抗菌肽的生物學(xué)功能及在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進展

賈會囡 王孝宗 周永利 劉劍輝 吳亞文 譚 俊 李知新*

（1．平羅縣姚伏畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏 石嘴山 753000；2．平羅縣動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏 石嘴山 753000；3．寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏 銀川 750000；4．平羅縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 石嘴山 753000）

抗菌肽（AMPs）是生物體固有免疫的重要組成部分，目前已在動植物和微生物體發(fā)現(xiàn)和鑒定數(shù)千種AMPs。AMPs 具有抗細菌、病毒、真菌、寄生物和免疫調(diào)節(jié)等功能，是機體防止外來菌入侵的關(guān)鍵屏障[1-2]。與傳統(tǒng)抗生素相比，AMPs具有抗菌譜廣、耐藥性低、無殘留等特性，已成為微生物學(xué)、生物醫(yī)藥、農(nóng)學(xué)等多領(lǐng)域研發(fā)的熱點之一，具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。研究表明，畜禽日糧中添加AMPs具有提高幼畜禽成活率和生長性能，改善腸道健康及增強機體免疫力等功能[4-5]。本文重點綜述AMPs的生物學(xué)功能及在家禽飼料中添加AMPs的應(yīng)用效果，以期為AMPs的研發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 AMPs的理化特性

目前，抗菌肽數(shù)據(jù)庫（APD）收錄3 400余種AMPs，雖然不同種類的AMPs 氨基酸組成、結(jié)構(gòu)上存在不同程度的差異，但其本質(zhì)上具有一些共性。AMPs 通常由12～50個氨基酸殘基組成；多數(shù)AMPs為陽離子短肽，帶2～9 個正電荷，其中帶2～4 個正電荷的AMPs 最豐富。AMPs的抗菌作用主要是通過其表面的陽離子殘基與細菌細胞膜上的陰離子的靜電作用實現(xiàn)[6-7]。AMPs 分子質(zhì)量較小，一般小于10 kD，小分子量更便于AMPs 快速擴散，激發(fā)即時防御功能；AMPs 具有α-螺旋、β-折疊或延伸、隨機卷曲3 種構(gòu)型，具有水脂兩親性，是決定AMPs 發(fā)揮膜溶解活性的基礎(chǔ)[8]。此外，AMPs 熱穩(wěn)定性較高，對較大的離子強度或較高、較低的pH值具有較強的抗性。部分AMPs 還具有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力，便于AMPs在動物體內(nèi)完整地發(fā)揮作用[9]。

2 AMPs的分類

2.1 按照結(jié)構(gòu)分類

根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，AMPs大致可分為多聚氨基酸、短鏈AMPs 和脂肽。陽離子多聚氨基酸如多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚組氨酸等具有廣譜的殺菌作用，又因其獨特的抗菌機制和低耐藥性而受到廣泛關(guān)注。多聚賴氨酸可通過靜電相互作用使細菌細胞膜去極化而破裂，導(dǎo)致細菌死亡。多聚精氨酸含有胍基，可在電離堿性環(huán)境，穿透細胞膜，溶解細胞；在酸性條件下，多聚組氨酸可與陰離子細胞外膜相互作用，發(fā)揮抗菌作用。短鏈AMPs是一種短于15個氨基酸的肽，通常由化學(xué)合成，具有更低的生產(chǎn)成本和優(yōu)化潛力。大多數(shù)短鏈AMPs 具有正電荷和疏水性，與多帶負電荷的細菌細胞膜結(jié)合產(chǎn)生靜電親和，且易被疏水性和整體兩親性的多肽錨定，導(dǎo)致細胞膜破壞。脂肽是兩親性物質(zhì)，由連接在一條或多條脂鏈上的肽基組成，通常自組裝形成一定的聚集結(jié)構(gòu)，活性物質(zhì)可通過脂肽以內(nèi)吞形式運輸?shù)郊毎麅?nèi)，細菌的細胞壁也會被脂肽破壞[10]。

2.2 按照來源分類

根據(jù)來源不同，AMPs 通常包括微生物AMPs、植物AMPs、動物AMPs 和其他AMPs，不同來源的AMPs 具有不同的抗菌作用。微生物AMPs可分為細菌AMPs、酵母肽、放線菌AMPs、霉菌AMPs等四大種類，其中的乳酸鏈球菌肽和相應(yīng)的短桿菌肽等能夠有效殺滅革蘭氏陽性菌，放線菌AMPs 屬于較重要的藥源微生物類別。植物抗菌肽主要是由植物產(chǎn)生的一類小分子多肽，可分為植物防衛(wèi)素、脂肪轉(zhuǎn)移蛋白、硫堇等類別[11]。動物AMPs又可分為昆蟲AMPs、哺乳動物AMPs、兩棲動物AMPs、鳥類AMPs 和魚類AMPs。昆蟲AMPs 是一種分子量低、水溶性好、熱穩(wěn)定性強、無免疫原性、抗水解的堿性多肽，不損害宿主動物的正常細胞，但具有強大的廣譜抗菌、抗癌和抗病毒能力[12]。哺乳動物AMPs分為防御素和抗菌肽，主要存在于皮膚和黏膜的中性粒細胞和上皮細胞中。兩棲動物的AMPs 由5～60 個氨基酸組成，具有良好的水溶性、熱穩(wěn)定性和耐受蛋白酶的能力。鳥類AMPs多屬于β-防御素類，在編碼上與哺乳動物防御素存在顯著差異。魚類AMPs 是一種帶正電荷的短鏈氨基酸，參與宿主的防御機制。其他AMPs如病毒AMPs，具有很強的抗微生物活性和細胞毒性作用[13]。

3 AMPs生物學(xué)功能及作用機制

3.1 抗菌功能

抗菌活性是AMPs最基本的功能。AMPs主要通過其二級結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗菌作用，主要是α 螺旋結(jié)構(gòu)和β 折疊結(jié)構(gòu)。肽上陽離子殘基與目標(biāo)膜上陰離子脂質(zhì)的靜電相互作用使α-AMPs 與細菌細胞膜結(jié)合，或是β-AMPs 線性丁基甘鏈上的疏水亞基與膜脂相互作用，從而破壞細菌細胞膜的完整性，殺滅細菌[14-15]。此外，一些AMPs通過與特定細胞內(nèi)靶點的相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄、翻譯或其他過程，從而起到抑菌殺菌作用，如吲哚霉素和LL-37 可穿透細胞，與細胞內(nèi)靶點相互作用并與DNA結(jié)合，抑制細胞分裂[16-17]。AMPs通常位于細胞膜表面，當(dāng)肽濃度達到一定閾值時細菌細胞膜會被破壞。當(dāng)AMPs 生理濃度低于閾值時，其他功能如免疫調(diào)節(jié)功能就被凸顯出來。動物常產(chǎn)生多種AMPs，在大多數(shù)情況下發(fā)生協(xié)同作用。因此，盡管每種AMPs 含量可能低于活性閾值，細菌仍可被AMP混合物殺死[8]。

3.2 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫調(diào)節(jié)活性是AMPs 的主要的生物學(xué)功能。當(dāng)AMPs 在體內(nèi)的質(zhì)量濃度低于2 mg/L（即活性閾值）時，選擇性地調(diào)節(jié)宿主免疫功能，增強機體抗微生物感染的能力[18]。AMPs的免疫調(diào)節(jié)功能主要包括：

（1）調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥水平。AMPs調(diào)節(jié)炎癥的機制非常復(fù)雜，抗菌肽LL-37 可阻止核因子κB（NF-κB）亞基p65易位，活化絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和人磷脂酰肌醇三羥基激酶（PI3K）信號通路，選擇性上調(diào)抗炎因子的表達[19]。在B 淋巴細胞、小鼠及人中性粒細胞和樹突狀細胞中，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的促炎因子異常表達可被LL-37降低[20]。

（2）通過誘導(dǎo)趨化因子分泌間接發(fā)揮作用。在較低生理濃度下，AMPs 可誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細胞的趨化因子產(chǎn)生。如人體防御素可誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒，募集中性粒細胞，從而刺激支氣管上皮細胞白細胞介素-8（IL-8）產(chǎn)生。當(dāng)生理質(zhì)量濃度稍高時，AMPs 直接作為趨化因子，募集中性粒細胞到感染部位，啟動免疫反應(yīng)[21]。

（3）啟動和調(diào)節(jié)特異性免疫。AMPs通過信號傳導(dǎo)途徑啟動并擴大宿主的特異性免疫，充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)橋梁。注射經(jīng)皮肝穿膽道引流（PTd）和AMP HH2-CpG可使免疫球蛋白G（IgG）分泌水平增加100 倍，從而使免疫球蛋白亞型IgG2a和IgG1的抗體水平增加[22]。

（4）直接增強機體抗細菌感染能力。CR-AMP基因敲除的小鼠更有可能出現(xiàn)A 型鏈球菌感染引起的皮膚壞死，也更有可能出現(xiàn)泌尿系統(tǒng)感染[23]。

（5）通過特異性受體激活免疫細胞。如LL-37 與宿主細胞DNA 形成復(fù)合物，通過Toll 樣受體9（TLR-9）信號通路激活漿細胞樣DC細胞，產(chǎn)生干擾素-γ（IFN-γ）并激活自身免疫T細胞[24]。

3.3 屏障作用

AMPs還可通過增強上皮組織的屏障功能增強機體對病原微生物的抵抗力。如LL-37 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子、角化細胞生長因子等細胞生長因子的表達，刺激腸上皮細胞的生長，保證上皮組織的完整性[25]。LL-37 還可通過與纖維肌動蛋白的相互作用，增加肺泡上皮細胞的硬度，從而增強機體對銅綠假單胞菌的防御能力。有研究表明，AMPs可與腸道微生物相互作用，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強腸道屏障[26]。

3.4 抗其他微生物功能

AMPs具有廣譜抗菌作用，能夠殺死各類細菌，還可有效抑制真菌、病毒，殺滅各類寄生物、原蟲等。多數(shù)AMPs發(fā)揮抗真菌活性主要通過膜滲透方式，直接與真菌細胞膜上的受體結(jié)合，干擾細胞壁合成，或進入細胞質(zhì)引起線粒體耗損，最終殺死真菌[5]。AMPs發(fā)揮抗病毒功能主要通過3 種途徑：競爭宿主細胞結(jié)合位點，降低病毒感染概率；阻礙基因表達，抑制病毒增殖；侵擾病毒的組裝及合成過程[27]。AMPs對多種利什曼原蟲、瘧原蟲和錐蟲具有良好的抑制作用，主要通過破壞細胞膜發(fā)揮抗寄生物蟲作用[28]。抗菌肽殺傷原蟲的靶點在質(zhì)膜，通過改變細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細胞器，干擾細胞新陳代謝過程[11]。

4 抗菌肽在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用

4.1 在肉雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用

AMPs 可提高肉雞的成活率，改善肉雞的生長性能，提高屠宰性能，增強免疫力等[29-31]。Nguyen 等[32]在18 胚胎日卵內(nèi)添加禽β-防御素（ABD1），結(jié)果顯示，處理組和對照組雛雞平均孵化重?zé)o顯著差異，孵化后1 d，通過臍內(nèi)途徑進行大腸桿菌攻毒，2周后，ABD1組雛雞的存活率（65.52%） 明顯高于無添加組（38.24%），證實ABD1能夠顯著降低由禽致病性大腸桿菌引起的早期雛雞死亡率，ABD1可成為控制雛雞細菌感染的潛在抗生素替代品的重要補充。郭忠欣等[33]研究分別添加0、0.01%、0.05%、0.10% AMPs 對肉雞生長性能、屠宰性能和免疫功能的影響，結(jié)果顯示，AMPs組肉雞的平均日增重均顯著高于對照組，其中添加0.05% AMPs組肉雞的平均日增重達68.13 g，對照組為63.84 g；0.05%、0.10% AMPs組肉雞屠宰性能顯著提高，屠宰率分別為90.27%、90.19%；0.05%和0.10% AMPs 組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、IgA、IgG、IgM 含量均顯著升高，表明AMPs 可促進肉雞免疫器官發(fā)育，可調(diào)控免疫球蛋白含量，使肉雞的機體免疫力處于較優(yōu)水平，建議添加量為0.05%。Hu 等[34]研究了豬腸道抗菌肽（SGAMP）對慢性熱應(yīng)激肉雞生長性能和小腸功能的影響，結(jié)果顯示，與熱應(yīng)激組相比，添加SGAMP組豬的平均日增重和料重比更高，小腸組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)病變更少；熱應(yīng)激組腸黏膜損傷嚴重，絨毛斷裂，上皮細胞壞死、水腫，大量黏液滲出，添加SGAMP組腸道結(jié)構(gòu)相對完整，絨毛略斷，上皮細胞排列整齊，少量黏液；SGAMP 組空腸絨毛高度極顯著高于熱應(yīng)激組，增殖細胞核抗原、熱休克蛋白比例更低，提示SGAMP可通過減輕熱應(yīng)激引起肉雞的腸道損傷，維持肉雞正常的腸道結(jié)構(gòu)、吸收功能和黏膜免疫功能，有效抵抗慢性熱應(yīng)激的不良反應(yīng)。Wang等[35]在肉雞日糧中添加AMP Gal-13，結(jié)果顯示，100 mg/kg 組肉雞的體重和平均日增重顯著高于未添加組，空腸和回腸絨毛長度/隱窩深度比值、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著高于未添加組，新城疫病毒特異抗體滴度顯著升高，表明日糧中添加AMP Gal-13可改善肉雞腸道消化功能、抗氧化能力和免疫功能，最終促進肉雞生長。

4.2 在蛋雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用

AMPs可提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能，改善蛋品質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)利用率及免疫功能等[36-39]。劉夢雪等[40]在66 周齡海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋后期中添加0、100、200、400 mg/kg AMPs，結(jié)果顯示，與對照組相比，添加100、200 mg/kg AMPs組蛋雞產(chǎn)蛋率提高5.72%和3.41%，添加200 mg/kg AMPs組蛋雞的料蛋比降低了6.07%，平均蛋重增加了1.27%，蛋殼厚度、蛋殼強度提高了5.56%和8.90%；200 mg/kg AMPs 組蛋雞的粗灰分利用率提高16.43%；100、200、400 mg/kg AMPs組總膽固醇含量降低了39.96%、35.36%和27.62%，球蛋白提高了22.52%、22.86%和25.88%，添加200 mg/kg AMPs 組堿性磷酸酶活性提高24%。結(jié)果表明，添加一定劑量抗菌肽可顯著改善海蘭褐蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及免疫功能，添加200 mg/kg效果較好。安利民等[41]研究添加0、30、60 mg/kg 細菌素（AMPs）對高溫條件下海蘭褐蛋雞生產(chǎn)性能、脂代謝及腸道健康的影響，結(jié)果顯示，添加30、60 mg/kg AMPs 組蛋雞的產(chǎn)蛋率分別提高2.35%和3.04%，蛋殼強度提高12.23%和13.39%，肝臟重量提高16.47%和14.12%，空腸絨毛高度提高3.13%和3.40%，盲腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量降低了9.45%和10.24%，表明日糧添加AMPs可改善蛋雞腸道健康，降低有害微生物數(shù)量，從而提高生產(chǎn)性能。田麗娜等[42]研究在基礎(chǔ)日糧中添加0、100、200 和300 mg/kg AMPs（Sublancin）對蛋雞免疫功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)與未添加組相比，添加100、200 和300 mg/kg Sublancin 組15 d、30 d 蛋雞血清IgA、IgG 和IgM 含量均顯著提高，其中發(fā)揮主要免疫作用的IgG 含量于15 d 分別提高14.84%、43.79%和44.99%，30 d時提高15.65%、44.73%和45.54%；飼喂Sublancin 后第15 d 和第30 d，各組蛋雞的肝臟和脾臟指數(shù)均顯著升高，添加200 mg/kg組肝臟指數(shù)分別增加24.82%和28.84%，添加300 mg/kg 組脾臟指數(shù)分別增加16.81%和18.92%；試驗組脾臟中IFN-γ的表達顯著升高，血清中白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-6（IL-6）含量也顯著升高。張耀文等[43]研究添加0、50、100 mg/kg 天蠶素AMPs 對蛋雞生產(chǎn)性能、腸道黏膜等的影響，結(jié)果顯示，添加添加50、100 mg/kg組蛋雞的料蛋比顯著降低，回腸絨毛高度顯著提高，表明在蛋雞日糧中添加AMPs 可提高蛋雞生產(chǎn)性能，改善回腸腸道黏膜形態(tài)。Chen 等[44]研究表明，日糧中添加AMPs 可顯著提高產(chǎn)蛋量，降低料蛋比，并且影響蛋雞產(chǎn)蛋后期盲腸微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)。

4.3 在鴨養(yǎng)殖中的應(yīng)用

AMPs 可提高肉鴨生長性能，改善肉鴨的腸道健康，提高免疫力等[45-47]。陳曉生等[48]研究了在肉鴨基礎(chǔ)日糧分別添加1、2、3 mL/kg AMPs制劑對其增重、血清尿素氮和總蛋白等的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，添加不同水平AMPs 制劑均可提高平均日增重，2、3 mL/kg組增重幅度分別達3.90%和6.11%；凈肉率隨著AMPs 制劑添加量呈降低趨勢，其中添加3 mL/kg組與對照組差異顯著；添加2、3 mL/kg 組尿素氮濃度顯著低于對照組，各組總蛋白含量差異不顯著。陳曉生等[49]研究了在櫻桃谷雛鴨基礎(chǔ)日糧中添加不同水平AMPs 及金霉素對其腸道主要微生物菌落的影響，結(jié)果顯示，與不添加組相比，添加AMPs各組顯著降低了肉鴨盲腸中大腸桿菌菌落數(shù)，且效果優(yōu)于金霉素組，證明AMPs 可抑殺體內(nèi)有害的大腸桿菌，調(diào)節(jié)雛鴨腸道微生物菌群。余紹海[50]在白羽番鴨母雛日糧中添加天蠶素制劑AMPs，與未添加組相比，AMPs 組雛鴨成活率最高，達96.67%，顯著高于未添加組；平均日增重提高了4.66%，料重比降低了3.03%；腸道大腸桿菌數(shù)降低了1.49%，乳酸桿菌數(shù)增加了6.39%，證實了AMPs 除廣譜抗菌外，還可保障鴨腸道健康，促進生長。譚淑櫻[51]研究發(fā)現(xiàn)，從鴨腸道黏膜中分離出的AMPs 體外條件下，在濃度3.55～14.20 mg/L 范圍內(nèi)均可刺激鴨淋巴細胞的轉(zhuǎn)化增殖，從側(cè)面證實了AMPs 可在一定條件下增強機體免疫力。

4.4 在鵪鶉養(yǎng)殖中的應(yīng)用

AMPs可提高鵪鶉生長、生產(chǎn)性能，改善鵪鶉的腸道健康，提高機體免疫力等[52-53]。杜紅等[54]在鵪鶉日糧中分別添加0、0.1%、0.2%、0.4%的AMPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個試驗期（7～35 d），添加0.2%、0.4% AMPs組鵪鶉的平均日增重達3.63、3.74 g，顯著高于未添加組；料重比分別為4.03、4.04，顯著低于未添加組；血清新城疫抗體效價水平分別高于未添加組6.76%和5.83%；胸腺、脾臟指數(shù)分別為0.27、0.27 和0.08、0.09，顯著高于未添加組；IL-2、INF-γ 含量為30.23%、31.01%，顯著高于未添加組（20.30%、 16.67%）； 總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性顯著高于未添加組22.40%、32.62%；空腸重量顯著高于未添加組15.76%和24.24%。因此，AMPs可提高鵪鶉的生長性能、免疫功能，增強抗氧化能力，促進腸道發(fā)育，且以添加0.2%AMPs 效果最佳。朱曉萍等[55]研究發(fā)現(xiàn)，添加50、100、200 mg/kg AMPs，鵪鶉的產(chǎn)蛋率分別提高0.93%、1.84%和0.85%，蛋殼厚度提高幅度分別達3.37%、4.86%和5.46%，蛋黃顏色分別提高了2.31%、12.74%和12.27%，表明添加AMPs可提高鵪鶉生產(chǎn)性能，改善蛋品質(zhì)，建議添加量為50～100 mg/kg。張雪等[56]研究了AMPs 對鵪鶉免疫功能、腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)添加300 mg/kg AMPs 組α1、α2、β、γ 球蛋白含量比未添加組高84.57%、13.64%、18.45%、14.41%；IgA含量顯著高于未添加組68.75，IgG、IgM含量高于未添加組21.57%、0.98%；盲腸沙門氏菌顯著降低1.2%，乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著增高13%、0.85%；鵪鶉胸腺指數(shù)顯著增加8.26%，證實添加AMPs可增強鵪鶉免疫器官發(fā)育，促進免疫球蛋白合成，調(diào)節(jié)腸道菌群，添加量為300 mg/kg時效果最為顯著。李治利等[57]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加0.12 g/kg 蜂毒肽可顯著提高血清中IgG、IgA、補體C3、IFN-γ 含量、超氧化物歧化酶（SOD） 和GSH-Px活性，表明添加蜂毒肽可增強鵪鶉的免疫功能和抗氧化功能。

5 展望

AMPs 具有良好的抗微生物活性，不易產(chǎn)生耐藥性，可調(diào)節(jié)機體免疫性能，增強腸道健康，可以用于促進家禽生長，提高機體免疫機能，在畜禽養(yǎng)殖上得到廣泛應(yīng)用。但AMPs 的應(yīng)用推廣仍存在很多限制性因素，未來應(yīng)從結(jié)構(gòu)特征、藥代動力學(xué)及免疫調(diào)節(jié)機制等方面對AMPs進行全面分析，構(gòu)建合適的表達體系和改進表達策略，使用遺傳和人工修飾，將AMPs的抗菌功能最大化；通過酰胺化、D-氨基酸取代等循環(huán)方法和涂層的使用，提高AMPs在體內(nèi)的穩(wěn)定性和安全性，獲得許多低成本、高產(chǎn)、活性優(yōu)良的重組AMPs，為AMPs的科學(xué)應(yīng)用提供參考。