抗病和感病香蕉品種根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

張艷 曾鳳花 農(nóng)倩 覃麗萍 竇同心 邱美莎 謝玲

摘要：【目的】分析抗病和感病香蕉品種根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，探究香蕉抗枯萎病能力與香蕉根系微生物組的關(guān)聯(lián)，為發(fā)掘利用香蕉枯萎病土著生防微生物組提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳韵憬犊菸「胁∑贩N威廉斯B6和抗病品種中蕉9號(hào)為材料，在枯萎病發(fā)病初期（營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛期）和發(fā)病嚴(yán)重期（孕蕾期）采集香蕉根系，采樣前均調(diào)查香蕉發(fā)病情況；分別提取抗病和感病香蕉植株根系DNA，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)Fastp和Flash軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接，利用RDP classifier和Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)、注釋?zhuān)捎肊xcel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用DPS 7.0進(jìn)行差異顯著性分析?！窘Y(jié)果】隨著香蕉的生長(zhǎng)發(fā)育和枯萎病的越發(fā)嚴(yán)重，抗病品種中蕉9號(hào)在生長(zhǎng)過(guò)程中相對(duì)感病品種威廉斯B6表現(xiàn)出極顯著（P<0.01）的抗病能力。測(cè)序獲得的2568個(gè)OTUs分屬于32門(mén)89綱220目369科673屬1139種。Alpha多樣性和物種組成分析結(jié)果表明，抗病品種中蕉9號(hào)根系細(xì)菌多樣性高于感病品種威廉斯B6，但差異不顯著（P>0.05）。2個(gè)品種根系細(xì)菌群落在發(fā)病初期和嚴(yán)重期的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)無(wú)差異，但相對(duì)豐度隨著香蕉的生長(zhǎng)發(fā)生顯著變化（P<0.05，下同）。在發(fā)病初期，感病和抗病香蕉植株根系細(xì)菌群落中主要優(yōu)勢(shì)菌屬較單一；發(fā)病嚴(yán)重期細(xì)菌群落組成較豐富，其中抗病品種中有益微生物鏈霉菌屬（Streptomyces）、擬無(wú)枝菌酸菌屬（Amycolatopsis）和短桿菌屬（Brevibacterium）的相對(duì)豐度顯著增加，分析發(fā)現(xiàn)短桿菌屬只在抗病品種香蕉根系中特異富集。NMDS和PCoA分析表明，感病與抗病香蕉植株根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在發(fā)病初期大致相同，到發(fā)病嚴(yán)重期時(shí)2個(gè)品種間內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異?！窘Y(jié)論】感病與抗病香蕉植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨著生長(zhǎng)發(fā)育和發(fā)病進(jìn)程而變化，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和菌屬群落組成變化較大且差異顯著，尤其是抗病品種中有益微生的相對(duì)豐度顯著增加。感病與抗病香蕉植株根系微生物結(jié)構(gòu)組成變化對(duì)香蕉枯萎病的發(fā)生有較大影響，特異微生物的富集對(duì)香蕉抗枯萎病產(chǎn)生直接或間接的影響。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎??；高通量測(cè)序；內(nèi)生細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S182；S436.681? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0365-11

Abstract：【Objective】To analyze the community structure and diversity of endophytic bacteria in banana roots of resistant and susceptible banana varieties and explore the association between resistance to fusarium wilt and the root microbiome of banana， which would provide theoretical basis for exploiting and utilizing indigenous biocontrol microbiome of banana fusarium wilt. 【Method】The banana fusarium wilt susceptible variety Williams B6 and resistant variety? Zhongjiao 9 were used as materials. The banana root system was collected at the initial stage of fusarium wilt （the period of vigorous vegetative growth） and the severe stage（the period of gestational bud stage）， the incidence of banana was investigated before two sampling； the root DNA of susceptible and disease-resistant banana plants was extracted respectively. The V3-V4 region of 16S rRNA gene of endophytic bacteria in banana roots was sequenced by high-throughput sequencing technology. Raw sequencing files were quality-filtered by Fastp and merged by Flash. The taxonomy of each 16S rRNA gene sequence was compared and annotated by RDP classifier algorithm against the Silva 16S rRNA database. Excel 2010 was used to analyze the data， and DPS 7.0 software was used for significant difference analysis. 【Result】With the growth and development of banana， the fusarium wilt became more and more serious， and the resistant variety Zhongjiao 9 showed extremely significant（P<0.01） disease resistance compared with the susceptible variety Williams B6 during the growth process. A total of 2568 OTUs were obtained by high-throughput sequencing， which belonged to 1139 species， 673 genera， 369 families， 220 orders， 89 classes， and 32 phyla. The results of Alpha diversity and species composition analysis showed that the root bacteria diversity of resistant variety Zhongjiao 9 was higher than that of susceptible variety Williams B6， but the differences was not significant（P>0.05）. There was no difference in the dominant bacterial phyla of root bacterial community between the two varieties at the initial stage and the severe stage， however， the relative abundances changed significantly with the growth of bananas（P<0.05， the same below）. At the initial stage， the main dominant bacterial genus in the root system of susceptible and disease-resistant bananas was relatively single， while the bacterial community composition in the severe stage was more abundant， the relative adundance of beneficial microorganism Streptomyces， Bacteroides and Brevibacterium increased significantly in the resistant banana variety， genus Brevibacterium was found and enriched only in the roots of resistant variety. NMDS and PCoA analysis showed that the community structure of endophytic bacteria in the disease initial stage was basiclly the same， and the community structure of endophytic bacteria of disease-resistant variety in the severe disease stage was significantly different from the other treatment group. 【Conclusion】The community structure of endophytic bacteria in the root of susceptible and disease-resistant banana changes with the progression of the disease process. The community composition of dominant phyla and genera vary significantly， especially the relative abundance of beneficial microorganism increas significantly in resistant variety. The variation of root microbial structure of susceptible and resistant banana have great effect on the occurrence of fusarium wilt， and the accumulation of specific microorganisms has direct or indirect effect on fusarium wilt resistance of banana.

Key words： banana fusarium wilt； high-throughput sequencing； endophytic bacteria； diversity of community structure

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （32260008）； Guangxi Natural Science Foundation （2019GXNSFAA185051）； Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences （Guinongke 2020YM77， Guinongke 2021YT065）

0 引言

【研究意義】香蕉（Musa spp.）是重要的熱帶和亞熱帶水果。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2020年我國(guó)香蕉種植面積達(dá)32.72萬(wàn)ha，產(chǎn)量約1151.3萬(wàn)t，廣西作為我國(guó)香蕉主產(chǎn)區(qū)之一，2020年種植面積達(dá)7.75萬(wàn)ha，產(chǎn)量約311.0萬(wàn)t（張放，2021）。然而，近年來(lái)有“香蕉癌癥”之稱(chēng)的香蕉枯萎病給我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了毀滅性打擊。香蕉枯萎病是由古巴專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起植株凋萎、維管束壞死的毀滅性土傳病害（Ploetz et al.，2006），截至2019年5月，香蕉枯萎病在我國(guó)所有的香蕉主產(chǎn)區(qū)均有報(bào)道，此病害給香蕉產(chǎn)業(yè)造成了重大影響，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收（李華平等，2019；杜浩等，2020），已成為制約我國(guó)香蕉生產(chǎn)的最重要因素。由于化學(xué)防治效果不理想，加上抗病、高產(chǎn)和品質(zhì)在育種中難以兼顧和突破，因此，安全、環(huán)境友好的生物防治一直是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。目前對(duì)作物枯萎病的生防研究主要集中在兩個(gè)方面，一是利用生物體中的“活性物質(zhì)”進(jìn)行枯萎病防治，如利用甲殼素（Roller and Covill，1999）、殼聚糖（徐鵬，2007）、外源褪黑素（Wei et al.，2017）、竹蓀粗提物（劉范等，2018）或韭菜（王彤，2018）等抑制香蕉枯萎病的發(fā)生；二是篩選并利用拮抗菌防治枯萎病，當(dāng)前研究的主要有綠膿桿菌（Sekhar and Thomas，2015）、鏈霉菌（周登博等，2017）、芽孢桿菌（盧亭君等，2018；趙志祥等，2022）、熒光假單胞菌（Khan et al.，2018）、木霉（葉乃瑋等，2019；曹鵬飛和劉青娥，2021）、放線菌（賴寶春等，2020）和短短芽孢桿菌（張涵等，2022）等生防菌?，F(xiàn)有的生防菌劑大多由1種或2～4種微生物混合而成，易受環(huán)境因素的影響，在田間的生防效果并不穩(wěn)定。研究表明，在土壤環(huán)境中進(jìn)行生物防治時(shí)，發(fā)揮有效作用的微生物類(lèi)群較復(fù)雜，多種益生菌與宿主植物之間存在復(fù)雜的作用關(guān)系（Mendes et al.，2011）。自然界中，正常生長(zhǎng)的農(nóng)作物表面和內(nèi)部的微生物總和稱(chēng)之為農(nóng)作物微生物組（Müller et al.，2016）。這些微生物通過(guò)協(xié)作和競(jìng)爭(zhēng)等作用方式形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病、抗逆至關(guān)重要，但目前人類(lèi)對(duì)于絕大部分作物表面及內(nèi)生微生物與植物抗病之間的聯(lián)系知之甚少（Philippot et al.，2013）。對(duì)于香蕉而言，香蕉植株上的微生物組與香蕉抗枯萎病之間的聯(lián)系亦是許多研究者探索的熱點(diǎn)。因此，開(kāi)展抗病和感病香蕉品種根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性研究，挖掘香蕉枯萎病生防微生物，對(duì)香蕉枯萎病的生物防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人關(guān)于內(nèi)生微生物對(duì)植物病害的影響有較多報(bào)道。吳思?jí)簦?018）通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析抗/感潰瘍病柑橘的內(nèi)生細(xì)菌菌群，發(fā)現(xiàn)抗病、感病品種植株組織中的內(nèi)生細(xì)菌群落存在一定差異，抗病品種中含有更多拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，感病品種中除拮抗菌外還存在感病協(xié)同菌，初步認(rèn)定內(nèi)生細(xì)菌的差異是影響寄主抗?jié)儾∧芰Φ囊蛩?；Kwak等（2018）研究發(fā)現(xiàn)番茄青枯病抗病品種與感病品種的根際微生物組結(jié)構(gòu)存在差異，通過(guò)二者微生物組的互相移植以及菌株的功能驗(yàn)證，證明根際微生物組參與了植物的抗病過(guò)程，即抗病品種特異富集的微生物群可保護(hù)宿主免受病原菌侵害。香蕉植株內(nèi)生微生物（病原菌或生防菌）對(duì)香蕉病害的影響也有較多報(bào)道。李梅婷（2007）通過(guò)研究香蕉根際及內(nèi)生菌的菌群結(jié)構(gòu)以及內(nèi)生菌群與香蕉病害的相關(guān)性，查明了內(nèi)生炭疽菌具有潛伏侵染特性，對(duì)香蕉有致病性，香蕉內(nèi)生鐮刀菌無(wú)致病性，與香蕉枯萎病菌無(wú)親和性；許樂(lè)等（2012）通過(guò)基于16S rRNA的末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)分析香蕉枯萎病健康和感病植株中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)抗病品種比感病品種具有更豐富多樣且更穩(wěn)定的內(nèi)生細(xì)菌群落，而且不同抗性品種中健康與感病植株內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種群存在明顯差異；農(nóng)倩等（2017）在前期研究中篩選獲得了抗香蕉枯萎病的深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）菌株L-14，接種于香蕉植株后可顯著降低田間香蕉苗枯萎病的發(fā)病率，L-14可定殖在香蕉的根系，但并不產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的拮抗物質(zhì)，而是誘導(dǎo)香蕉植株產(chǎn)生了系統(tǒng)抗病性，可見(jiàn)，香蕉根系內(nèi)生微生物可能在枯萎病抗病過(guò)程中扮演著較重要的生態(tài)角色；陳艷露等（2022）對(duì)廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)的香蕉根系進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，采用形態(tài)特征觀察和ITS序列分析相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)不同地理位置的香蕉根系內(nèi)生真菌群落種類(lèi)、組成和分布有所差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)微生物對(duì)香蕉抗枯萎病的影響已有一些報(bào)道，但不同抗病程度香蕉品種的根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異研究則鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用高通量測(cè)序方法測(cè)定田間自然發(fā)病條件下香蕉枯萎病抗病與感病品種根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異并分析其多樣性，在此基礎(chǔ)上分析抗病和感病品種根系細(xì)菌群落組成對(duì)香蕉抗枯萎病能力的影響，為發(fā)掘利用香蕉枯萎病土著生防微生物組供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

香蕉枯萎病感病品種為目前生產(chǎn)上的主栽品種威廉斯B6（編號(hào)為W），購(gòu)自廣西植物組培苗有限公司；抗病品種為中蕉9號(hào)（編號(hào)為Z），由廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所提供。

1. 2 樣品的準(zhǔn)備與采集

在香蕉枯萎病主病區(qū)廣西南寧市郊金陵鎮(zhèn)南岸村（東經(jīng)108?1'～108?2'，北緯22?56'～22?57'）選擇0.13 ha連續(xù)種植香蕉且具5年枯萎病嚴(yán)重發(fā)病史的香蕉種植地作為試驗(yàn)地，分別種植感病和抗病品種，威廉斯B6設(shè)4個(gè)小區(qū)共137株，中蕉9號(hào)設(shè)4個(gè)小區(qū)共143株，四周設(shè)置保護(hù)行，正常水肥管理。分別在發(fā)病初期即營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛期（標(biāo)記為T(mén)1）和發(fā)病嚴(yán)重期即孕蕾期（標(biāo)記為T(mén)2）按照五點(diǎn)采樣法采集感病、抗病品種植株2種類(lèi)型的根系（Root system，簡(jiǎn)寫(xiě)為R）樣本，抖去根表附著的土壤，每種樣本各采集30株，然后隨機(jī)分成3份，每份10株，每份為1個(gè)樣本，共12個(gè)根樣本，將樣本置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。用無(wú)菌水洗滌根部30 s，然后在70%乙醇中浸泡2 min，再用2.5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5 min后轉(zhuǎn)移至70%無(wú)菌乙醇浸泡30 s，最后使用無(wú)菌水洗滌根部3次以上，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1. 3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1 2個(gè)時(shí)期感病和抗病品種香蕉枯萎病調(diào)查 在發(fā)病初期和發(fā)病嚴(yán)重期采樣前均調(diào)查香蕉發(fā)病情況，參考鄧曉等（2012）的方法進(jìn)行病害等級(jí)鑒定，記錄病級(jí)并計(jì)算病情指數(shù)。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，未發(fā)病，外觀無(wú)可見(jiàn)癥狀；1級(jí)，外圍下部1～2葉片出現(xiàn)小面積黃色斑塊，占葉面積的1/2以下，或球莖組織變褐面積占球莖面積的1/4以下假莖組織未見(jiàn)褐變，根有的變褐；3級(jí)，外圍葉片出現(xiàn)大面積黃色斑塊，占葉面積的1/2以上，葉片出現(xiàn)萎蔫，或球莖組織變褐面積占球莖面積的1/4～1/2，假莖組織未見(jiàn)褐變，根有的變褐；5級(jí)，葉片黃化萎蔫、死亡，球莖組織變褐面積占球莖面積的1/2左右，假莖組織上部未見(jiàn)變褐，而下部出現(xiàn)淺褐色斑點(diǎn)狀或褐色線條狀病變，根部黑褐色，植株出現(xiàn)輕度萎蔫；7級(jí)，植株出現(xiàn)萎蔫、枯死，球莖組織1/2以上面積變褐或腐爛，假莖上、下部出現(xiàn)褐色條狀病變，基部易折斷、萎蔫或腐爛，根黑褐色或出現(xiàn)爛根；9級(jí)，全株枯死。

病情指數(shù)=∑（病株級(jí)數(shù)×代表數(shù)值）/（株數(shù)總和×最高病級(jí)代表值）

1. 3. 2 香蕉根系DNA提取及高通量測(cè)序 用CTAB法提取香蕉根系DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和純度。DNA樣本委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因擴(kuò)增和測(cè)序。香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌使用上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠分別回收2個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTM Fluorometer（Promega，USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)、定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)Fastp和Flash軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接。運(yùn)用Usearch（version 7.0 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（v138）進(jìn)行比對(duì)、注釋。經(jīng)過(guò)Alpha多樣性分析（包括Chao、Shannon、Simpsonace、Simpson和Coverage等分析指數(shù)）后得到香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌群落中物種的豐富度、覆蓋度和多樣性等；基于物種注釋結(jié)果，通過(guò)群落柱形圖、群落熱圖、韋恩圖等可視化分析，分析樣本中物種的組成及優(yōu)勢(shì)菌群/關(guān)鍵菌群等；基于物種注釋結(jié)果，使用NMDS、PCoA等分析，評(píng)估組間或樣本間在物種組成上的相似性和差異性；通過(guò)以上結(jié)果分析，根據(jù)細(xì)菌群落多樣性以及門(mén)和屬水平上的相對(duì)豐度與品種抗性的相關(guān)性分析微生物整體群落與品種抗性之間的相關(guān)性。采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用DPS 7.0進(jìn)行單因素方差分析、使用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同時(shí)期感病和抗病香蕉品種枯萎病發(fā)病情況

對(duì)抗感、香蕉品種枯萎病發(fā)病初期（T1）和發(fā)病嚴(yán)重期（T2）的病情調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，在T1時(shí)期，中蕉9號(hào)無(wú)發(fā)病癥狀，病情指數(shù)為0，與威廉斯B6（病指為0.31）相比較差異極顯著（P<0.01，下同）；T2時(shí)期，大部分植株均出現(xiàn)發(fā)病癥狀（圖1），威廉斯B6病情指數(shù)逐漸增大，病指為0.53，中蕉9號(hào)病指為0.12，與威廉斯B6相比較差異極顯著?？梢?jiàn)，隨著香蕉的生長(zhǎng)發(fā)育枯萎病越發(fā)嚴(yán)重，抗病品種中蕉9號(hào)在生長(zhǎng)過(guò)程中相對(duì)感病品種威廉斯B6表現(xiàn)出極顯著的抗病能力。

表 1 不同時(shí)期感病和抗病香蕉品種枯萎病發(fā)病情況

Table 1 The incidence of fusarium wilt in susceptible and resistant banana varieties at different stages

[香蕉品種

Banana variety 病情指數(shù) Disease index T1 T2 Z 0bB 0.12bB W 0.31aA 0.53aA ]

同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫(xiě)字母分別表示差異達(dá)極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）水平。表2同

Different uppercase letters in the same column represented extremely significant difference（P<0.01）， and lowercase letters represented significant difference（P<0.05）. The same was applied in Table 2

圖 1 抗病與感病香蕉植株發(fā)病情況

Fig.1 Disease incidence of resistant and susceptible banana

plants

A：抗病品種中蕉9號(hào)；B：感病品種威廉斯B6

A： Resistant variety （Zhongjiao 9）； B：Susceptible variety（Williams B6）

2. 2 香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌物種注釋與評(píng)估

2. 2. 1 樣本稀釋曲線分析 選擇97%相似度的OTU計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的Sobs指數(shù)繪制稀釋曲線圖（圖2），序列數(shù)在60000時(shí)趨于平緩，但未達(dá)到飽和，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可體現(xiàn)根系樣本各細(xì)菌群落，但也存在未檢測(cè)出少量微生物的可能性，表明若繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的物種（如OTU）。總體而言，此測(cè)序結(jié)果可以反映香蕉根系樣本中絕大多數(shù)的細(xì)菌信息。

2. 2. 2 不同時(shí)期感病和抗病香蕉植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落Alpha多樣性分析 根據(jù)測(cè)序獲得的有效序列分析（表2）可知，感病和抗病香蕉植株在2個(gè)不同生長(zhǎng)期的12個(gè)根系樣本獲得的有效序列均值均在10萬(wàn)條以上，總和達(dá)1285808條；各樣本測(cè)序覆蓋度指數(shù)在0.9970以上，差異不顯著（P>0.05，下同），說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)合理真實(shí)，測(cè)序數(shù)據(jù)基本涵蓋了香蕉根系中的細(xì)菌類(lèi)群，能體現(xiàn)香蕉根系真實(shí)環(huán)境中的細(xì)菌組成特征。

研究根系中細(xì)菌的多樣性，可通過(guò)單樣本的多樣性（Alpha多樣性）分析反映細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落的多樣性，Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性越低；ACE和Chao1指數(shù)反映群落的豐富度，值越大則豐富度越高。通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)，從發(fā)育時(shí)期來(lái)看，2個(gè)品種T2期的Shannon指數(shù)高于T1期，隨著生長(zhǎng)發(fā)育和病情指數(shù)的增長(zhǎng)，Shannon指數(shù)呈上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為T(mén)2_RZ>T2_RW>T1_RW>T1_RZ；從樣本來(lái)看，T1時(shí)期RW與RZ相比，RW的Shannon指數(shù)較RZ高、Simpson指數(shù)較RZ低，T2時(shí)期則相反，RZ的Shannon指數(shù)高于RW，Simpson指數(shù)低于RW（表2）。表明隨著香蕉植株的生長(zhǎng)發(fā)育和病情指數(shù)的上升，抗病品種中蕉9號(hào)根系細(xì)菌群落多樣性高于感病品種威廉斯B6，但二者差異不顯著。

隨著香蕉的生長(zhǎng)和枯萎病發(fā)病越發(fā)嚴(yán)重，ACE和Chao1指數(shù)均有所提高，說(shuō)明發(fā)病嚴(yán)重期2個(gè)香蕉品種根系細(xì)菌群落豐富度均高于發(fā)病初期；同時(shí)RW在2個(gè)發(fā)育時(shí)期中ACE和Chao1指數(shù)均高于RZ，表明威廉斯B6根系細(xì)菌群落豐富度高于中蕉9號(hào)，二者差異不顯著，即二者的細(xì)菌群落豐富度相近（表2）。

2. 2. 3 OTU聚類(lèi)分析 12個(gè)根系樣本內(nèi)生細(xì)菌共鑒定得到32門(mén)89綱220目369科673屬1139種2568個(gè)OTUs。如圖3所示，T1_RW、T1_RZ、T2_RW和T2_RZ根系分別獲得715、662、1830、1742個(gè)細(xì)菌OTU，4個(gè)處理間有388個(gè)共有OTUs，四者特有OTUs數(shù)量分別為T(mén)2_RW（635）>T2_RZ（560）>T1_RW（31）>T1_RZ（27），表明隨著香蕉的生長(zhǎng)和發(fā)病越發(fā)嚴(yán)重，不同品種的香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性存在差異，且各自有其特異的OTUs，共有OTUs和特有OTUs差異較大，即感病和抗病品種的根系內(nèi)生細(xì)菌群落具有明顯差異。

2. 3 不同時(shí)期感病和抗病香蕉植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2. 3. 1 門(mén)水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 Alpha多樣性可反映細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，而物種組成分析能反映樣本在分類(lèi)學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)中各優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度。高通量測(cè)定結(jié)果（圖4）顯示，從門(mén)分類(lèi)水平看，威廉斯B6和中蕉9號(hào)在發(fā)病初期和發(fā)病嚴(yán)重期其根系內(nèi)生細(xì)菌群落共檢測(cè)到10個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)（相對(duì)豐度≥0.01%為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度<0.01%歸為其他），分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteriota）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）、粘球菌門(mén)（Myxococcota）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）和浮霉菌門(mén)（Planctomycetota）。

物種組成分析結(jié)果（圖4）表明，中蕉9號(hào)與威廉斯B6在門(mén)分類(lèi)水平上優(yōu)勢(shì)菌門(mén)無(wú)差異，在物種類(lèi)別無(wú)差異的情況下，物種的相對(duì)豐度是反映物種多樣性的重要指標(biāo)。在香蕉發(fā)病初期，威廉斯B6和中蕉9號(hào)的第1優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為97.31%和97.05%，第2優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（RW：1.10%；RZ：1.91%），其他8個(gè)菌門(mén)的相對(duì)豐度均小于1.00%。在發(fā)病嚴(yán)重期，威廉斯B6和中蕉9號(hào)中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度均大幅度降低，分別為40.17%和32.10%，而放線菌門(mén)（RW：34.00%；RZ：49.67%）和擬桿菌門(mén)（RW：7.76%；RZ：3.92%）的相對(duì)豐度顯著提高（P<0.05，下同），其他8個(gè)菌門(mén)的相對(duì)豐度均有所提高。可見(jiàn)，隨著生長(zhǎng)和發(fā)病時(shí)間的推移，威廉斯B6和中蕉9號(hào)根系細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)及其相對(duì)豐度有顯著變化，并趨于平衡和穩(wěn)定。物種差異分析結(jié)果（圖4）顯示，在菌門(mén)分類(lèi)水平上，發(fā)病嚴(yán)重期抗病品種中蕉9號(hào)和感病品種威廉斯B6間的變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度差異顯著，其中中蕉9號(hào)的變形菌門(mén)（32.10%）顯著低于威廉斯B6（40.17%），而中蕉9號(hào)的放線菌門(mén)（49.67%）顯著高于威廉斯B6（34.00%），提高了46.09%。說(shuō)明在菌門(mén)水平上，抗病品種中蕉9號(hào)根系細(xì)菌群落多樣性高于感病品種威廉斯B6。

2. 3. 2 屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 從屬分類(lèi)水平看（圖5），威廉斯B6和中蕉9號(hào)在發(fā)病初期和發(fā)病嚴(yán)重期其根系內(nèi)生細(xì)菌群落共檢測(cè)到673個(gè)屬，其中T1_RW、T1_RZ、T2_RW和T2_RZ分別含318、288、558和528個(gè)屬，4個(gè)處理共有屬232個(gè)［優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌屬（Enterobacter）］，T1_RW和T1_RZ獨(dú)有屬分別分別為6個(gè)［優(yōu)勢(shì)菌屬為Niveispirillum］和3個(gè)［優(yōu)勢(shì)菌屬為蒼白桿菌（Ochrobactrum）］，T2_RW和T2_RZ獨(dú)有屬分別為112個(gè)（優(yōu)勢(shì)菌屬為Pelagibacterium）和83個(gè)［優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬（Brevibacterium）］?？煽闯龈胁∨c抗病品種香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌群落組成在屬水平上多樣性較豐富且差異顯著。

威廉斯B6和中蕉9號(hào)根系內(nèi)生細(xì)菌在2個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌屬及相對(duì)豐度存在明顯差異（圖6）。其中，T1時(shí)期RW和RZ的內(nèi)生細(xì)菌組成較單一且相似，優(yōu)勢(shì)菌屬及其在相應(yīng)樣本中的相對(duì)豐度順序分別為：腸桿菌屬（RW 71.06%；RZ 74.52%）>泛菌屬（Pantoea）（RW 13.46%；RZ 10.58%）>Others（RW 11.34%；RZ 9.79%）>假單胞菌屬（Pseudomonas）（RW 1.84%；RZ 2.47%）>根瘤菌屬（Rhizobium）（RW 1.04%；RZ 0.66%）和芽孢桿菌屬（Bacillus）（RW 0.46%；RZ 1.30%），其余的菌屬相對(duì)豐度均小于1.00%；芽孢桿菌屬是該時(shí)期中蕉9號(hào)根系特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌。

T2時(shí)期2個(gè)香蕉品種的根系內(nèi)生細(xì)菌組成較豐富，其群落結(jié)構(gòu)與T1時(shí)期差異明顯，優(yōu)勢(shì)菌屬及其在相應(yīng)樣本中的相對(duì)豐度順序分別為：Others（RW 56.82%；RZ 51.08%）>鏈霉菌屬（Streptomyces）（RW 17.30%；RZ 13.43%）>擬無(wú)枝菌酸菌屬（Amycolatopsis）（RW 5.27%；RZ 8.88%）>短狀桿菌屬（Brachybacterium）（RW 0.01%；RZ 5.11%）>考克氏菌屬（Kocuria）（RW 0.01%；RZ 3.98%）>Mitsuaria（RW 3.87%；RZ 0.94%）>芽孢桿菌屬（RW 0.64%；RZ 3.57%）>鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）（RW 3.05%；RZ 0.65%）>根瘤菌屬（RW 2.81%；RZ 2.60%）>未定名黃單胞菌科（norank_f__Xanthomonadaceae）（RW 2.41%；RZ 0.00%）>貪噬菌屬（Variovorax）（RW 2.34%；RZ 0.69%）>泛菌屬（RW 1.97%；RZ 0.30%）>短桿菌屬（RW 0%；RZ 2.09%）>慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（RW 1.85%；RZ 2.06%）>假單胞菌屬（RW 1.35%；RZ 0.35%），其余的菌屬相對(duì)豐度均小于1.00%（圖6）。T2時(shí)期與T1時(shí)期對(duì)比可知，Others、鏈霉菌屬、擬無(wú)枝菌酸菌屬和芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度提高比例較大，作為T(mén)1時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌屬的腸桿菌屬和泛菌屬相對(duì)豐度大幅度降低；根據(jù)物種組成分析結(jié)果，值得關(guān)注的是未定名黃單胞菌科和梭菌（Clostridium）是威廉斯B6根系特有的優(yōu)勢(shì)菌屬，短桿菌屬、解環(huán)菌屬（Cycloclasticus）、嗜鹽放線菌（Neomicrococcus）及糖多胞菌（Saccharopolyspora）是中蕉9號(hào)根系特異富集的優(yōu)勢(shì)菌屬。可見(jiàn)，隨著香蕉植株的生長(zhǎng)及枯萎病的發(fā)生，感病和抗病香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌群落組成發(fā)生了變化，根系能富集或招募更多與其生長(zhǎng)相關(guān)或?qū)ζ浒l(fā)生枯萎病有影響的特有細(xì)菌屬種。

2. 4 不同時(shí)期感病和抗病香蕉植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落Beta多樣性分析結(jié)果

NMDS分析，即非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling）是基于Bray-curtis距離進(jìn)行分析的數(shù)據(jù)分析方法，根據(jù)不同時(shí)期威廉斯B6和中蕉9號(hào)根系中包含的內(nèi)生細(xì)菌群落信息，以點(diǎn)的形式反映在多維空間上，繼而通過(guò)點(diǎn)與點(diǎn)間的距離體現(xiàn)不同樣本間的差異程度。如圖7所示，基于不同時(shí)期威廉斯B6和中蕉9號(hào)根系內(nèi)生細(xì)菌測(cè)序獲得的OTUs水平的NMDS分析結(jié)果，Stress為0，說(shuō)明NMDS可準(zhǔn)確反映樣本間的差異程度，結(jié)果顯示4個(gè)處理存在明顯差異。4個(gè)處理分布在不同象限內(nèi)，TI_RW與TI_RZ組間距離較近，有2個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)幾近重合；T2_RW與T2_RZ組間距離較大。說(shuō)明威廉斯B6和中蕉9號(hào)根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在生長(zhǎng)初期大致相同，隨著種植和發(fā)病時(shí)間的推移內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也逐漸改變，到發(fā)病嚴(yán)重期時(shí)2個(gè)品種間內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異。

在OTU水平上對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行基于Unweighted UniFrac距離算法的主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA），結(jié)果（圖8）顯示，不同時(shí)期的威廉斯B6和中蕉9號(hào)根系內(nèi)生細(xì)菌群落變化與NMDS分析結(jié)果一致，T1的2個(gè)處理聚在同一個(gè)象限，且處理間的距離很近，T1_RW和T1_RZ則表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集，說(shuō)明這2個(gè)處理的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)很相似；T2與T1處理分布在不同象限，說(shuō)明不同時(shí)期的香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差距較大；T2_RZ與T2_RW、T1_RW、T1_RZ等3個(gè)處理間的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明發(fā)病嚴(yán)重期抗病品種與另3個(gè)處理的香蕉根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較低，差異顯著。

3 討論

許多研究表明，微生物多樣性與植物抗病能力有密切關(guān)系。鄧曉等（2012）研究表明，健康香蕉植株根際微生物總量與多樣性大于發(fā)病植株。楊尚東等（2020）發(fā)現(xiàn)甘蔗宿根矮化病感病植株的不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性降低，較健康植株差異顯著。劉宇星等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，健康刺梨植株附生菌群和內(nèi)生菌群的香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均大于患病植株的相關(guān)指數(shù)。在本研究中，香蕉從發(fā)病初期到發(fā)病嚴(yán)重期，威廉斯B6發(fā)病明顯，病級(jí)逐漸變大，同時(shí)中蕉9號(hào)大部分植株均能正常生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)良好，高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病品種中蕉9號(hào)發(fā)病嚴(yán)重期其根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性高于發(fā)病初期，且高于感病品種威廉斯B6，與鄧曉等（2012）、劉宇星等（2021）的研究結(jié)果相似。結(jié)合植株生長(zhǎng)情況和測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抵御香蕉枯萎病過(guò)程中，抗病品種根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性顯著提高，說(shuō)明香蕉植株可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)根系內(nèi)生微生物資源來(lái)抑制病原菌的侵染和定殖，使內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，繼而維持香蕉植株的健康水平并減少發(fā)病機(jī)會(huì)，而感病品種根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性降低則與其枯萎病病指變大相對(duì)應(yīng)。由此可推論香蕉植株根系內(nèi)生微生物多樣性與其抗病程度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。

前人研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物生長(zhǎng)促進(jìn)類(lèi)激素與浮霉菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)等細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，與厚壁菌門(mén)細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)；水楊酸、茉莉酸等抗逆及防御類(lèi)植物激素與放線菌門(mén)細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，與變形菌門(mén)細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)（盧玉秋，2019；陳思宇等，2021）。鏈霉菌屬是生物活性物質(zhì)的主要來(lái)源，植物內(nèi)生鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富，可與宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化、互利共生，在植物—微生物互作中發(fā)揮重要作用，是一種可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的促生及防病生物制劑潛在資源（劉迎雪等，2020；王莎等，2021）。芽孢桿菌是一種著名的植物促生微生物，其能通過(guò)分泌抗真菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)還能分泌植物激素來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Kwak等（2018）發(fā)現(xiàn)抗青枯病番茄品種的根際微生物組參與了植物的抗病過(guò)程，抗病品種特異富集的黃桿菌（Flavobacterium sp.，屬于擬桿菌門(mén)）能提高番茄抗青枯病能力，保護(hù)番茄免受病原菌侵害。本研究發(fā)現(xiàn)，香蕉營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度均顯著降低，至發(fā)病嚴(yán)重期時(shí)，隨著病原菌的不斷脅迫，放線菌門(mén)相對(duì)豐度顯著提高，尤其是中蕉9號(hào)根系中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度較威廉斯B6高15.67%；在屬分類(lèi)水平上看，發(fā)病初期作為優(yōu)勢(shì)菌屬的腸桿菌屬和泛菌屬的相對(duì)豐度隨著植株的生長(zhǎng)和病程的推進(jìn)逐漸降低，而有益菌鏈霉菌屬、擬無(wú)枝菌酸菌屬和芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度逐漸提高并成為優(yōu)勢(shì)菌屬。而中蕉9號(hào)中芽孢桿菌屬、短狀桿菌屬、短桿菌屬和考克氏菌屬等菌屬相對(duì)豐度較威廉斯B6高，說(shuō)明在香蕉抗病過(guò)程中，放線菌門(mén)和芽孢桿菌屬等有益微生物積極分泌生長(zhǎng)類(lèi)和抗逆類(lèi)植物激素促進(jìn)中蕉9號(hào)生長(zhǎng)并抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而保持植株健康，提高抗病能力，這意味著微生物群落中有益物種的種類(lèi)和相對(duì)豐度與香蕉的健康生長(zhǎng)及其抗枯萎病能力呈正相關(guān)。

值得關(guān)注的是未定名黃單胞菌科，其與梭菌是威廉斯B6根系特有的優(yōu)勢(shì)菌屬，短桿菌屬、解環(huán)菌屬、嗜鹽放線菌及糖多胞菌是中蕉9號(hào)根系特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。黃單胞菌屬隸屬于好氧或兼性厭氧非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，多為植物致病菌（Vauterin et al.，1996），部分梭菌屬對(duì)人、動(dòng)物或植物致病。未定名黃單胞菌科細(xì)菌和梭菌屬細(xì)菌的特異富集與威廉斯B6發(fā)病逐漸明顯呈正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)論與薛超（2015）的研究結(jié)果一致。而解環(huán)菌屬、嗜鹽放線菌及糖多胞菌多存在于海洋高鹽、高壓、低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件，具有耐鹽性、耐高溫和高滲透性、固氮等功能，且能產(chǎn)生可抵抗病原微生物的特殊代謝產(chǎn)物（單紀(jì)苗等，2014；李恩源，2017）。這類(lèi)菌的特異富集對(duì)中蕉9號(hào)的抗逆、防御能力有重要影響，與Kwak等（2018）的研究結(jié)果相似。病原菌的富集加重植物的感病程度與發(fā)病速度，而有益特有菌屬的富集能抵抗枯萎病，有可能是其產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的拮抗物質(zhì)直接參與抗病過(guò)程，亦或是誘導(dǎo)香蕉植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的間接作用。因此，香蕉根系能招募何種類(lèi)型的微生物群落對(duì)香蕉植株的抗病能力具有關(guān)鍵作用。在后續(xù)研究中應(yīng)嘗試分離抗病品種中特異富集的細(xì)菌并進(jìn)行功能驗(yàn)證，進(jìn)而揭示香蕉根系微生物組與香蕉抗枯萎病之間的聯(lián)系。

4 結(jié)論

感病與抗病香蕉植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨著生長(zhǎng)發(fā)育和枯萎病發(fā)病進(jìn)程而變化，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和菌屬群落組成變化較大且差異顯著，尤其是抗病品種中有益微生物鏈霉菌屬、擬無(wú)枝菌酸菌屬和短桿菌屬的相對(duì)豐度顯著增加。這些微生物的結(jié)構(gòu)組成變化對(duì)香蕉枯萎病的發(fā)生有較大影響，特異微生物的富集對(duì)香蕉抗枯萎病產(chǎn)生直接或間接的影響。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）