基于高通量測(cè)序的野生毛葡萄轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析

方輝+蔣勝理+曲俊杰+周思泓+潘鳳英

摘要：利用毛葡萄葉片高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）搜索并對(duì)其所在的序列進(jìn)行注釋，從而為毛葡萄分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供有效信息。從35 238條質(zhì)量較高的unigene中搜索到4 428個(gè)SSR位點(diǎn)，對(duì)這些序列進(jìn)行基因本體（gene ontology，簡(jiǎn)稱GO）、同源蛋白質(zhì)簇（cluster of orthologous groups of proteins，簡(jiǎn)稱COGs）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyslopedia of genes and genomes，簡(jiǎn)稱KEGG）分類，給出功能注釋和Pathway注釋，共注釋了3 197條unigene。COG數(shù)據(jù)庫(kù)將SSR序列分成25類，通過(guò)GO分類和KEGG富集性分析，將SSR序列分別歸類于38個(gè)GO類別和103條通路。這些序列涉及了許多重要的生物功能和代謝途徑，預(yù)示著這些潛在的標(biāo)記可能與重要的生物功能有關(guān)，這些信息為毛葡萄分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：毛葡萄；轉(zhuǎn)錄組；高通量測(cè)序；簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）

中圖分類號(hào)： S663.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0064-04

野生毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis）真葡萄亞屬（Euvitis）東亞種群的一個(gè)種，產(chǎn)于中國(guó)，是我國(guó)葡萄屬東亞種群中分布最廣的一個(gè)野生種，主要集中分布在廣西的桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地區(qū)[1]。野生毛葡萄含有各種氨基酸、礦物質(zhì)、多種維生素，還含有豐富的超氧化物歧化酶、白藜蘆醇和花色素雙糖苷，具有抗衰老、防癌、軟化血管的作用[2]。大部分野生毛葡萄表現(xiàn)出抗逆性強(qiáng)、耐旱耐瘠、耐病性好、耐高溫潮濕天氣等優(yōu)良特性，是南方“石漠化治理、生態(tài)重建”的優(yōu)良樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）又名微衛(wèi)星（microsatellites），是基因組中以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（一般為2～6個(gè)）為重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)組成的長(zhǎng)度為幾十個(gè)堿基的核苷酸序列，其中最常見(jiàn)的是雙核苷酸重復(fù)[4]。SSR標(biāo)記廣泛分布于各種生物基因組上，因其重復(fù)單元不同和重復(fù)數(shù)的差異，構(gòu)成了SSR序列的多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、保守性高、共顯性遺傳的特點(diǎn)，成為當(dāng)前應(yīng)用較廣泛的分子標(biāo)記之一。以往的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法一般利用基因組文庫(kù)雜交測(cè)序，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且效率低，不適于短時(shí)間內(nèi)開(kāi)發(fā)大量的標(biāo)記用于遺傳學(xué)應(yīng)用研究。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，即使一次性對(duì)上百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定也不再是問(wèn)題。目前SSR標(biāo)記在葡萄遺傳多樣性、遺傳圖譜、品種鑒定和親緣關(guān)系等方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于高通量測(cè)序后檢測(cè)獲得的大量SSR序列，主要分析SSR重復(fù)基元分布特征和重復(fù)序列組成規(guī)律，對(duì)SSR序列進(jìn)行功能注釋和功能分類的研究較少。此外，對(duì)葡萄進(jìn)行種質(zhì)資源和親緣關(guān)系分析是利用已知或通用的SSR，沒(méi)有進(jìn)一步篩選和擴(kuò)展SSR分子標(biāo)記[5-6]。本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于毛葡萄葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄組SSR源自基因組編碼可表達(dá)的序列，直接與功能基因相關(guān)，保守程度更高，轉(zhuǎn)移概率較大。研究含有SSR的轉(zhuǎn)錄組序列信息，有利于獲得SSR序列相關(guān)功能注釋信息，從而獲得更有針對(duì)性的SSR分子標(biāo)記，以便更有效地為基因定位、遺傳多樣性研究及分子育種提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為毛葡萄五峒-1，生長(zhǎng)于廣西壯族自治區(qū)河池市都安瑤族自治縣高嶺鎮(zhèn)五峒村，樹齡10年，生長(zhǎng)旺盛，葉片生長(zhǎng)狀況良好，果實(shí)產(chǎn)量高，經(jīng)調(diào)查與試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種病害高抗或免疫。采集樣品后用液氮速凍，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 野生毛葡萄測(cè)序 采取野生毛葡萄的嫩葉并提取總RNA，送到北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和RNA高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeqTM 2000，每個(gè)樣品的測(cè)序量約為4.75Gb。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝 對(duì)測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量分析，去除重復(fù)、含接頭、測(cè)序質(zhì)量低的reads，獲得clean reads。使用短序列組裝軟件Trinity[7]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組從頭組裝，首先將含有一定長(zhǎng)度區(qū)域重疊的reads連成更長(zhǎng)的片段，然后通過(guò)reads重疊關(guān)系得到組裝片段的contig，再將reads比對(duì)回contig，再通過(guò)paired-end reads來(lái)確定來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄本的不同contig以及這些contig之間的距離，將這些contig連在一起，最后得到兩端不能再延長(zhǎng)的序列，即為unigene。

1.2.3 SSR位點(diǎn)的篩選 利用MISA軟件在所有unigene中搜索SSR位點(diǎn)，設(shè)置二核苷酸重復(fù)次數(shù)最少為6次，三核苷酸重復(fù)次數(shù)最少為5次，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)都設(shè)置為至少4次。

1.2.4 功能注釋 利用BLASTx將含有SSR的unigene序列與GenBank中的無(wú)冗余（Nr）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（non-redundant protein sequence database in GenBank）、Swiss-Prot（經(jīng)過(guò)注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡(jiǎn)稱KEGG）和同源蛋白質(zhì)簇（cluster of orthologous groups of proteins，簡(jiǎn)稱COGs）數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)先級(jí)順序進(jìn)行比對(duì)（E值<10-5），獲取最高序列相似性的蛋白，從而獲得該unigene的蛋白功能注釋信息。根據(jù)Nr注釋信息，使用Blast2GO軟件[8]進(jìn)行GO注釋，得到每個(gè)含有SSR的unigene的GO信息后，用WEGO軟件[9]進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝

通過(guò)Illumina HISeqTM 2000平臺(tái)測(cè)序，總計(jì)產(chǎn)出 56 374 280 條reads，去除低質(zhì)量的和含有接頭的reads以后，得到 53 697 490 條clean reads，共計(jì)5 369 749 000個(gè)核苷酸（nucleotides，簡(jiǎn)稱nt），GC含量45.52%、Q20（在高通量測(cè)序中，每測(cè)1個(gè)堿基會(huì)給出1個(gè)相應(yīng)的質(zhì)量值，用來(lái)衡量測(cè)序準(zhǔn)確度。堿基的質(zhì)量值為13、20、30時(shí)，錯(cuò)誤率分別為5%、1%、0.1%。Q20則表示質(zhì)量值≥20的堿基所占百分比）為9563%。利用Trinity軟件對(duì)這些reads進(jìn)行組裝得到35 238條unigene，平均長(zhǎng)度為1 081 nt，N50[將所有unigene從長(zhǎng)到短排序，并依次累加長(zhǎng)度，當(dāng)累加片段長(zhǎng)度達(dá)到總片段長(zhǎng)度（所有unigene 的長(zhǎng)度）的50%時(shí)，對(duì)應(yīng)那個(gè)片段的長(zhǎng)度即為N50]為1 735 nt。長(zhǎng)度大于1 000 nt的unigene有13 651條，占全部unigene的38.74%。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，本研究中轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的測(cè)序和組裝結(jié)果都較好，可以進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)研究。

2.2 SSR分析

利用MISA軟件在毛葡萄的35 238條unigene中搜索發(fā)現(xiàn)3 571條unigene序列含有SSR，占unigene序列總數(shù)的 10.13%，共搜索到4 428個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每8.6 kb長(zhǎng)度出現(xiàn)1個(gè)SSR，其中包含2個(gè)及2個(gè)以上SSR的unigene共有576條，含有SSR序列的unigene序列平均長(zhǎng)度為1 684 nt，大于總unigene的平均長(zhǎng)度，其中大于1 000 nt的序列數(shù)為 2 419 個(gè)。從圖1的分布特征來(lái)看，含有SSR的序列分布較均勻，與總unigene的分布規(guī)律類似，說(shuō)明SSR是隨機(jī)分布的。由表1可知，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量最多，其中二核苷酸1 906個(gè)，三核苷酸1 762個(gè)，而五核苷酸、六核苷酸重復(fù)類型在毛葡萄轉(zhuǎn)錄組序列中數(shù)量較少，分別僅有165、201個(gè)，除此之外，不同核苷酸的重復(fù)次數(shù)也有很大的變化。在檢測(cè)到的SSR中出現(xiàn)頻率最高的5類基序?yàn)锳G/CT（1 425個(gè)）、AAG/CTT（552個(gè)）、AT/TA（345個(gè)）、ATC/ATG（247個(gè)）、AGC/CTG（235個(gè)）。對(duì)上述SSR分布特征進(jìn)行分析有助于開(kāi)展毛葡萄及其同屬物種的通用性標(biāo)記開(kāi)發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建的研究。

2.3 功能注釋

為了預(yù)測(cè)含有SSR的unigene功能，分別將unigene與Nr、Swiss-Prot、COG、KEGG等生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)BLAST搜索比對(duì)可知，共有3 197條unigene獲得了基因注釋，占所有unigene的86.06%，有518條unigene（13.94%）未被注釋（表2），這些未被注釋的基因被認(rèn)為可能是新基因。

將所有含有SSR的unigene基因與COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行功能注釋與分類，有1 798條unigene被注釋到25個(gè)COG類別中（圖2），其中一般功能基因是最大類別，包含467條unigene，占被注釋unigene總數(shù)的25.98%；其次是信號(hào)轉(zhuǎn)

導(dǎo)機(jī)制類，包含313條unigene（占比為 17.41%）；其余依次為轉(zhuǎn)錄類（263條，占總數(shù)的14.63%），以及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)、分子伴侶類（235條，占總數(shù)的13.07%）。

在已經(jīng)得到的Nr注釋信息基礎(chǔ)上，通過(guò)Blast2GO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得毛葡萄含有SSR的unigene的GO分類信息，共有 1 669 條unigene得到GO注釋。在GO分類體系中，生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能這3個(gè)大的類別又被劃分為詳細(xì)的38個(gè)小的類別，其中“代謝過(guò)程”（1 050條，占比為 62.91%）、“細(xì)胞過(guò)程”（1 026條，占比為61.47%）和“結(jié)合”（977條，占比為58.54%）這3個(gè)類群占了主要部分，而“運(yùn)動(dòng)”（1條）、“胞外區(qū)”（1條）和“節(jié)律過(guò)程”（3條）僅有非常少的基因歸入，在細(xì)胞組件大類中缺少了病毒和病毒核心的部分，在分子功能大類中缺少了受體活性的相關(guān)序列。這一分類結(jié)果顯示的含有SSR的unigene序列基因表達(dá)譜的總體情況見(jiàn)圖3。

2.4 代謝通路分析

對(duì)野生毛葡萄葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，有789條unigene被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，分布于103條已知的通路中。注釋序列數(shù)量較多的5個(gè)通路分別是代謝途徑（170條，ko01100）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（75條，ko01110）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（42條，ko04075）、剪接體（35條，ko03040）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)處理（28條，ko04141）（表3）。新陳代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成涉及的序列最多，這2個(gè)途徑是生物體內(nèi)最重要的代謝途徑，往往涉及比較多的基因。

3 結(jié)論與討論

基于高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是一種高效、可靠的發(fā)掘功能基因的手段，Illumina高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息進(jìn)行SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。本研究在35 238條unigene中共搜索到4 428個(gè)SSR位點(diǎn)，二核苷酸、三核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量最多，其中二核苷酸1 906條（43.04%），三核苷酸1 762條（39.79%）。前人的研究結(jié)果顯示，有些物種二核苷酸占優(yōu)勢(shì)，另一些物種三核苷酸占優(yōu)勢(shì)，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)與MISA搜索時(shí)相關(guān)參數(shù)的設(shè)置有很大的關(guān)系[10]。

結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對(duì)毛葡萄unigene中含有SSR的基因序列與Nr、Swiss-Prot、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行序列相似性比對(duì)和功能注釋分析。在KEGG分析中，有789條unigene被注釋到103條代謝通路。這些標(biāo)記如果能夠用于感興趣的性狀定位，則可以賦予它們對(duì)應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相關(guān)信息，此外，在對(duì)這些數(shù)據(jù)庫(kù)的分析中，含有SSR的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在各個(gè)功能組中的注釋比例和所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在各個(gè)功能組中的注釋比例非常接近，說(shuō)明SSR并沒(méi)有集中在某一類功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分布偏好，而是隨著某一類功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的增加而增加。endprint

在毛葡萄葉片轉(zhuǎn)錄組中這些SSR信息為開(kāi)發(fā)基因內(nèi)部SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)，而且對(duì)含有這些SSR的序列進(jìn)行注釋為后續(xù)研究提供了相關(guān)基因信息。在注釋中筆者發(fā)現(xiàn)，這些序列涉及了許多生物功能和重要代謝途徑，預(yù)示著這些潛在的標(biāo)記可能與重要的生物功能有關(guān)[11]。這些潛在的標(biāo)記還將豐富葡萄的分子標(biāo)記類型，由于其來(lái)自于基因內(nèi)部，所以具有很好的可轉(zhuǎn)移性，甚至可以廣泛地應(yīng)用于葡萄屬種間的更多物種。在遺傳多樣性研究中，這些SSR標(biāo)記將幫助研究者了解樣本中相關(guān)基因資源的多樣性。在基因定位上，一旦某一標(biāo)記與感興趣的性狀相關(guān)，此標(biāo)記所在的基因以及基因相關(guān)信息會(huì)幫助研究者更快地了解此基因與表現(xiàn)型的內(nèi)在聯(lián)系。因此，本研究結(jié)果對(duì)葡萄屬植物的遺傳學(xué)研究具有重要意義。后續(xù)可對(duì)這些SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增檢測(cè)，篩選出多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰的引物，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的SSR標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]林 玲，張 瑛，盧 江，等. 中國(guó)葡萄屬野生資源毛葡萄的研究與利用進(jìn)展[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2015，2（2）：66-69.

[2]涂 佳，鄧學(xué)良，周文化，等. 野生毛葡萄常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分和原花青素含量分析[J]. 食品與機(jī)械，2010，26（2）：82-85.

[3]鄒 瑜. 野生毛葡萄種質(zhì)資源及利用研究進(jìn)展[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，39（5）：664-667.

[4]尹 玲，張 晨，向 江，等. 我國(guó)新育成葡萄品種SSR指紋圖譜的建立[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2015，32（3）：366-373.

[5]Jiang B，Xie D，Liu W，et al. De novo assembly and characterization of the transcriptome，and development of SSR markers in wax gourd （Benicasa hispida）[J]. PLoS One，2013，8（8）：e71054.

[6]郭 磊，上官凌飛，房經(jīng)貴，等. 葡萄EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（4）：23-30.

[7]Haas B J，Papanicolaou A，Yassour M，et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis[J]. Nature Protocols，2013，8（8）：1494-1512.

[8]Conesa A，Gítz S，García-Gómez J M，et al. Blast2GO：a universal tool for annotation，visualization and analysis in functional genomics research[J]. Bioinformatics，2005，21（18）：3674-3676.

[9]Ye J，F(xiàn)ang L，Zheng H，et al. WEGO：a web tool for plotting GO annotations[J]. Nucleic Acids Research，2006，34（Web Server issue）：W293-W297.

[10]Wei W，Qi X，Wang L，et al. Characterization of the sesame （Sesamum indicum L.） global transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of EST-SSR markers[J]. BMC Genomics，2011，12（1）：451.

[11]李小白，向 林，羅 潔，等. 建蘭轉(zhuǎn)錄本的微衛(wèi)星序列和單核苷酸多態(tài)性信息分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2014，4（4）：463-472.endprint