羥基脲聯(lián)合輻射對(duì)沉默ATRX 后細(xì)胞周期及凋亡的影響

田宏遠(yuǎn), 尹彩云, 王 麗, 胡沛蕓, 張晨陽(yáng), 李秋月, 鄭清照, 齊亞莉, 方 芳, 王志成

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國(guó)家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

羥基脲（hydroxyurea，HU）是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的化學(xué)合成物，對(duì)核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RNR）起抑制作用［1］。RNR 參與DNA 復(fù)制和修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，核糖核苷酸在RNR 作用下脫氧被還原為DNA 合成過(guò)程中所需要的原料［2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)：HU 誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡。HU 上調(diào)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，并在小鼠卵母細(xì)胞成熟期間導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4］。研究［5-7］報(bào)道：α-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征 X 染色體相關(guān)蛋白（α-thalassemia/mental retardation syndrome nondeletion type X-chromosome associated protein，ATRX）是重要的DNA 損傷修復(fù)和染色質(zhì)重塑蛋白。本課題組前期研究［8］結(jié)果顯示：沉默ATRX可以增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞的凋亡，可以作為腫瘤輻射增敏的潛在靶點(diǎn)。因此，本研究探討HU 預(yù)處理聯(lián)合輻射對(duì)沉默ATRX 細(xì)胞周期及凋亡的影響，并分析相關(guān)分子機(jī)制，為腫瘤放療增敏提供新的分子靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器靶向沉默ATRX 的慢病毒由吉林大學(xué)國(guó)家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室包裝和保存，A549 細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞（上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞研究所）。Annexin Ⅴ-PE/7-ADD 凋亡試劑盒（美國(guó)BD 公司），ATRX 一抗和ECL 發(fā)光試劑盒（美國(guó)Santa Cruz 公司），GAPDH、細(xì)胞周期分裂因子25B （cell division cyclin 25B，CDC25B）、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）B1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1 （cyclin dependent kinase 1，CDK1）一抗（美國(guó)CST 公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），胎牛血清（江蘇MRC公司），HU（美國(guó)Sigma 公司），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD FACS Aria 公司），X 射線輻照儀（X-RAD320iX，美國(guó)Precision X-ray股份有限公司）。

1.2 沉默ATRX 細(xì)胞模型的制備本課題組［7］前期構(gòu)建了靶向沉默ATRX 的shRNA 載體，采用HEK293T 細(xì)胞包裝靶向沉默ATRX 慢病毒，并感染A549 細(xì)胞，嘌呤霉素篩選構(gòu)建穩(wěn)定沉默ATRX的細(xì)胞模型shATRX-A549，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染情況，采用Western blotting 法檢測(cè)沉默ATRX 細(xì)胞中ATRX 蛋白表達(dá)量驗(yàn)證細(xì)胞模型，以shNC-A549 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、HU 組、輻射組（給予8 Gy X 射線輻射）和HU+輻射組（給予HU+8 Gy X射線輻射）。細(xì)胞經(jīng)0.1 mmol·L－1HU 處理24 h 后給予8 Gy X 射線輻射，劑量率1.02 Gy·min－1，電壓180 kV，電流12.0 mA。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期A549 細(xì)胞百分率和細(xì)胞凋亡率將shNC-A549 和shATRXA549 細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合，HU 處理細(xì)胞24 h 后，8 Gy X 射線輻射，24 h 后加入300 μL無(wú)EDTA 的胰酶消化，PBS 緩沖液洗滌1 次后，重懸細(xì)胞，加入500 μL 預(yù)冷的75%冰乙醇，4 ℃冰箱內(nèi)固定 2 h，PBS 緩沖液洗滌1 次，重懸細(xì)胞，過(guò)濾。每管加入終濃度 50 mg·L－1PI 30 μL 和10%Triton X-100 2 μL 混勻。反應(yīng)條件4 ℃，避光30 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率，CellQuest 軟件收集細(xì)胞，ModFit 軟件分析結(jié)果。細(xì)胞消化后，PBS 緩沖液洗滌1 次，加入Binding Buffer 懸浮細(xì)胞100 μL，加入AnnexinⅤ-PE 和7-AAD 各5 μL 混勻，避光室溫反應(yīng)10 min，每管補(bǔ)充Binding Buffer 400 μL，吹打混勻后上機(jī)檢測(cè)，細(xì)胞凋亡率以百分率表示。

1.5 RNA 測(cè)序（RNA-sequencing，RNA-seq）檢測(cè)沉默ATRX 后A549 細(xì)胞中mRNA 表達(dá)提取shNC-A549 和shATRX-A549 細(xì)胞總RNA，采用試劑盒去除樣品中摻雜的核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA），將mRNA 片段化后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，修復(fù)末端，并在3′端加A 堿基，PCR 擴(kuò)增后，采用Agilent 2100 Bioanalyzer 對(duì)片段進(jìn)行對(duì)比和檢測(cè)，同時(shí)采用Illumina 的測(cè)序技術(shù)測(cè)序，對(duì)表達(dá)顯著差異基因mRNA 通過(guò)Gene Set Enrichment Analysis （GSEA）和 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）軟件對(duì)相應(yīng)的信號(hào)通路進(jìn)行分析和歸納，并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析（華大基因公司）。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達(dá)量將shNC-A549 和shATRX-A549 細(xì)胞按照每孔1×107個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合，0.1 mmol·L－1HU 處理24 h 后，8 Gy X 射線輻射，輻射后24 h 收集細(xì)胞，并加入裂解液RIPA 100 μL，提取總蛋白后進(jìn)行定量，取40 μg 蛋白加入5×Loading Buffer，100 ℃變性10 min 后上樣。濃縮膠80 V，分離膠120 V，SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜緩沖液4 ℃中過(guò)夜?jié)褶D(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉1 h后，GAPDH、CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 一抗孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入由TBST 稀釋的HRP-二抗后孵育1 h，TBST 洗滌3 次，加入ECL 液A 液和B 液，暗室中曝光，拍照分析。以蛋白條帶灰度代表目的蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率和細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 沉默 ATRX 的 A549 細(xì)胞模型建立

HEK293T 細(xì)胞包裝靶向沉默ATRX 慢病毒后感染A549 細(xì)胞，經(jīng)2 次感染后，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)shNC-A549 和shATRX-A549 細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP），表明感染成功，基因未丟失。見(jiàn)圖1。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與A549 和shNC-A549 細(xì)胞比較，shATRX-A549 細(xì)胞中ATRX 蛋白表達(dá)量明顯減少，表明細(xì)胞模型建立成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察A549 細(xì)胞中GFP 表達(dá)（Bar=200 μm）Fig.1 Expression of GFP in A549 cells observed under fluorescence microscope(Bar=200 μm)

圖2 Western blotting 法檢測(cè)各種細(xì)胞中ATRX 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of ATRX protein in different kinds of cells in various groups detected by Western blotting method

2.2 各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率與對(duì)照組比較，HU 組shNC-A549 細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞百分率升高（P＜0.05），S 期和G2/M 期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；輻射組shNC-A549細(xì)胞中G0/G1和S 期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.01），G2/M 期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01）；HU+輻射組shNC-A549 細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.01），S 期和G2/M 期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，HU 組shATRX-A549 細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞百分率升高（P＜0.05），G2/M 期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.01），S 期細(xì)胞百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；輻射組shATRX-A549 細(xì)胞中G2/M 期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01），G0/G1期和S 期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.01）；HU+ 輻射組shATRX-A549 細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.01），S 期和G2/M 期細(xì)胞百分率明顯升高（P＞0.01）。與shNC-A549 細(xì)胞比較，輻射組shATRX-A549 細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞百分率升高（P＜0.05），G2/M 期細(xì)胞百分率降低（P＜0.05）；HU+輻射組shATRX-A549 細(xì)胞中S 期細(xì)胞百分率升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和表1 及表2。

表1 各組不同細(xì)胞周期shNC-A549 細(xì)胞百分率Tab.1 Percentages of shNC-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

表1 各組不同細(xì)胞周期shNC-A549 細(xì)胞百分率Tab.1 Percentages of shNC-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group G2/M 6.81±1.40 1.62±0.35**49.53±0.56**47.41±0.94**Percentage of cells G0/G1 69.66±5.60 80.66±1.04*45.93±0.88**19.63±0.84**S Control HU Radiation HU+radiation 23.53±6.97 17.72±3.70*4.54±0.34**32.96±1.39**

表2 各組不同細(xì)胞周期shATRX-A549 細(xì)胞百分率Tab.2 Percentages of shATRX-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

表2 各組不同細(xì)胞周期shATRX-A549 細(xì)胞百分率Tab.2 Percentages of shATRX-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group S Control HU Radiation HU+radiation Percentage of cells G0/G1 73.71±0.35 78.04±0.58*50.06±1.44**18.01±0.12**G2/M 7.22±0.38 2.25±0.23**44.68±0.76**44.35±0.23**19.08±0.67 19.71±1.23 5.26±0.78**37.64±0.18**

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期A549 細(xì)胞百分率Fig.3 Percentages of cells at different cell cycles in A549 cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組A549 細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，HU組、輻射組和 HU+ 輻射組 shNC-A549 和shATRX-A549 細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與shNC-A549 細(xì)胞比較，HU 組和HU+輻射組shATRX-A549 細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4 和表3 及表4。

表3 各組shNC-A549 細(xì)胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of shNC-A549 cells in various groups(n=4，±s，η/%）

表3 各組shNC-A549 細(xì)胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of shNC-A549 cells in various groups(n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control HU Radiation HU+radiation Apoptotic rate 1.91±0.38 6.21±0.68**5.53±0.72*24.37±0.83**

表4 各組shATRX-A549 細(xì)胞凋亡率Tab.4 Apoptotic rates of shATRX-A549 cells in various groups (n=4，±s，η/%）

表4 各組shATRX-A549 細(xì)胞凋亡率Tab.4 Apoptotic rates of shATRX-A549 cells in various groups (n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control HU Radiation HU+radiation Apoptotic rate 2.88±0.53 9.69±1.28**6.66±1.03*27.86±0.77**

2.4 沉默ATRX 后A549 細(xì)胞中mRNA 表達(dá)

RNA-seq 結(jié)果顯示：沉默ATRX 后A549 細(xì)胞中mRNA 差異表達(dá)主要表現(xiàn)在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多個(gè)環(huán)節(jié)，且形成互作網(wǎng)絡(luò)主要以c-Myc、Esp1、Cdc20、Plk1、CycA/B、Cip1 和PCNA 為核心，其與DNA 復(fù)制、DNA 損傷和修復(fù)應(yīng)答及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)。見(jiàn)圖5。

圖5 RNA-seq 檢測(cè)沉默ATRX 后A549 細(xì)胞中mRNA 的差異表達(dá)和相關(guān)通路Fig.5 Differential expressions of mRNA in A549 cells after silencing of ATRX detected by RNA-seq and relative signaling pathways

2.5 各組A549 細(xì)胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，HU 組、輻射組和HU+輻射組shNC-A549 和shATRX-A549 細(xì)胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達(dá)量減少。與shNC-A549 細(xì)胞比較，對(duì)照組和HU 組shATRX-A549 細(xì)胞中Cyclin B1 蛋白表達(dá)量略有減少，輻射組和HU+輻射組shATRX-A549 細(xì)胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達(dá)量均增加。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of CDC25B,Cyclin B1, and CDK1 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

《2022 年全國(guó)癌癥報(bào)告》［9］顯示：肺癌的發(fā)病率和死亡率均占據(jù)首位且無(wú)性別差異。盡管外科手術(shù)仍是肺癌的主要治療方式，但對(duì)于肺癌患者，放化療結(jié)合的綜合治療在安全性和患者接納度上都因其無(wú)創(chuàng)性而更具優(yōu)勢(shì)。隨著放療技術(shù)、醫(yī)學(xué)影像設(shè)備和精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，放射治療在肺癌治療中的優(yōu)勢(shì)也更受到重視。放療技術(shù)已經(jīng)被列為早期非小細(xì)胞肺癌的一線治療方法［10］。但放療術(shù)后癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是影響其療效的主要因素，如何提高放療的效果非常關(guān)鍵。

細(xì)胞周期在電離輻射的暴露下會(huì)發(fā)生變化［11-13］。輻射后細(xì)胞DNA 放射性損傷，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，有利于細(xì)胞損傷的修復(fù)。本研究結(jié)果顯示：暴露在8 Gy 劑量X 射線下，輻射誘導(dǎo)shATRX-A549 細(xì)胞積累于G2/M 期，并同時(shí)消耗G0/G1期的細(xì)胞。而單獨(dú)采用周期特異性阻滯劑HU 處理shATRX-A549 細(xì)胞，HU 能夠?qū)е录?xì)胞積聚于G0/G1期，發(fā)生特異性細(xì)胞周期阻滯［14］。HU和輻射聯(lián)合處理后，觀察到細(xì)胞在G2/M 和S 期積聚。沉默ATRX 給予A549 細(xì)胞更大的DNA 復(fù)制壓力，DNA 不易修復(fù)，損傷也隨之增加。HU 與輻射聯(lián)合處理使周期阻滯效應(yīng)較分別單獨(dú)處理更加明顯。HU 聯(lián)合輻射使shATRX-A549 細(xì)胞中S 期細(xì)胞百分率升高，提示HU 和輻射對(duì)于A549 細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)不一致，且二者聯(lián)合處理會(huì)進(jìn)一步擾亂細(xì)胞周期進(jìn)程。

細(xì)胞凋亡是放射性殺傷腫瘤細(xì)胞的主要途徑［15］。當(dāng)X 射線導(dǎo)致DNA 斷裂受損后，一旦細(xì)胞無(wú)法修復(fù)由X 射線造成的DNA 損傷，細(xì)胞就進(jìn)入凋亡進(jìn)程，對(duì)于腫瘤輻射增敏具有正向作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，HU 單獨(dú)處理和HU+輻射聯(lián)合處理后shATRX-A549 細(xì)胞凋亡率升高。研究［18-19］證實(shí)：沉默ATRX 可上調(diào)凋亡蛋白PAPR1 的表達(dá)，激活凋亡過(guò)程中Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HU 作為廣泛應(yīng)用的化療藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的發(fā)生，單獨(dú)采用HU 處理和單獨(dú)輻射處理均可誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡。對(duì)于沉默ATRX 的A549 細(xì)胞，在X 射線輻射基礎(chǔ)上加用HU 處理，細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)輻射處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率更高，凋亡作用更加顯著，提示HU 增加輻射對(duì)shATRX-A549 細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)。

DNA 復(fù)制與損傷修復(fù)相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程主要發(fā)生在細(xì)胞S 期［20-22］。輻射通過(guò)誘導(dǎo)DNA 斷裂殺傷細(xì)胞，因此大部分易被輻射殺傷的細(xì)胞處于G1和G2期，而處于S 期細(xì)胞可以通過(guò)周期檢查點(diǎn)的激活減少被阻滯。HU 特異性影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使HU 增加輻射誘導(dǎo)的G2/M 期細(xì)胞阻滯并誘導(dǎo)發(fā)生S 期阻滯，可能與HU 阻礙復(fù)制叉活動(dòng)有關(guān)［23］。復(fù)制叉停止前進(jìn)導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張RAD3 相關(guān)蛋白/細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1 的S 期檢查點(diǎn)受到抑制，干擾細(xì)胞周期調(diào)控［24-25］。本研究對(duì)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)G2/M 期相關(guān)蛋白CDK1、Cyclin B1 和CDC25B 蛋白表達(dá)量均降低，提示CDC25B/Cyclin B/CDK1 通路參與誘導(dǎo)shATRX-A549 細(xì)胞G2/M 和S 期阻滯。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了靶向沉默ATRX的A549 細(xì)胞，HU 和輻射可以導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程紊亂，且HU 一定程度上促進(jìn)G2/M 期細(xì)胞周期阻滯。RNA 表達(dá)測(cè)序分析，ATRX 沉默后，細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)異常，提示ATRX 的缺失造成了細(xì)胞周期紊亂，相關(guān)蛋白表達(dá)量變化也可驗(yàn)證。HU 和輻射均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合作用還可進(jìn)一步促進(jìn)shATRX-A549 細(xì)胞凋亡。