血管內(nèi)皮生長因子,它能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成從而促進(jìn)腫瘤的生長,分化良好的血管又能夠產(chǎn)生VEGF[3]。不斷增多的VEGF參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[4-6]。姜黃素是一種植物多酚,具有抗炎癥,抗腫瘤等作用,但機(jī)制仍然不清楚。本研究采用姜黃素作用于體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480對數(shù)生長期細(xì)胞,檢測細(xì)胞中VEGF基因及蛋白含量表達(dá)的變化,為臨床用藥提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29及SW480;含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基(?？寺」旧a(chǎn)),37℃二氧化碳孵箱,細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2藥物、主要試劑及方法 姜黃素(Curcumin)(Sigma公司產(chǎn)品);胎牛血清(hylone公司產(chǎn)品);RIPA組織細(xì)胞裂解液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。

1.3檢測方法 利用熒光顯微鏡觀察姜黃素處理48 h后的每個視野下細(xì)胞生長及增殖情況。利用實時定量PCR 檢測藥物處理后HT-29、SW480細(xì)胞中VEGF的mRNA表達(dá)變化:每種細(xì)胞傳4瓶,陰性對照各1瓶,其中HT-29給藥濃度為21 μmol/L,SW480給藥濃度為48 μ mol/L,分別培養(yǎng)12、24、48 h,提取VEGFmRNA,用實時定量PCR檢測mRNA水平的變化。利用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測姜黃素處理腫瘤細(xì)胞后VEGF蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化:用蛋白免疫印跡檢測姜黃素干預(yù)12、24、48 h后HT-29、SW480細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)的變化。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素干預(yù)48 h后顯微鏡下HT-29及SW480 細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目改變 與對照組相比,姜黃素組隨著作用時間延長,細(xì)胞數(shù)量在減少,同時胞體回縮,細(xì)胞變得粗糙。見圖1。

對照組 HT29 SW480

2.2PCR(Real-time PCR)檢測藥物處理后HT-29、SW480細(xì)胞中VEGF的mRNA表達(dá)變化 姜黃素干預(yù)后的HT-29細(xì)胞株和SW480細(xì)胞株,與空白對照相比,VEGF的mRNA表達(dá)明顯降低,且呈時間依賴關(guān)系,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖2、3。

表1 姜黃素干預(yù)后HT-29、SW480細(xì)胞中VEGF的mRNA表達(dá)變化

圖2 HT-29細(xì)胞中VEGF的溶解曲線

圖3 SW480細(xì)胞中VEGF的溶解曲線

2.3蛋白免疫印跡(Western blot)檢測藥物處理腫瘤細(xì)胞后VEGF蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化 姜黃素干預(yù)后的HT-29細(xì)胞株和SW480細(xì)胞株,與空白對照相比,VEGF蛋白質(zhì)水平表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖4。

表2 姜黃素干預(yù)后HT-29、SW480細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變

圖4 Western blot檢測姜黃素干預(yù)后HT-29及SW480中VEGF的表達(dá)

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,目前研究認(rèn)為是多基因、多因素、多階段相互作用的結(jié)果。其中豐富的血運促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的迅速生長與增殖[7]。VEGF參與了腫瘤血管的生成及生長,為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng),同時為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[8-11]。

姜黃素是從姜科植物中提煉出來的一種植物多酚,廣泛應(yīng)用于各種食物中。隨著研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用。它還有一個特點是幾乎無副作用,不會給患者的健康帶來負(fù)面作用。姜黃素可抑制花生四烯酸(AA)代謝途徑的環(huán)加氧酶(COX)和脂加氧酶(LOX)活性[12]以及與腫瘤促發(fā)密切相關(guān)的蛋白激酶(PKC)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)等活性。此外,研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖主要是通過阻滯細(xì)胞周期的G2/M期[13]誘導(dǎo)細(xì)胞停滯。姜黃素對結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移均有抑制作用[14-17]。

本實驗采用姜黃素干預(yù)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、SW480,通過相差顯微鏡觀察姜黃素處理后每個高倍鏡視野下細(xì)胞數(shù)目的生長與增殖受到抑制,與時間呈正相關(guān)性,通過PCR和Western blot檢測VEGF基因和蛋白的表達(dá),觀察到姜黃素干預(yù)后的細(xì)胞中VEGF表達(dá)較對照組降低,且隨著時間的延長其抑制作用增強(qiáng)。本研究通過VEGF作為作用靶點,為進(jìn)一步姜黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長和增殖及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 但黃素如何抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞細(xì)胞機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步的研究。