水稻抗稻癭蚊的離子組研究

蔣哲 范曉蘇 曹振宇 周桂花 陳英之 莫懌 覃寶祥 邱永福

摘要：【目的】探索水稻中不同營(yíng)養(yǎng)元素響應(yīng)稻癭蚊取食的差異，為稻癭蚊防治及水稻抗稻癭蚊機(jī)理闡釋提供新思路?！痉椒ā恳缘景`蚊抗性近等基因系43W-NIL和感性品系9311為材料，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測(cè)定抗感水稻材料在接種稻癭蚊后第0、5、7和9 d時(shí)植株體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)元素含量；利用水培法驗(yàn)證關(guān)鍵元素受稻癭蚊取食誘導(dǎo)的變化；通過qRT-PCR測(cè)定與營(yíng)養(yǎng)元素代謝相關(guān)基因在抗感材料中的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】離子組分析共鑒定25種營(yíng)養(yǎng)元素，大部分元素在抗感材料及稻癭蚊取食前后差異明顯。接種稻癭蚊后，與9311的第0 d相比，43W-NIL中Ti、K、P和S元素含量較高，而Pb、Sr和Ca元素含量較低。離子組的主成分分析發(fā)現(xiàn)，PC1和PC2分量分別解釋40.0%和24.7%的變異。主成分載荷分析結(jié)果表明，Ca、Sr、Co、Pb、Be、Sb、Fe、Ti、P、S和K的含量變化可以區(qū)分抗性和感性材料，且影響稻癭蚊抗性最重要的5種元素依次為Ca、Sr、P、K、Co。水培植株的接蟲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度的外源Ca處理可促進(jìn)稻癭蚊幼蟲在抗性水稻中生長(zhǎng)，而低濃度P、K處理會(huì)抑制稻癭蚊幼蟲在感性材料中生長(zhǎng)。qRT-PCR結(jié)果顯示，鈣調(diào)蛋白基因（OsCML20）表達(dá)量與Ca2+含量的變化趨勢(shì)相同；鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（OsHAK12）的表達(dá)量在抗感材料中均表現(xiàn)為先下降后上升。【結(jié)論】Ca、P和K等3種元素可能在水稻響應(yīng)稻癭蚊取食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。OsHAK12和OsCML20基因可能是稻癭蚊抗性表達(dá)機(jī)制中的重要基因。離子組學(xué)可從元素、營(yíng)養(yǎng)的角度發(fā)現(xiàn)水稻在被稻癭蚊取食時(shí)的差異，為植物抗蟲機(jī)理研究提供新思路。

關(guān)鍵詞： 水稻；稻癭蚊；離子組；營(yíng)養(yǎng)抗性；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S435.112.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0424-10

Abstract：【Objective】To explore changes of different nutrients in rice gall midge （RGM）-infested rice plants， and to provide new ideas for RGM prevention and control and resistance mechanism elucidation. 【Method】RGM-resistant near-isogenic line 43W-NIL and susceptible line 9311 were taken as materials， and inductively coupled plasma mass spectrome-try （ICP-MS） technique was used to determine nutrient element content in RGM-resistant and -susceptible rice materials at 0， 5， 7 and 9 d of inoculation； changes of key elements induced by insect infestation were verified by hydroponic me-thod； and expression of genes related to nutrient element metabolism was determined in susceptible material by qRT-PCR.【Result】A total of 25 nutrient elements were identified by ionome analysis， and most of them differed greatly in resistant and susceptible materials or before and after RGM infestation. After RGM inoculation， compared with 9311 at 0 d， in 43W-NIL， contents of Ti， K， P and S elements were higher， while contents of Pb， Sr and Ca elements were lower. Principal component analysis of the ionome revealed that the PC1 and PC2 components explained 40.0% and 24.7% of the variance， respectively. Principal component loading analysis showed that according to variation of Ca， Sr， Co， Pb， Be， Sb， Fe， Ti， P， S， and K content， resistant and susceptible materials could be distinguished， and in order of importance， elements affecting RGM resistance were Ca， Sr， P， K， and Co. The inoculation experiment of hydroponic plants revealed that high concentrations of exogenous Ca treatment promoted RGM larvae growth in resistant rice， while low P and K concentration treatments inhibited RGM larvae growth in susceptible materials. According to qRT-PCR results， calcium-regulated protein gene （OsCML20） expression showed the same changing trend as Ca2+ ion content， while potassium transporter protein gene （OsHAK12） expression showed a decrease and then an increase in both resistant and susceptible materials. 【Conclusion】Three elements， Ca， P and K may play a key role in the response of rice to RGM infestation. OsHAK12 and OsCML20 genes may be the important genes in RGM resistance expression mechanism. Ionomics could help explore difference of rice during RGM infestation， so as to provide new ideas for studies on plant insect resistance mechanism.

Key words： rice； Orseolia oryzae（rice gall midge）； ionome； nutritional resistance； gene expression

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （32260462）； Guangxi Natural Science Foundation （2020GXNSFDA297008）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa）是人類最重要的糧食作物之一，全世界有近一半人口以稻米為主食。水稻在整個(gè)生長(zhǎng)周期均會(huì)遭遇環(huán)境不適、營(yíng)養(yǎng)缺失、病蟲危害等逆境，導(dǎo)致其發(fā)育不良、減產(chǎn)、甚至整株死亡。害蟲是影響水稻生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一，由于抗蟲水稻品種老化，近年來各地的水稻蟲害發(fā)生越來越頻繁（嚴(yán)火其，2021）。危害水稻生長(zhǎng)的害蟲種類較多，其中稻癭蚊是影響水稻生長(zhǎng)的常見害蟲之一。稻癭蚊（Orseolia oryzae，Wood-Mason）（RGM）屬雙翅目癭蚊科，幼蟲會(huì)借助露水爬行，從葉鞘處進(jìn)入水稻幼苗，啃食生長(zhǎng)點(diǎn)，使其停止發(fā)育并形成蔥管狀畸形莖，導(dǎo)致該分蘗形成畸形分蘗，無法進(jìn)入生殖生長(zhǎng)。目前稻癭蚊的防治主要通過噴施農(nóng)藥或?qū)ふ铱瓜x基因并培育抗蟲品種，而探索稻癭蚊營(yíng)養(yǎng)抗性的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，探索不同營(yíng)養(yǎng)元素響應(yīng)稻癭蚊取食的差異，對(duì)水稻抗稻癭蚊研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來對(duì)稻癭蚊的研究主要集中在查找抗性基因方面，目前在水稻中已定位到12個(gè)抗性基因（郭輝等，2010；Leelagud et al.，2020），通過雜交育成抗蟲品種是防治稻癭蚊的主要手段。林成豹等（2013）以含有稻癭蚊抗性基因Gm6的水稻品種抗蚊青占為基因供體親本，三明顯性核不育水稻為載體，通過多次回交獲得含有Gm6的純合株系BSC9246；郭生河等（2017）利用三系不育系贛香A為母本，選用強(qiáng)優(yōu)恢復(fù)系雙抗明占為父本配組選育了雜交稻組合贛優(yōu)明占，該品種高抗稻癭蚊、稻瘟病。此外，前人還針對(duì)稻癭蚊取食后水稻植株的代謝和轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了研究。陳燦等（2021）測(cè)定了抗稻癭蚊水稻材料GXM-001-2和易感材料TN1的代謝組，發(fā)現(xiàn)脂肪酸及其衍生物、氨基酸、酚類、萜類和胺類可能在植物抗蟲防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；盧柏亦等（2022）通過測(cè)定稻癭蚊取食水稻前后的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)共有1206個(gè)基因響應(yīng)稻癭蚊取食，其中，與植物光合作用及次生代謝物合成相關(guān)的基因在抗感材料中表達(dá)量差異顯著。植物在生長(zhǎng)過程中離不開各種元素的吸收，而不同元素在植物體內(nèi)發(fā)揮著不同作用：作為細(xì)胞的組成成分或信號(hào)因子等。Lahner等（2003）通過拓寬Outten和OHalloran（2001）關(guān)于金屬組的概念，結(jié)合高通量測(cè)定手段，提出了離子組學(xué)的概念。離子組學(xué)是一種新興的組學(xué)分析手段，其利用高通量測(cè)序手段，如電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP-MS）等測(cè)定植物體內(nèi)的離子含量變化，研究離子在植物體內(nèi)的作用。自離子組學(xué)的概念提出以來，眾多學(xué)者將這項(xiàng)分析技術(shù)運(yùn)用到植物生理與生態(tài)學(xué)的研究之中。Lahner等（2003）通過測(cè)定13000株擬南芥中18種元素的含量，篩選出51個(gè)具有顯著表型的突變體。沙之敏等（2016）發(fā)現(xiàn)不同水稻種植模式的籽粒離子組存在顯著差異，離子組的主成分分析可以清晰地區(qū)分常規(guī)種植、綠色蛙稻和有機(jī)蛙稻3種種植模式。張曉燕等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，鉀元素可通過提高苜蓿碳水化合物的合成（尤其是可溶性糖和淀粉）及生長(zhǎng)性能來增強(qiáng)對(duì)薊馬的耐害性。唐鐸騰等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在CK和缺磷的條件下，雌雄青楊幼苗不同組織中10種元素含量存在顯著差異，離子組的主成分分析發(fā)現(xiàn)，PC1和PC2兩個(gè)分向量可很好地區(qū)分不同組織和不同處理間的差異。胡桂馨等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，施磷可增強(qiáng)苜蓿對(duì)薊馬的耐害性，在蟲害壓力適中時(shí)，施磷可提高苜蓿地上部分的補(bǔ)償生長(zhǎng)能力；而蟲壓較大時(shí)，施磷保證根系的生長(zhǎng)以維持其生存。劉揚(yáng)等（2022）通過分析武夷巖茶的離子組學(xué)及代謝組學(xué)，證實(shí)不同地域的武夷巖茶具有獨(dú)特的“地域香”，而磷是造成香味不同的關(guān)鍵元素?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，離子組學(xué)多應(yīng)用在植物缺素響應(yīng)的研究中，而在植物抗病蟲害方面的研究幾近空白狀態(tài)，關(guān)于水稻在抗稻癭蚊過程中的離子變化以及對(duì)稻癭蚊取食后的營(yíng)養(yǎng)元素響應(yīng)尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用ICP-MS測(cè)定抗感水稻接種稻癭蚊后不同時(shí)間點(diǎn)植株體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)元素含量，通過水培方法驗(yàn)證關(guān)鍵元素受稻癭蚊取食誘導(dǎo)的變化，并通過qRT-PCR測(cè)定與營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)基因的表達(dá)量，探究不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)稻癭蚊生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為水稻抗稻癭蚊研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

水稻品種抗蚊青占（43W），攜帶稻癭蚊抗性基因Gm6，高抗稻癭蚊中國(guó)Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型；品系9311，高感稻癭蚊；前期研究中，本研究團(tuán)隊(duì)已構(gòu)建以9311為遺傳背景包含Gm6的近等基因系，簡(jiǎn)稱43W-NIL（Li et al.，2020）。日本晴（NIP）、珍汕97（ZS97）、明恢63（MH63）和中花11（ZH11）均為稻癭蚊感性材料。供試水稻材料均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1. 2 稻癭蚊成蟲獲取

從廣西崇左市大新縣雷平鎮(zhèn)明仕田園（風(fēng)景區(qū)）附近稻田采集含有稻癭蚊的分蘗，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于14 d苗齡的感性品系9311上。稻癭蚊一般在7 d內(nèi)可完成羽化、交配及產(chǎn)卵，并在約25 d后繁殖出第1批成蟲。

1. 3 水稻材料抗性鑒定

參考Cheng等（2021）的方法，鐵皮托盤（58 cm×38 cm×9 cm）裝入適量的稻田土，縱向均分為2列，每列再均分為12列，共計(jì)24個(gè)長(zhǎng)方形格子。每格播種約20粒發(fā)芽種子并用網(wǎng)罩（44 cm×34 cm×44 cm）覆蓋。每個(gè)材料隨機(jī)播種3個(gè)重復(fù)。接蟲14 d后，受稻癭蚊侵害的幼苗呈現(xiàn)基部膨大現(xiàn)象，并開始出現(xiàn)形似蔥管的組織，稱之為“標(biāo)蔥”。接蟲20 d時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)材料標(biāo)蔥的數(shù)量，計(jì)算出蔥率，以此作為判斷水稻幼苗對(duì)稻癭蚊抗性的依據(jù)。

參考Cheng等（2021）的方法進(jìn)行杯播接蟲，用于離子組測(cè)定。杯內(nèi)裝入適量的稻田土，每杯分別播種12粒43W-NIL或9311已發(fā)芽種子，于14 d后接入6只稻癭蚊雌性成蟲進(jìn)行接蟲試驗(yàn)。接蟲后第0、5、7和9 d，每杯取3株幼苗用于離子組測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3杯。

1. 4 水稻幼苗水培及蟲長(zhǎng)測(cè)量

將發(fā)芽水稻種子間隔置于48孔底部磨平的PCR板中，在全營(yíng)養(yǎng)水培液培養(yǎng)14 d，隨后轉(zhuǎn)移到含有 15個(gè)獨(dú)立小格的水培盆（31 cm×24 cm×8 cm）中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)不同的試驗(yàn)處理添加不同的營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處理5 d，再接種稻癭蚊。水稻幼苗按每15株苗1頭雌蟲的比例進(jìn)行接蟲，接蟲后蓋上網(wǎng)罩并覆蓋遮光布，用水澆透保持濕度。接蟲后第9 d取樣，每處理取5株幼苗，3個(gè)重復(fù)共計(jì)15株苗。用解剖刀切開水稻幼苗并在體式顯微鏡（日本Olympus，SZ61）下測(cè)量稻癭蚊幼蟲的長(zhǎng)度。

1. 5 離子組測(cè)定

將樣品在105 ℃烘干至恒重后研磨粉碎過篩，每份樣品稱取0.25 g，在微波消解儀（MASTER 40，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）上消解，最后用2%硝酸定容至25 mL，定容后樣品中的B、Li、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、Mn、Mo、Ni、Pb、Sb、Se、Sr、Ti、Tl、V、Zn、Ca、K、Mg、P和S離子含量使用ICP-MS（美國(guó)PerkinElmer公司，NEXION 350X）進(jìn)行測(cè)定。感性材料9311接蟲后第0、5、7和第9 d的測(cè)定樣品（數(shù)據(jù)）分別以S0、S5、S7和S9表示，抗性材料43W-NIL相應(yīng)用R0、R5、R7和R9表示。

1. 6 營(yíng)養(yǎng)液配制

參考劉劍鑌（2018）的方法，配制A～G共7種母液，即1 L溶液中分別包含以下溶質(zhì)：A液，NH4NO3 80 g；B液，NaH2PO4·H2O 93.6 g；C液，K2SO4 52.4 g；D液，CaCL2 33.37 g；E液，MgCl2·6H2O 122 g；F液，F(xiàn)eCl3·6H2O 8.3 g；G液，H3BO3 3.01 g、MnSO4·5H2O 2.17 g、CuSO4·5H2O 0.075 g、ZnSO4·7H2O 0.2008 g、Na2MoO4·2H2O 0.024 g。使用時(shí)，每1 L水加母液1 mL，同時(shí)添加相同量的A～G母液時(shí)為全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液。配制低濃度水培液是在原有全營(yíng)養(yǎng)液基礎(chǔ)上，分別將Ca、K、P濃度降低一半（即母液D、C、B），而高濃度水培液則是將Ca、K、P濃度增加至原來的3倍（即母液D、C、B），其他元素不變。

1. 7 相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定

選取接蟲第0、5和7 d的幼苗，參照試劑盒說明書提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（RC411-01、R323-01，南京Vazyme公司），以獲得水稻幼苗的總cDNA，根據(jù)說明進(jìn)行qRT-PCR（qTOWER3，德國(guó)Analytik-Jena公司），獲得選定基因在水稻中的相對(duì)表達(dá)量。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，利用GraphPad Prism 8制作柱狀圖、箱線圖及熱圖。使用SIMAC 14進(jìn)行主成分分析（PCA），將偏最小二乘法判別分析應(yīng)用于離子組數(shù)據(jù)集，同時(shí)用其進(jìn)行主成分分析圖以及主成分載荷圖制作，對(duì)接種稻癭蚊后水稻植株內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素含量及稻癭蚊幼蟲長(zhǎng)度的變化規(guī)律進(jìn)行探索。

2 結(jié)果與分析

2. 1 43W-NIL的抗稻癭蚊鑒定結(jié)果

利用稻癭蚊侵染9311（圖1-A和圖1-B），在第20 d時(shí)出現(xiàn)明顯的蔥管（圖1-C）。接蟲后第9 d，43W和43W-NIL的蟲長(zhǎng)分別為0.516、0.518 mm，而9311植株中的幼蟲長(zhǎng)度達(dá)0.868 mm（圖1-D）。43W和43W-NIL的出蔥率僅為1%和2%，而9311為90%（圖1-E）。

2. 2 離子組測(cè)定結(jié)果

共測(cè)定抗感材料植株的25種營(yíng)養(yǎng)元素含量，將接種處理后S5、S7、S9、R0、R5、R7、R9與S0進(jìn)行比較，得到的比值繪制成熱圖（圖2）。從圖2可知，抗感材料中營(yíng)養(yǎng)元素的含量差異明顯。如，相比S0，接蟲后抗性材料植株的Ti、K、P和S含量明顯增加，而Pb、Sr和Ca含量明顯下降；感性材料中，接蟲處理后植株的Be和Pb含量呈下降趨勢(shì)，Cr、Mg和Sr含量則呈上升趨勢(shì)，而Hg、Ni和Tl含量在接蟲后第7和第9 d表現(xiàn)相反。在抗性材料中，相比R0，接蟲后植株的K含量明顯下降，而Cr、Cu、Fe、Pb、Sb、Se、Zn、Ca和Mg含量則呈先下降后上升的特點(diǎn)。

2. 3 離子組主成分分析結(jié)果

將抗感水稻材料測(cè)定的離子組導(dǎo)入到SIMAC 14中進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3。從圖3-A可看出，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的離子組數(shù)據(jù)具有明顯的空間分布特征，PC1和PC2兩個(gè)向量貢獻(xiàn)率共占64.7%，其中PC1分量能解釋全部8個(gè)樣品中40.0%的差異，能有效區(qū)分抗、感2個(gè)材料；PC2分量解釋總數(shù)據(jù)24.7%的差異，在該向量中，S0、S9、R0和R9出現(xiàn)在正象限，而S5、S7、R5和R7出現(xiàn)在負(fù)象限。同時(shí)發(fā)現(xiàn)S0與S9，R0與R9在雷達(dá)圖上的分布位置靠近，說明這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)植株各元素的含量相近；S5與S0，R5與R0分布較遠(yuǎn)，說明接蟲后水稻組織內(nèi)的元素含量發(fā)生了明顯變化。

由主成分載荷圖（圖3-B）可知，組Ⅰ和組Ⅱ分布在PC1向量正負(fù)兩個(gè)象限的最外端，而組Ⅲ和組Ⅳ則分布在PC2向量正負(fù)兩個(gè)象限的最外端。組Ⅰ和組Ⅱ的元素在分量PC1中權(quán)重較高，組Ⅰ中的Ca、Sr、Co、Pb、Be、Sb、Fe及組Ⅱ中的Ti、P、S、K元素含量變化規(guī)律為主要特征區(qū)分了抗性和感性材料；組Ⅲ的B、Zn、Mo及Ⅳ組的Hg、Li、Ni、Tl對(duì)分量PC2的影響最大，區(qū)分了接蟲后不同天數(shù)的差異。由載荷絕對(duì)值圖（圖3-C）可發(fā)現(xiàn)，在分量PC1中權(quán)重最高的前5種元素依次為Ca、Sr、P、K、Co，其中，在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用的大量元素有Ca、P和K。

2. 4 不同濃度Ca、P、K營(yíng)養(yǎng)液對(duì)稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)的影響

根據(jù)主成分分析結(jié)果，選取區(qū)分抗、感材料中作用最大的3個(gè)大量元素，即組Ⅰ的Ca、組Ⅱ的K和P元素進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。分別配制Ca、K、P的高濃度和低濃度2種水培營(yíng)養(yǎng)液，令稻癭蚊抗性秈稻43W-NIL和感性秈稻9311在不同濃度營(yíng)養(yǎng)液下培養(yǎng)，進(jìn)行稻癭蚊接種試驗(yàn)。由圖4-A可看出，在K、P兩種元素的高、低2種濃度水培條件下，43W-NIL中稻癭蚊幼蟲長(zhǎng)度與CK相比無顯著差異（P>0.05）；但在高濃度Ca營(yíng)養(yǎng)液中，抗性植株中稻癭蚊幼蟲長(zhǎng)度達(dá)0.756 mm，顯著高于CK（P<0.05，下同），而低濃度Ca營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的抗性植株未觀察到此現(xiàn)象。在高濃度P、K水培液處理下可促進(jìn)感性水稻9311植株中稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)，并顯著高于對(duì)照（圖4-B）；而低濃度P、K水培液處理能降低感性植株中稻癭蚊幼蟲的生長(zhǎng)速度，但仍大于同時(shí)期抗性材料中的幼蟲長(zhǎng)度。

2. 5 高低P、K濃度處理對(duì)感蟲水稻植株中稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)的影響

為探究不同濃度P、K水培對(duì)稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)的影響是否普遍，對(duì)稻癭蚊感性品種ZH11、NIP、ZS97、MH63進(jìn)行了接蟲試驗(yàn)。結(jié)果（圖5）顯示，在低濃度的P、K處理下，4個(gè)感性水稻幼苗中的稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)速度均減緩，且顯著低于CK。高濃度的P、K水培會(huì)促進(jìn)稻癭蚊幼蟲在感性水稻中生長(zhǎng)，但在不同品種中的表現(xiàn)存在差異。在NIP和MH63中，P元素對(duì)稻癭蚊幼蟲的影響比K元素?。▓D5-B和圖5-C），在相同濃度處理下，K元素處理的稻癭蚊幼蟲蟲長(zhǎng)變化幅度更大。在ZH11和ZS97中，低濃度的K元素處理對(duì)稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)影響較P元素大，而在高濃度營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，P元素對(duì)稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)的影響大于K元素（圖5-A和圖5-D）。

2. 6 Ca、P、K相關(guān)基因在水稻中的表達(dá)

本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中已測(cè)定稻癭蚊抗性水稻品種43W-NIL和感性水稻品種9311的轉(zhuǎn)錄組（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。結(jié)合離子組分析，本研究從轉(zhuǎn)錄組中選取7個(gè)與Ca、K、P元素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，且表達(dá)量存在明顯差異的基因，分別是鈣調(diào)蛋白基因OsCML20和OsCML4、鈣通道蛋白基因OsCCD1、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsHAK12和OsHAK5、鉀離子通道蛋白基因OsSKOR及磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsPT12，驗(yàn)證其在43W-NIL和9311中的表達(dá)差異。圖6-A-1結(jié)果顯示，Ca2+含量在43W-NIL中呈先下降后上升的變化趨勢(shì)；OsCML20的熒光定量結(jié)果（圖6-A-2）表明，43W-NIL中的表達(dá)量低于同一時(shí)間點(diǎn)的9311，同時(shí)其表達(dá)量變化趨勢(shì)與抗感材料內(nèi)Ca2+含量變化趨勢(shì)相同；OsCML4和OsCCD1的表達(dá)量在抗感材料中均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖6-A-3和圖6-A-4）。

圖6-B-1結(jié)果顯示，43W-NIL與9311植株內(nèi)的K+含量存在顯著差異，43W-NIL的K+含量均高于同時(shí)間點(diǎn)的9311。在與K相關(guān)的3個(gè)基因中，OsHAK12和OsHAK5在不同時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)了表達(dá)量差異，且OsHAK12在2個(gè)材料中均呈現(xiàn)相對(duì)表達(dá)量先下降后上升的變化趨勢(shì)（圖6-B-2和圖6-B-3）。43W-NIL中，OsSKOR的相對(duì)表達(dá)量會(huì)隨著接蟲時(shí)長(zhǎng)變長(zhǎng)而上升；而在9311中，OsSKOR的相對(duì)表達(dá)量在第5 d時(shí)出現(xiàn)跨越式增長(zhǎng)，但在第7 d時(shí)增長(zhǎng)速度放緩，與第5 d持平（圖6-B-4）。

圖6-C-1結(jié)果顯示，43W-NIL中P離子含量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，而在9311中則呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。OsPT12的熒光定量結(jié)果（圖6-C-2）顯示，OsPT12在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量在抗感材料中存在顯著差異，同時(shí)，相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)第5 d時(shí)上升、第7 d時(shí)下降，且均大于第0 d的現(xiàn)象。

3 討論

已有研究表明，ICP-MS法可精確測(cè)定樣品中的元素含量并應(yīng)用于差異分析。沈靜等（2014）利用該方法測(cè)定新疆野生櫻桃李及栽培品種果肉中17種元素含量，發(fā)現(xiàn)其栽培種和野生種果實(shí)中K、Ca、Mg含量最高；李雙男等（2019）測(cè)定不同鹽堿脅迫下棉花中13種元素含量的變化，發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫制約P、K、Ca、Mg、Zn、Mn、Fe向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，使棉花離子調(diào)控能力下降導(dǎo)致離子失衡，棉花體內(nèi)Na含量顯著增加；李剛等（2022）測(cè)定了小麥幼苗中11種元素在2種磷素水平處理下的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)低磷供應(yīng)有助于維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)對(duì)干旱脅迫的耐性。本研究利用ICP-MS法測(cè)定25種與稻癭蚊取食相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)元素，發(fā)現(xiàn)Ca、Sr、P、K、Co在抗感材料中存在明顯差異。可見，ICP-MS法能有效鑒定稻癭蚊取食水稻后水稻植株離子組差異變化，為后續(xù)離子參與功能研究打下基礎(chǔ)，也為其他水稻抗蟲離子組學(xué)研究提供參考。

K是一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素，可提高農(nóng)作物的抗逆性及耐受性。在不同的互作模式中，K發(fā)揮的作用也不同。在針對(duì)刺吸式水稻害蟲褐飛虱的研究中，外源添加K肥可起到提高植株K含量的作用，但會(huì)降低植物組織中游離糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量，導(dǎo)致水稻植株在被褐飛虱取食后相對(duì)含水量的降低幅度最小，這有助于提高水稻植株對(duì)褐飛虱的耐受性（Rashid et al.，2016）。而在Amtmann等（2008）的研究中發(fā)現(xiàn)K缺乏的植物中水楊酸和茉莉酸的水平較高，可能會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)昆蟲的免疫防御。在本研究中，高濃度的K、P營(yíng)養(yǎng)液會(huì)促進(jìn)稻癭蚊幼蟲在感性水稻中生長(zhǎng)。在低濃度的K、P培養(yǎng)液處理時(shí)，感性水稻幼苗中的稻癭蚊幼蟲生長(zhǎng)受到抑制，蟲長(zhǎng)相比CK顯著降低。說明稻癭蚊的抗性機(jī)理較其他常見害蟲有所不同，還有待進(jìn)一步探究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的Ca會(huì)促進(jìn)抗性水稻中稻癭蚊幼蟲的生長(zhǎng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中增加Ca肥能提高植物的抗逆境及抗病能力（劉峰等，2004）。Zeng等（2020）的研究結(jié)果表明，增加基質(zhì)中CaCl2的添加量可促進(jìn)蕓豆葉片脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）和β-1，3-葡聚糖酶活性提升，增強(qiáng)植株對(duì)薊馬的抗性。在本研究中，43W-NIL的Ca含量限制在很低水平，其含量遠(yuǎn)低于9311，而施加外源Ca能促進(jìn)稻癭蚊的生長(zhǎng)，表明Ca對(duì)水稻抗稻癭蚊具有重要作用。

作為重要的信號(hào)因子之一，Ca2+在響應(yīng)稻癭蚊侵染的過程中發(fā)揮了重要作用。在水稻接種稻癭蚊后的第5 d，3個(gè)與Ca相關(guān)基因的表達(dá)量均出現(xiàn)了變化，且其在抗性材料中的表達(dá)量均低于感性材料，其中，OsCML20表達(dá)量與相同時(shí)間點(diǎn)43W-NIL中Ca2+含量的變化趨勢(shì)一致，說明OsCML20可能是抗性材料中調(diào)節(jié)Ca2+濃度的主要基因。本研究發(fā)現(xiàn)與K+相關(guān)的3個(gè)基因中在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)各有差異，且與對(duì)應(yīng)的K+含量沒有共同的變化趨勢(shì)。Liu等（2022）在研究水稻根結(jié)線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，K2SO4通過快速誘導(dǎo)并積累過氧化氫及增加胼胝體，減少了水稻植株中的蟲癭和線蟲，推遲了線蟲的發(fā)展；同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)，在鉀通道OsAKT1和轉(zhuǎn)運(yùn)體OsHAK5基因缺陷的植株中出現(xiàn)了較野生型更多的癭瘤和線蟲。本研究中，9311中OsHAK5和OsHAK12基因的表達(dá)量均高于43W-NIL，與Liu等（2022）的研究結(jié)果存在差異。與P離子相關(guān)的基因OsPT12起到吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸鹽的功能，其表達(dá)量會(huì)受到外界環(huán)境因素和自身磷素水平的影響（孫雅菲等，2020）。本研究中，抗感材料中OsPT12的相對(duì)表達(dá)量在接蟲后第5 d均出現(xiàn)明顯的上升，而在第7 d時(shí)出現(xiàn)下降，但未恢復(fù)到接種稻癭蚊前的水平，而P離子含量則呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。說明在接種稻癭蚊后，稻癭蚊啃食水稻生長(zhǎng)點(diǎn)，可能會(huì)造成水稻幼苗P元素流失，出現(xiàn)低P脅迫，OsPT12基因需要提高表達(dá)量促進(jìn)水稻幼苗對(duì)土壤中P元素的吸收。說明OsPT12基因起到維持水稻中P元素動(dòng)態(tài)平衡的作用。

4 結(jié)論

影響稻癭蚊抗性最重要的5種元素依次為Ca、Sr、P、K和Co；減少培養(yǎng)液中Ca、K和P含量可在一定程度上減緩稻癭蚊幼蟲的生長(zhǎng)速度，降低稻癭蚊發(fā)生世代，表明Ca、P和K可能在水稻響應(yīng)稻癭蚊取食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。OsHAK12和OsCML20基因可能是稻癭蚊抗性表達(dá)機(jī)制中的重要基因。離子組學(xué)可從元素、營(yíng)養(yǎng)的角度發(fā)現(xiàn)水稻在被稻癭蚊取食時(shí)的差異，為植物抗蟲機(jī)理研究提供新思路。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）