真空冷藏條件下羅非魚(yú)內(nèi)源蛋白酶對(duì)魚(yú)片質(zhì)構(gòu)劣化的作用

范銘良 郝淑賢 李來(lái)好 陳勝軍 岑劍偉 吳燕燕 魏涯 相歡 黃卉

摘要：【目的】探究冷藏期間造成羅非魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化的關(guān)鍵蛋白酶，為提升冷藏魚(yú)肉品質(zhì)提供理論依據(jù)?！痉椒ā繉?duì)羅非魚(yú)魚(yú)片進(jìn)行真空包裝，于4 ℃下冷藏，在0～6 d內(nèi)對(duì)魚(yú)肉進(jìn)行質(zhì)構(gòu)、pH、肌原纖維小片化指數(shù)（MFI）、內(nèi)源蛋白酶活性及在不同細(xì)胞器的分布和肌原纖維SDS-PAGE圖譜測(cè)定，并通過(guò)皮爾遜相關(guān)分析確定冷藏期間造成魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化的關(guān)鍵蛋白酶?！窘Y(jié)果】冷藏過(guò)程中，羅非魚(yú)魚(yú)肉pH呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，最終pH為6.68；硬度和MFI分別呈下降和升高的趨勢(shì)；組織蛋白酶B+L活性變化整體表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，第6 d時(shí)活性為初始值的1.27倍，在肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在溶酶體中活性呈下降趨勢(shì)；組織蛋白酶B、D活性變化整體表現(xiàn)為先升高后降低，且均在第4 d達(dá)最大值，分別為初始值的1.20和1.48倍，肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶B活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，溶酶體中的組織蛋白酶B活性呈下降趨勢(shì)，肌原纖維和肌漿蛋白中的組織蛋白酶D活性呈升高趨勢(shì)，溶酶體和線粒體中的組織蛋白酶D活性呈降低趨勢(shì)；鈣離子濃度呈升高趨勢(shì)，鈣激活蛋白酶活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜中肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白輕鏈的條帶逐漸減少和模糊；組織蛋白酶B、B+L活性與魚(yú)肉硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01，下同），與魚(yú)肉MFI呈極顯著正相關(guān)；組織蛋白酶D和鈣激活蛋白酶活性與魚(yú)肉硬度和MFI無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。【結(jié)論】組織蛋白酶B和組織蛋白酶L參與肌原纖維蛋白的降解和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可能是冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化的2個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)酶，可采取有效技術(shù)手段對(duì)其活性進(jìn)行抑制，進(jìn)而提升貯藏期間魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)源蛋白酶；質(zhì)構(gòu)品質(zhì)；魚(yú)肉貯藏；肌原纖維蛋白；羅非魚(yú)魚(yú)片

中圖分類號(hào)：S986.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0555-09

Abstract：【Objective】 To investigate key proteases that caused deterioration of tilapia meat texture quality during refrigeration， and to provide a theoretical basis for refrigerated fish meat quality improvement. 【Method】Tilapia fillets were vacuum-packed and refrigerated at 4 ℃，and texture，pH，myofibril fragmentation index （MFI），endogenous protease activity， endogenous protease distribution in organelles and myofibril SDS-PAGE profiles were determined during 0-6 d. Key proteases that caused the deterioration of fish meat texture during refrigeration were identified through Pearson correlation analysis. 【Result】pH of tilapia fish meat decreased and then increased during refrigeration，with a final pH of 6.68； hardness decreased but MFI increased； cathepsin B+L activity increased overall as it was 1.27 times of its initial value on 6 d， and it first increased and then decreased in myofibril， myogen and mitochondria but it decreased in lysosome； cathepsin B activity and cathepsin D activity increased and then decreased， and they both reached the maximum on 4 d， which were 1.20 times and 1.48 times of their initial values， respectively. Cathepsin B activity in myofibril， myogen and mitochondria first increased and then decreased but it decreased in lysosome； cathepsin D activity increased in myofibril and myogen， but it decreased in lysosome and mitochondria； calcium ion concentration increased and calcium-activated protease activity first increased and then decreased； myofibrillar protein SDS-PAGE profile showed that bands of myosin heavy chain， actin， and myosin light chain became less and blurred； cathepsin B activity and cathepsin B+L activity had an extremely negative correlation with fish meat hardness（P<0.01，the same below）， and they also had an extremely negative correlation with MFI of fish meat； cathepsin D activity and calcium-activated protease activity were not significantly correlated with fish meat hardness or MFI（P>0.05）. 【Conclusion】Cathepsin B and cathepsin L participate in myofibrillar protein degradation and mitochondria-mediated apoptosis， and such situation may be attributed to the two key target enzymes for tilapia meat deterioration during refrigeration. Available techniques can be taken to inhibit their activity to improve fish meat texture quality during storage.

Key words： endogenous protease； texture quality； fish meat storage； myofibrillar protein； tilapia fillet

Foundation items：National Special Freshwater Fish Industry Technology System Project（CARS-46）；Fundamental Research Funds for Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD69）；Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences（2021SD06）

0 引言

【研究意義】羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）含有豐富的氨基酸，是一種高蛋白的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類（熊雅雯等，2022）。我國(guó)是羅非魚(yú)生產(chǎn)大國(guó)，2020年羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)165.54萬(wàn)t，占淡水魚(yú)總產(chǎn)量的6.4%（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2021），具有極好的發(fā)展前景。隨著羅非魚(yú)市場(chǎng)的擴(kuò)大，消費(fèi)者對(duì)魚(yú)肉的品質(zhì)要求更高，只需通過(guò)簡(jiǎn)單的觸碰就能判斷魚(yú)肉的硬度，但魚(yú)肉在運(yùn)輸和貯藏期間軟化現(xiàn)象十分嚴(yán)重，影響羅非魚(yú)消費(fèi)市場(chǎng)。因此，明確羅非魚(yú)在冷藏過(guò)程中魚(yú)肉軟化的潛在靶點(diǎn)，對(duì)于提高羅非魚(yú)在貯藏儲(chǔ)運(yùn)期間質(zhì)構(gòu)品質(zhì)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】魚(yú)肉的質(zhì)地是消費(fèi)者判斷其新鮮的重要指標(biāo)，魚(yú)肉在貯藏期間質(zhì)地品質(zhì)劣化十分嚴(yán)重。Bao等（2020）發(fā)現(xiàn)青魚(yú)（Mylopharyngodon piceus）在冷藏過(guò)程中隨著肌鈣蛋白、肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的降解，肌纖維與肌原纖維出現(xiàn)縫隙，可能是魚(yú)肉在貯藏過(guò)程中品質(zhì)下降的一個(gè)原因。Tang等（2020）研究鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi）死后貯藏結(jié)構(gòu)蛋白與肌肉品質(zhì)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白被降解會(huì)影響肌原纖維的完整性，從而影響肌肉品質(zhì)。Zhou等（2020）研究河豚魚(yú)（Takifugu obscurus）肌肉品質(zhì)與貯藏溫度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在0 ℃時(shí)魚(yú)肉的肌原纖維完整性最好；肌原纖維的完整性越好，魚(yú)肉的肌肉品質(zhì)就越好。貯藏期間魚(yú)肉質(zhì)地劣化是迫切需要解決的問(wèn)題，近年來(lái)，內(nèi)源蛋白酶在魚(yú)肉質(zhì)地劣化中的作用受到關(guān)注，目前認(rèn)為涉及到肌原纖維等蛋白降解主要是鈣激活蛋白酶系統(tǒng)和組織蛋白酶系統(tǒng)進(jìn)行的（Zhang and Xie，2020）。鈣激活蛋白酶是鈣依賴型的細(xì)胞內(nèi)中性半胱氨酸蛋白酶，其活性與鈣離子濃度相關(guān)（孫蕾蕾等，2014）。Chéret等（2007）研究?jī)?nèi)源蛋白酶與對(duì)舌齒鱸（Dicentrarchus labrax L.）魚(yú)肉肌原纖維蛋白降解的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)鈣激活蛋白酶系統(tǒng)對(duì)海鱸魚(yú)肌原纖維蛋白降解過(guò)程是次要作用。組織蛋白酶中能引起肌原纖維降解，導(dǎo)致魚(yú)肉品質(zhì)劣化的主要是組織蛋白酶B、D和L。Nielsen和Nielsen（2001）在鯡魚(yú)（Clupea harengus）中發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D能降解肌球蛋白重鏈。Ladrat等（2003）在研究海鱸魚(yú)蛋白水解中發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L能降解魚(yú)肉中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，且能與組織蛋白酶B同時(shí)降解肌球蛋白重鏈。Godiksen等（2009）在研究虹鱒魚(yú)（Oncorhynchus mykiss）肌肉蛋白降解中發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B、D和L能對(duì)肌肉蛋白進(jìn)行降解，且組織蛋白酶D對(duì)魚(yú)肉硬度影響明顯。Lomiwes等（2014）發(fā)現(xiàn)在低pH情況下，組織蛋白酶B活性越高，肌間線蛋白降解越快，肌間線蛋白降解會(huì)導(dǎo)致肌原纖維束解離?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有一些對(duì)內(nèi)源性蛋白酶和魚(yú)肉軟化的研究，但有關(guān)羅非魚(yú)鮮見(jiàn)報(bào)道，不同的魚(yú)類因品種和生長(zhǎng)環(huán)境不同，魚(yú)肉內(nèi)源蛋白酶與肌肉蛋白也不相同，且負(fù)責(zé)質(zhì)地軟化的每種組織蛋白酶的相對(duì)作用有所不同（Godiksen et al.，2009；Wang et al.，2009；Ahmed et al.，2013）。此外，關(guān)于內(nèi)源性蛋白酶及組織蛋白酶亞細(xì)胞再分布在羅非魚(yú)冷藏儲(chǔ)存期間魚(yú)片質(zhì)地變化中的作用，目前發(fā)表的信息有限?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以尼羅羅非魚(yú)魚(yú)片為試驗(yàn)材料，研究羅非魚(yú)魚(yú)肉真空包裝在4 ℃條件下冷藏0～6 d內(nèi)質(zhì)構(gòu)變化、鈣離子濃度變化、鈣激活蛋白酶活性變化、肌原纖維蛋白降解程度、組織蛋白酶活性變化及其亞細(xì)胞再分布，并確定在冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉軟化的靶點(diǎn)，為提升冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

尼羅羅非魚(yú)購(gòu)自廣州市華潤(rùn)萬(wàn)家超市，質(zhì)量為800±50 g/條。Fura-2 AM、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白、5×SDS-PAGE上樣緩沖液和考馬斯亮藍(lán)染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC和N-Suc-Leu-Tyr-AMC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NuPAGETM Bis-Tris預(yù)制膠（12%）和NuPAGETM MOPS SDS電泳緩沖液（20×）購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)自廣州領(lǐng)馭生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：3K30型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）、Sunrise-basic Tacan吸光酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）、Mini Gel Tank蛋白電泳槽（美國(guó)Invitrogen公司）、CT3質(zhì)構(gòu)儀（美國(guó)Brookfield公司）、Image Scanner III凝膠成像掃描儀（美國(guó)GE公司）和Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國(guó)VARIAN公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 羅非魚(yú)樣品處理 將8條鮮活的羅非魚(yú)敲擊致死，將背部新鮮白肉切成2 cm×2 cm×1 cm的塊狀，共46個(gè)樣品，對(duì)樣品真空包裝并進(jìn)行4 ℃冷藏。

1. 2. 2 魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)測(cè)定 參考黃卉等（2018）的方法稍作修改，取羅非魚(yú)魚(yú)片2條對(duì)角線上的6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置測(cè)試速度為30 mm/min，下壓縮距離0.3 cm，記錄測(cè)定的硬度值。

1. 2. 3 魚(yú)肉pH測(cè)定 參考GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1. 2. 4 肌原纖維小片化指數(shù)（Myofibril fragmentation index，MFI）測(cè)定 參考張?jiān)娙龋?022）的方法稍作修改，取2 g魚(yú)肉與30 mL緩沖液（25 mmo/L磷酸鹽緩沖液、100 mmol/L KCI、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2，pH 7.0）在冰水中均質(zhì)30 s，間隔20 s后再均質(zhì)30 s，用紗布過(guò)濾，將混合液離心15 min（4 ℃，10000×g），將沉淀再溶于緩沖液中，轉(zhuǎn)速離心15 min（4 ℃，10000×g），將所得沉淀懸于緩沖液中，將樣品蛋白濃度稀釋為0.5 mg/mL，將540 nm處測(cè)得的吸光值乘以200即為MFI。

1. 2. 5 肌原纖維蛋白提取 參考李銳等（2020）的方法稍作修改，稱取2 g羅非魚(yú)碎肉，加入10 mL Tris-HCl緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl、1mmol/L PMSF，pH 7.2），均質(zhì)30 s，間隔20 s后再均質(zhì)30 s，均質(zhì)后離心15 min（4 ℃，10000×g），加入20 mL鹽溶液（0.06 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L PMSF，pH 7.2）溶解沉淀后均質(zhì)1 min，溫度保持在4 ℃左右，靜置30 min后離心15 min（4 ℃，10000×g），上清液即為肌原纖維蛋白。

1. 2. 6 肌原纖維蛋白變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 參考李銳等（2020）的方法稍作修改，上清液與上樣緩沖液混合，體積比為3∶2，在沸水中放置3 min，得到電泳樣品。電泳電壓設(shè)為100 V，染色1 h，脫色1 h，染色劑為考馬斯亮藍(lán)R250，脫色液由10%醋酸、40%乙醇和50%水組成。

1. 2. 7 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離 羅非魚(yú)肌原纖維和溶酶體分級(jí)與提取參考Ge等（2015）的方法，取3 g魚(yú)肉在15 mL緩沖液中（100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L Na4P2O7、1 mmol/L Na2EDTA，pH 7.2）均質(zhì)1 min，用紗布過(guò)濾后離心10 min（4 ℃，1100×g），將沉淀懸于緩沖液中即為肌原纖維部分，將剩余的上清液離心（4 ℃，3000×g）10 min，此時(shí)的沉淀為線粒體部分，將上清液繼續(xù)離心30 min（4 ℃，16000×g），沉淀為溶酶體部分，上清液為肌漿。

1. 2. 8 鈣離子濃度測(cè)定 參考Thompson等（2020）的方法稍有修改，取3 g絞碎的魚(yú)肉與30 mL預(yù)冷緩沖液（118 mmol/L NaCl、4 mmol/L KCl、66 mmol/L MgCl2、330 mmol/L HEPES、5 mmol/L NaH2PO4、5 mmol/L葡萄糖）混合，混勻后離心15 min（4 ℃，5000×g），將上清液與1 μmol/L Fura-AM在室溫下靜置1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定混合液在發(fā)射波長(zhǎng)510 nm、激發(fā)波長(zhǎng)分別在340和380 nm的吸光值，340與380 nm處吸光值之比即為鈣離子濃度。

1. 2. 9 鈣激活蛋白酶和組織蛋白酶B、D、L的提取及活性測(cè)定 參考Xu等（2015）的方法，取10 g魚(yú)肉加入20 mL 20 mmol/L Tris溶液（pH 7.5），均質(zhì)30 s，間隔20 s后再均質(zhì)30 s，在4 ℃下不時(shí)攪拌30 min，隨后離心20 min（4 ℃，16000×g），上清液即為粗酶提取液。組織蛋白酶B和L特異性熒光底物分別為Z-Arg-Arg-AMC和Z-Phe-Arg-AMC，鈣激活蛋白酶反應(yīng)底物為N-Suc-Leu-Tyr-AMC，底物濃度均為20 μmol/L。取粗酶液0.5 mL，與0.25 mL反應(yīng)緩沖液（組織蛋白酶B：352 mmol/L KH2PO4、48 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L Na2EDTA，pH 6.0，使用前配制成含8 mmol/L L-Cys的新鮮溶液；組織蛋白酶L：340 mmol/L NaAc、60 mmol/L HAc、4 mmol/L Na2EDTA，pH 5.5，使用前配制成含8 mmol/L DTT的新鮮溶液；鈣激活蛋白酶：150 mmol/L Tris-HCl、7.5 mmol/L CaCl2，pH 6.0）混合，在37 ℃恒溫箱中預(yù)熱10 min，加入對(duì)應(yīng)的反應(yīng)底物，反應(yīng)30 min后加入2.5 mL終止液（50 mmol/L Tris-HCl、1% SDS，pH 7.0）。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的釋放量。測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)340 nm、發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。酶活力單位定義為1 min內(nèi)釋放出1 μmol/L AMC所需的酶量。

組織蛋白酶D的提取與活性測(cè)定（李來(lái)好等，2015）：稱取15 g碎魚(yú)肉，加入10倍體積的預(yù)冷丙酮，均質(zhì)后用布氏漏斗過(guò)濾，濾液風(fēng)干，得到丙酮粉，加入20 mL KCl溶液（2%），混勻后離心15 min（4 ℃，10000×g），所得上清液即為組織蛋白酶D粗酶液。取酶液與酸化的牛血紅蛋白反應(yīng)，參考Lowry法測(cè)定釋放出的多肽，每個(gè)酶活力單位定義為1 min內(nèi)釋放1 μmol/L Tyr所需的酶量。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0和Origin 8.5處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行相關(guān)分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 羅非魚(yú)魚(yú)肉在冷藏期間pH、硬度和MFI的變化

魚(yú)肉貯藏過(guò)程中pH變化能反映肌肉組織的生化變化，肌肉組織生理環(huán)境的改變會(huì)影響肌肉品質(zhì)，因此pH是衡量魚(yú)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。由表1可知，真空冷藏0～3 d，羅非魚(yú)魚(yú)肉pH顯著降低（P<0.05，下同），在3～4 d pH略有升高，在5～6 d pH無(wú)顯著變化（P>0.05，下同），最終pH為6.68。

魚(yú)肉硬度是反映魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是消費(fèi)者判斷魚(yú)肉新鮮度的一種方式。如表1所示，在真空冷藏條件下，羅非魚(yú)魚(yú)肉在0～5 d內(nèi)硬度顯著降低，在5～6 d硬度無(wú)顯著變化，最終魚(yú)肉硬度較初始值下降59.05%。

MFI能反映肌原纖維結(jié)構(gòu)和肌原纖維蛋白的完整性。如表1所示，在冷藏期間，羅非魚(yú)魚(yú)肉MFI在0～6 d內(nèi)顯著增加，最終值為初始值的2.44倍。

2. 2 冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉中組織蛋白酶B、B+L和D的活性變化

羅非魚(yú)在貯藏過(guò)程中質(zhì)地品質(zhì)劣化主要由內(nèi)源蛋白酶對(duì)肌原纖維的降解導(dǎo)致，為進(jìn)一步明確魚(yú)肉質(zhì)地劣化的重要蛋白酶，對(duì)魚(yú)肉貯藏過(guò)程中內(nèi)源蛋白酶的活性進(jìn)行考察。如圖1所示，在整個(gè)冷藏期間，組織蛋白酶B+L活性變化整體為升高趨勢(shì)，在第6 d時(shí)活性為初始值的1.27倍；組織蛋白酶B和D活性變化整體為先升高后降低，且均在第4 d達(dá)最大值，分別為初始值的1.20和1.48倍，第6 d時(shí)組織蛋白酶D活性為初始值的1.56倍。

2. 3 冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉中組織蛋白酶B、B+L、D活性及分布變化

魚(yú)體死后，肌肉細(xì)胞中的組織蛋白酶從溶酶體中釋放后，會(huì)發(fā)揮其蛋白水解作用。如圖2所示，冷藏期間魚(yú)肉肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶B活性整體變化為先升高后下降，分別在第1、2和1 d達(dá)最大值，此時(shí)活性分別為初始值的1.02、1.10和1.55倍，之后隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)活性下降，第6 d時(shí)，活性分別為初始值的70%、89%和1.15倍；在溶酶體中組織蛋白酶B活性呈下降趨勢(shì)，第6 d活性降低11.75%。冷藏期間魚(yú)肉肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶B+L活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且均在第2 d達(dá)最大值，活性分別為初始值的1.27、1.61和1.11倍，之后隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)活性下降，第6 d時(shí)活性分別為初始值的1.20倍、1.28倍和98%；在溶酶體中組織蛋白酶B+L活性呈下降趨勢(shì)，貯藏至第6 d時(shí)活性降低10.00%（圖3）。由圖4可知，冷藏期間魚(yú)肉肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶D活性變化與組織蛋白酶B、L不同，肌原纖維和肌漿蛋白中的組織蛋白酶D活性在冷藏期間呈持續(xù)上升趨勢(shì)，第6 d時(shí)活性分別為初始值的2.18和1.75倍；而溶酶體和線粒體中的組織蛋白酶D活性在冷藏期間呈下降趨勢(shì)，在第6 d時(shí)活性分別降低54.94%和95.79%。

2. 4 冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉肌漿中鈣離子濃度和鈣激活蛋白酶活性變化

由圖5可知，在0～1 d羅非魚(yú)魚(yú)肉鈣激活蛋白酶活性顯著增加，提升43.00%，魚(yú)肉肌漿中鈣離子濃度在0～1 d內(nèi)也顯著增加（圖6），但隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)鈣激活蛋白酶活性降低，最終活性接近于初始值。而鈣離子濃度在0～4 d內(nèi)顯著增加，在4～6 d內(nèi)無(wú)顯著變化，最終值為初始值的1.36倍。

2. 5 羅非魚(yú)貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE作用

由圖7可知，冷藏6 d的羅非魚(yú)魚(yú)肉肌原纖維蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為17～220 kD；其中，肌球蛋白重鏈（Myosinheavychain，MHC）（相對(duì)分子質(zhì)量220 kD）、肌動(dòng)蛋白（Actin）（相對(duì)分子質(zhì)量45 kD）和肌球蛋白輕鏈（Myosinlightchain，MLC）（相對(duì)分子質(zhì)量17～20 kD）條帶相對(duì)清晰。在0～6 d內(nèi)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，MHC、肌動(dòng)蛋白和MLC的條帶逐漸減少和模糊，反映了在貯藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉肌原纖維蛋白降解情況。

2. 6 魚(yú)肉內(nèi)源蛋白酶活性與魚(yú)肉硬度和MFI的相關(guān)分析結(jié)果

對(duì)冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉中的內(nèi)源蛋白酶活性與魚(yú)肉硬度和MFI進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析，結(jié)果如表2所示，冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉中組織蛋白酶B、B+L活性與魚(yú)肉硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01，下同），與魚(yú)肉MFI呈極顯著正相關(guān)；組織蛋白酶D和鈣激活蛋白酶活性與魚(yú)肉硬度和MFI無(wú)顯著相關(guān)性。

3 討論

3. 1 冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉理化指標(biāo)的變化

魚(yú)肉硬度和MFI作為反映魚(yú)肉質(zhì)量和組織特征的重要指標(biāo)，由于魚(yú)肉汁液流失、蛋白質(zhì)降解和變性氧化等而導(dǎo)致魚(yú)肉組織有不同程度的硬度變化，而MFI能反映肌原纖維的完整性。因此，硬度和MFI在魚(yú)肉及其產(chǎn)品的科學(xué)研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中具有重要意義。郝子娜等（2022）對(duì)4 ℃下的草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）魚(yú)肉在0～9 d內(nèi)品質(zhì)變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)魚(yú)肉硬度不斷下降。陳曉楠等（2022）發(fā)現(xiàn)凍藏的海鰻魚(yú)（Muraenesox cinereus）魚(yú)肉在0～120 d內(nèi)MFI隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)升高趨勢(shì)。本研究中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，羅非魚(yú)魚(yú)肉中的肌原纖維蛋白在內(nèi)源蛋白酶的作用下被持續(xù)降解，造成魚(yú)肉硬度的下降和MFI的升高。在魚(yú)肉貯藏期間，活性蛋白酶引起的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分解是造成魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化的主要原因，且在貯藏前期發(fā)揮的作用遠(yuǎn)高于微生物（Zhang and Xie，2020）。

pH是衡量魚(yú)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。羅非魚(yú)被宰殺后，由于厭氧呼吸過(guò)程中生成的乳酸和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）被降解生成磷酸，導(dǎo)致魚(yú)肉pH下降，而后隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)被降解，生成的堿性胺類物質(zhì)導(dǎo)致魚(yú)肉pH上升。官緣等（2022）研究發(fā)現(xiàn)海鱸魚(yú)魚(yú)肉在冷藏0～10 d內(nèi)pH變化為先下降后升高，本研究在冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉pH變化也為先下降后升高，與官緣等（2022）的研究結(jié)果一致。

3. 2 冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉組織蛋白酶B、B+L和D在不同細(xì)胞器的分布

有研究報(bào)道證實(shí)在魚(yú)肉貯藏期間，組織蛋白酶B、D和L是造成魚(yú)肉軟化的主要原因（Godiksen et al.，2009）。組織蛋白酶主要存在于溶酶體中，與底物無(wú)法接觸，因此在活魚(yú)體內(nèi)通常為無(wú)活性狀態(tài)；而魚(yú)死后的冷藏過(guò)程中，鈣離子濃度增加和pH降低導(dǎo)致溶酶體破壞，使得組織蛋白酶釋放，對(duì)魚(yú)肉肌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解作用（魏世娜和秦啟偉，2018）。對(duì)魚(yú)肉中不同細(xì)胞器含有的組織蛋白酶B、D和B+L活性進(jìn)行綜合分析，旨在闡明組織蛋白酶B、D和L在羅非魚(yú)魚(yú)肉貯藏期間質(zhì)量變化中的作用。羅非魚(yú)魚(yú)肉在冷藏期間由于pH降低和鈣離子濃度增加導(dǎo)致溶酶體膜破裂，本研究中，在羅非魚(yú)魚(yú)肉冷藏期間溶酶體中的組織蛋白酶B、B+L和D活性均下降。Bahuaud等（2008）發(fā)現(xiàn)大西洋鮭魚(yú)（Salmo salar L.）在-1.5和-25 ℃下溶酶體中組織蛋白酶B和B+L活性下降。Ge等（2015）發(fā)現(xiàn)草魚(yú)魚(yú)肉在微凍條件下貯藏期間溶酶體中的組織蛋白酶B、B+L和D活性均下降。魚(yú)被宰殺后，肌肉中組織蛋白酶被溶酶體釋放后發(fā)揮其降解蛋白質(zhì)的作用，這些蛋白酶還通過(guò)水解Bid及抗凋亡蛋白來(lái)參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，間接影響肌肉蛋白質(zhì)的降解（Guicciardi et al.，2004；?esen et al.，2012）。因此，線粒體中組織蛋白酶B、L活性的增加，表明組織蛋白酶B、L參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程。本研究中，肌原纖維和肌漿蛋白中的組織蛋白酶B和B+L活性在0～1 d均為增加，而后隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)活性降低，說(shuō)明在貯藏1 d后組織蛋白酶B和B+L可能已開(kāi)始水解肌原纖維和肌漿中的某些蛋白，且水解速度大于酶釋放至肌原纖維中的速度，與Ge等（2015）的研究結(jié)論相似。研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D不僅存在于溶酶體中，線粒體中也有一部分（Minarowska et al.，2009）。因此在羅非魚(yú)魚(yú)肉冷藏過(guò)程中，溶酶體和線粒體中的組織蛋白酶D活性持續(xù)下降，對(duì)應(yīng)肌漿蛋白和肌原纖維中活性上升。

綜上，組織蛋白酶B、B+L和D活性在不同細(xì)胞器中有顯著變化，其參與了肌原纖維和肌漿中某些蛋白的降解及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，揭示了組織蛋白酶B、D、L在羅非魚(yú)魚(yú)片品質(zhì)劣化中的作用。

3. 3 冷藏過(guò)程中鈣激活蛋白酶和鈣離子濃度的關(guān)系

鈣激活蛋白酶為中性半胱氨酸酶，鈣蛋白酶能破壞Z線，其損壞會(huì)使肌原纖維分解斷裂。鈣激活蛋白酶在不同鈣離子濃度下會(huì)表現(xiàn)不一樣的特性，一般而言，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度越高，鈣激活蛋白酶的活性就越高（時(shí)海波等，2020）。魚(yú)體死后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子大量釋放至肌漿中，能激活鈣激活蛋白酶。本研究中，鈣激活蛋白酶活性只在0～1 d內(nèi)隨鈣離子濃度增加而升高，在1～6 d內(nèi)鈣激活蛋白酶活性降低，可能是由于其本身的自溶作用及鈣蛋白酶抑素發(fā)揮作用（孫蕾蕾等，2014）。對(duì)本研究冷藏期間魚(yú)肉肌漿中鈣離子濃度與鈣激活蛋白酶活性進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示二者無(wú)顯著相關(guān)性（r=-0.275）。朱燕等（2007）研究鈣離子對(duì)離體肌束中鈣激活蛋白酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)500 μmol/L以內(nèi)的鈣離子處理肌束可提高肌束中部分鈣激活蛋白酶活性，當(dāng)高于此濃度時(shí)，部分鈣激活蛋白酶因發(fā)生自動(dòng)降解而失活?？傮w而言，鈣離子濃度的增加只能在冷藏初期激活鈣激活蛋白酶，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)鈣激活蛋白酶活性降低。

3. 4 冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉中的鈣激活蛋白酶與組織蛋白酶B、B+L、D對(duì)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)的影響

貯藏期間魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的劣化與內(nèi)源蛋白酶聯(lián)系緊密，發(fā)現(xiàn)對(duì)此過(guò)程貢獻(xiàn)較大的內(nèi)源蛋白酶有利于為提升魚(yú)肉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。鈣激活蛋白酶在貯藏初期對(duì)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化貢獻(xiàn)很大，Ahmed等（2015）、Chang等（2016）研究指出在水產(chǎn)品和畜肉貯藏期間，鈣激活蛋白酶在蛋白質(zhì)水解過(guò)程中先對(duì)蛋白進(jìn)行局部的特異性降解，再被溶酶體組織蛋白酶進(jìn)一步降解。葛黎紅（2017）通過(guò)體外模擬內(nèi)源蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)鈣激活蛋白酶與組織蛋白酶B、L在降解肌原纖維蛋白過(guò)程中存在協(xié)同作用。

有研究表明貯藏過(guò)程中組織蛋白酶B、L對(duì)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化貢獻(xiàn)較大（Ge et al.，2015）。此外，組織蛋白酶D被認(rèn)為不是造成貯藏期內(nèi)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化相關(guān)的主要蛋白酶之一（Wang et al.，2009；Ahmed et al.，2013）。Ladrat等（2003）證實(shí)了組織蛋白酶B、L在體外對(duì)肌球蛋白、α-肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白的強(qiáng)烈降解作用，并指出這是貯藏期間魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化的原因之一。Bahuaud等（2010a，2010b）發(fā)現(xiàn)擁擠應(yīng)激條件下的大西洋鮭魚(yú)，組織蛋白酶B、L活性基因表達(dá)的增加與魚(yú)片質(zhì)構(gòu)劣化相關(guān)，表明魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化與組織蛋白酶B、L活性之間存在潛在的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，組織蛋白酶B、L活性與魚(yú)肉硬度和MFI具有極顯著相關(guān)性，說(shuō)明在羅非魚(yú)魚(yú)肉整個(gè)貯藏期間組織蛋白酶B、L對(duì)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化過(guò)程發(fā)揮重要作用。

3. 5 冷藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化

肌原纖維蛋白被降解情況通過(guò)SDS-PAGE圖譜蛋白條帶的模糊、弱化和消失能直觀體現(xiàn)。肌原纖維蛋白是由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白等組成的復(fù)合體，新鮮羅非魚(yú)片肌原纖維蛋白條帶主要為MHC、肌動(dòng)蛋白和MLC。Jasra等（2001）發(fā)現(xiàn)野鯪魚(yú)（Labeo rohita）在冷藏期間MLC發(fā)生明顯的降解。Wang等（2009）對(duì)冷藏期間大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua L.）品質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚(yú)肉在冷藏7和9 d后MHC出現(xiàn)不同程度的降解。沈妮等（2019）發(fā)現(xiàn)在0和4 ℃下冷藏的帶魚(yú)肌動(dòng)蛋白條帶隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。本研究中，MHC、肌動(dòng)蛋白和MLC條帶隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而減少，說(shuō)明冷藏期間肌原纖維蛋白被降解程度較大，與前人研究結(jié)果（Jasra et al.，2001；Wang et al.，2009；沈妮等，2019）相似。MHC條帶在第1、2 d發(fā)生明顯的弱化，在對(duì)應(yīng)的時(shí)間內(nèi)魚(yú)肉肌原纖維中的組織蛋白酶B、L活性達(dá)最大值。在3～6 d內(nèi)MHC和肌動(dòng)蛋白條帶無(wú)明顯變化，但此時(shí)肌原纖維中的組織蛋白酶D活性呈升高趨勢(shì)，而組織蛋白酶B、L活性呈下降趨勢(shì)，表明組織蛋白酶B、L較組織蛋白酶D在肌原纖維蛋白水解方面發(fā)揮更大的作用?？赡茉蚴墙M織蛋白酶D能水解的肌原纖維蛋白種類較組織蛋白酶B、L少，也可能是冷藏過(guò)程中某一段時(shí)期的pH與組織蛋白酶D能直接降解完整的蛋白且其與最適pH相同，但這段時(shí)期內(nèi)組織蛋白酶D的特異性底物不存在。

4 結(jié)論

冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉組織蛋白酶B、L在魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化過(guò)程中發(fā)揮較大作用，參與肌原纖維蛋白的降解和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；鈣離子濃度的增加只能在冷藏初期激活鈣激活蛋白酶，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)鈣激活蛋白酶活性降低。因此，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L可能是冷藏期間羅非魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化的2個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)酶，可采取有效技術(shù)手段對(duì)其活性進(jìn)行抑制，進(jìn)而提升貯藏期間魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）