2型糖尿病大鼠血清中蛋白結(jié)合態(tài)銅和鋅水平的測(cè)定*

秦旭, 李軍, 胡勇, 于春, 黃磊, 婁波, 羅茹丹, 徐緯

(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種代謝異常所導(dǎo)致的高血糖病,DM的發(fā)病以2型DM(type 2 DM,T2DM)為主,1型DM(T1DM)和其它類型DM少見[1-2]。研究表明,銅(copper,Cu)、鋅(zinc,Zn)等微量元素與T2DM關(guān)系密切,其增加或缺失都會(huì)使胰島素的合成和釋放受到影響[3-4]。既往研究中,學(xué)者們主要關(guān)注血清中微量元素總量與T2DM的關(guān)系,很少關(guān)注元素的形態(tài)[5-6]。微量元素在血清中的存在形態(tài)為蛋白結(jié)合態(tài)和非蛋白結(jié)合態(tài),與蛋白質(zhì)結(jié)合而存在的元素形態(tài)為蛋白結(jié)合態(tài)元素,其它存在形態(tài)的元素均為非蛋白結(jié)合態(tài)元素[7]。與非蛋白結(jié)合態(tài)元素相比,元素蛋白結(jié)合態(tài)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的生物學(xué)作用更穩(wěn)定[7]。因此,相較于測(cè)定元素總形態(tài)含量而言,檢測(cè)血清中蛋白結(jié)合態(tài)元素含量更能準(zhǔn)確反映元素在T2DM發(fā)生發(fā)展過程中的作用,對(duì)T2DM的輔助診斷和治療具有更重要的價(jià)值。蛋白結(jié)合態(tài)元素與T2DM的關(guān)系的研究比較缺乏,因此,本研究以T2DM大鼠為研究對(duì)象,采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy,AAS)檢測(cè)T2DM大鼠血清中Cu、Zn蛋白結(jié)合態(tài)含量,初步探討Cu、Zn元素的蛋白結(jié)合態(tài)在T2DM大鼠元素含量分析中的價(jià)值,可供臨床T2DM的診療和基礎(chǔ)研究時(shí)參考使用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來源 清潔級(jí)成年Sprague Dawley(SD)健康大鼠30只,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(黔)2018-0001]。

1.1.2主要儀器與試劑 連續(xù)光源火焰-石墨爐原子吸收光譜儀(德國(guó)耶拿conntraa700),離心機(jī)(上海盧湘儀TGL-16.5M),電子天平(梅特勒HZT-B2000),血糖儀(珠?？轮ZS286);Cu、Zn單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 000 mg/L(國(guó)家有色金屬中心),硝酸(優(yōu)級(jí)純,重慶川東化工),無水乙醇(優(yōu)級(jí)純,天津市鑫宇精細(xì)化工),鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ;上海皓鴻),檸檬酸和檸檬酸三鈉(上海MACKUN)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1造模及分組 參考文獻(xiàn)[8]建立T2DM大鼠模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(雌雄各5只,普通飼料喂養(yǎng))和T2DM模型組(雌雄各10只,高糖高脂飼料喂養(yǎng)),喂養(yǎng)4周;對(duì)照組大鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液,T2DM模型組腹腔注射35 mg/kg的STZ且誘導(dǎo)5 d;空腹采集2組大鼠尾靜脈血液檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),取3次平行FBG檢測(cè)的均值,以FBG≥11.1 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2取樣 取“1.2.1”項(xiàng)下2組大鼠心臟血,靜置30 min,于4 ℃下12 000 r/min離心10 min取血清,分別放入1.5 mL離心管內(nèi),儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)待檢。

1.2.3樣品檢測(cè) 取“1.2.1”項(xiàng)下2組大鼠血清100 μL加入離心管中,加硝酸17 μL,混勻靜置10 min,蒸餾水稀釋至1 mL,充分混勻,采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定Cu、Zn含量;再取2組大鼠血清100 μL加入1.5 mL離心管內(nèi),分別加70%(V/V,下同)的乙醇400 μL混勻,靜止5 min,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,上清液用0.45 μm一次性水系過濾器過濾,取濾液300 μL,加1%硝酸700 μL,充分混勻,采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定Cu、Zn含量;Cu、Zn元素總形態(tài)含量與非蛋白結(jié)合態(tài)含量之差即為蛋白結(jié)合態(tài)含量。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配置 取1 000 mg/L的Cu、Zn標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL,1%硝酸稀釋,定容到100 mL容量瓶中,搖勻,配成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;取10 mg/L的Cu、Zn標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各3 mL,定容到100 mL的容量瓶中,搖勻,配成300 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線 用1%的硝酸作為稀釋液,儀器自動(dòng)將“1.2.4”項(xiàng)下300 μg/L的Cu、Zn標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為0、20、60、140、220及300 μg/L的單元素標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液系列。

1.2.6檢出限和定量限 按“1.2.3”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法制備空白溶液,根據(jù)儀器工作條件連續(xù)測(cè)量11次,分別以測(cè)定值的3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差值(S)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k)得到各元素含量的檢出限(3 s/k)和定量限(10 s/k)。

1.2.7精密度實(shí)驗(yàn) 按“1.2.3”項(xiàng)下的方法分別制備6份對(duì)照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態(tài)和非蛋白結(jié)合態(tài)元素血清樣品,根據(jù)儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算Cu、Zn總含量、非蛋白結(jié)合態(tài)含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8回收實(shí)驗(yàn) 取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照組大鼠血清制備均質(zhì)血清50 μL和100 μL各12份,各自均分為4組;取50 μL和100 μL的血清各1組,按“1.2.3”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法分別處理為對(duì)照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態(tài)樣品和非蛋白結(jié)合態(tài)樣品,采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定血清本底值,測(cè)定值分別取均數(shù)即為總形態(tài)樣品和非蛋白結(jié)合態(tài)樣品本底值;另取血清50 μL分為3組,按加標(biāo)量為本底值比加標(biāo)值低(1∶0.5)、中(1∶1.0)及高(1∶1.5)的3個(gè)比例進(jìn)行加標(biāo),后續(xù)步驟按“1.2.3”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行,采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定3組血清Cu、Zn元素含量;取剩余100 μL血清3組,加標(biāo)量同上,后續(xù)步驟按“1.2.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行,采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定加標(biāo)后3組血清Cu、Zn元素含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

把Cu、Zn的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)、吸光度作為縱坐標(biāo)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,Cu、Zn標(biāo)的質(zhì)量濃度均在0～300 μg /L內(nèi)與對(duì)應(yīng)的吸光度呈線性關(guān)系,Cu、Zn元素線性關(guān)系良好,該標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)元素可以準(zhǔn)確定量。見表1。

表1 Cu、Zn元素線性參數(shù)、檢出限和定量限Tab.1 Linear parameters, limits of detection, and quantification of Cu and Zn elements

2.2 精密度和回收率

采用連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定對(duì)照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態(tài)樣品含量和非蛋白結(jié)合態(tài)含量,對(duì)對(duì)照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態(tài)樣品含量和非蛋白結(jié)合態(tài)含量進(jìn)行精密度和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),并計(jì)算測(cè)定值的RSD和加標(biāo)回收率,結(jié)果表明,Cu、Zn元素總形態(tài)含量和非蛋白結(jié)合態(tài)含量RSD測(cè)量值均小于5%;Cu、Zn元素總形態(tài)和非蛋白結(jié)合態(tài)低、中、高加標(biāo)回收率的范圍為87%～110%,能滿足加標(biāo)回收率范圍80%～120%的要求。見表2。

表2 Cu、Zn元素總形態(tài)含量和非蛋白結(jié)合態(tài)精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental result of total morphological content of Cu and Zn elements as well as precision and percent recovery of non-protein bound states

2.3 血清中不同形態(tài)Cu、Zn元素的含量

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,T2DM模型組大鼠血清Cu總形態(tài)含量和蛋白結(jié)合態(tài)含量均升高(P<0.05),但非蛋白結(jié)合態(tài)含量無變化(P>0.05);與對(duì)照組相比,T2DM模型組大鼠Zn總形態(tài)含量和蛋白結(jié)合態(tài)含量均降低(P<0.05),但非蛋白結(jié)合態(tài)含量變化無差異(P>0.05)。見表3。

表3 對(duì)照組和T2DM模型組大鼠血清中不同形態(tài)Cu、Zn的含量Tab.3 Amount of Cu and Zn in the serum of control and T2DM model rats

2.4 血清中不同形態(tài)Cu、Zn含量的比值

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,T2DM模型組大鼠血清中Cu和Zn總形態(tài)含量和蛋白結(jié)合態(tài)含量比值均升高(P<0.05),但非蛋白結(jié)合態(tài)Cu和Zn含量比值變化無差異(P>0.05)。見表4。

表4 對(duì)照組和T2DM模型組大鼠血清不同形態(tài)Cu/Zn比值Tab.4 Ratio of serum Cu and Zn in different forms between control group and T2DM

2.5 血清中不同形態(tài)Cu、Zn含量的相關(guān)性

結(jié)果顯示,所有大鼠血清中Cu總形態(tài)含量和蛋白結(jié)合態(tài)含量與Zn總形態(tài)含量和蛋白結(jié)合態(tài)含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),而非蛋白結(jié)合態(tài)Cu含量與非蛋白結(jié)合態(tài)Zn無相關(guān)性(P>0.05)。見表5。

3 討論

T2DM作為一種嚴(yán)重影響人群健康的慢性非傳染性疾病,一旦患病無法治愈[9-10]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人民生活水平的提高,生活方式改變以及人口老齡化,我國(guó)DM患病率快速增長(zhǎng),增長(zhǎng)速度高于亞洲其它國(guó)家,給社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[11-12]。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)成人DM患病率已經(jīng)達(dá)到12.8%,患者總?cè)藬?shù)也已經(jīng)達(dá)到了1.298億[12-13]。Cu、Zn是人體不可或缺的必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),對(duì)胰島素的合成、分泌、貯存、活性以及能量代謝起著重要作用[14-15]。既往研究主要通過檢測(cè)血清中元素總形態(tài)含量來研究機(jī)體元素代謝水平,但由于血清中元素總形態(tài)含量易受到飲食、環(huán)境等因素的影響[4-5];此外,關(guān)于患者或T2DM大鼠血清中Cu、Zn總形態(tài)含量研究結(jié)果并不統(tǒng)一,存在一定程度的偏差[16-17],而元素的蛋白結(jié)合形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定,不易受到上述因素的影響。因此,分析T2DM血清中元素蛋白結(jié)合態(tài)含量對(duì)進(jìn)一步探明元素與T2DM的關(guān)系具有重要的價(jià)值。

本研究以T2DM大鼠為對(duì)象,采用連續(xù)光源火焰-石墨爐原子吸收光譜儀檢測(cè)T2DM大鼠血清中Cu、Zn總形態(tài)含量和非蛋白結(jié)合態(tài)元素含量,從元素蛋白結(jié)合態(tài)的角度分析大鼠血清中Cu、Zn含量與T2DM發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系,結(jié)果顯示,T2DM大鼠血清中Cu總形態(tài)含量升高,Zn總形態(tài)元素含量降低,Cu、Zn總形態(tài)元素含量比值升高,Cu總形態(tài)元素含量與Zn總形態(tài)元素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素出現(xiàn)紊亂。相關(guān)研究表明,銅在機(jī)體中參與了多種酶活性及生物代謝,主要以結(jié)合銅藍(lán)蛋白的形式影響生物代謝,鋅與2型糖尿病的關(guān)系非常密切,直接參與了人體內(nèi)胰島素的合成、儲(chǔ)存及分泌[5];Zn元素分布在胰島β細(xì)胞顆粒中,能夠提高胰島素的穩(wěn)定性,并調(diào)節(jié)胰島素降糖作用[18];Zn主要靠金屬硫蛋白緩沖體系保持動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)T2DM發(fā)生時(shí),機(jī)體內(nèi)腸道中Cu元素的吸收率提高、積蓄量增加,與Zn元素競(jìng)爭(zhēng)同一載體蛋白-金屬硫蛋白并產(chǎn)生拮抗作,導(dǎo)致Zn元素含量減少,進(jìn)而引起T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素紊亂[19-20]。提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素出現(xiàn)紊亂可能與蛋白結(jié)合態(tài)的元素有關(guān)。

進(jìn)一步分析T2DM大鼠血清中Cu、Zn非蛋白結(jié)合態(tài)元素含量,發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素含量無明顯變化,Cu、Zn非蛋白結(jié)合態(tài)元素含量比值亦無明顯變化,Cu非蛋白結(jié)合態(tài)元素含量與Zn非蛋白結(jié)合態(tài)元素含量也無明顯的相關(guān)性,提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn非蛋白結(jié)合態(tài)含量未發(fā)生紊亂。相關(guān)研究表明,不同元素的化學(xué)形態(tài)生物效應(yīng)差別很大,它們決定了元素在生物體內(nèi)的化學(xué)行為,表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng),元素蛋白結(jié)合態(tài)相較于非蛋白結(jié)合態(tài)在體內(nèi)比較穩(wěn)定且發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用,如有銅藍(lán)蛋白(抗氧化劑作用)、血藍(lán)蛋白(運(yùn)輸氧)、超氧化物歧化酶(歧化反應(yīng))、血紅蛋白(運(yùn)輸氧)等[21]。由此推測(cè),在大鼠T2DM的發(fā)生過程中,非蛋白結(jié)合元素可能未發(fā)揮主要的生物效應(yīng),可能與大鼠T2DM的發(fā)生無直接的關(guān)聯(lián)。

結(jié)合元素總形態(tài)和非蛋白結(jié)合態(tài)元素含量的研究結(jié)果,分析元素蛋白結(jié)合態(tài)研究結(jié)果顯示,T2DM大鼠血清中Cu蛋白結(jié)合態(tài)含量升高,Zn蛋白結(jié)合態(tài)含量降低,Cu、Zn蛋白結(jié)合態(tài)元素含量比值升高,Cu蛋白結(jié)合態(tài)元素含量與Zn蛋白結(jié)合態(tài)元素含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示T2DM大鼠血清中蛋白結(jié)合態(tài)Cu、Zn元素發(fā)生紊亂,T2DM大鼠血清中總形態(tài)元素Cu、Zn的紊亂是由于蛋白結(jié)合態(tài)Cu、Zn元素的紊亂引起。相關(guān)研究顯示,Zn與2型糖尿病的關(guān)系非常密切,直接參與了人體內(nèi)胰島素的合成、儲(chǔ)存及分泌[5];Zn在細(xì)胞中大部分與蛋白緊密結(jié)合,只有一小部分以游離形式存在,到目前為止,已發(fā)現(xiàn)300多種Zn活化的金屬蛋白酶和2 000多種Zn依賴性轉(zhuǎn)錄因子[22];人體內(nèi)Zn穩(wěn)態(tài)主要靠金屬硫蛋白/硫蛋白緩沖體系、Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Zn-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族兩大Zn轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[19-20],金屬硫蛋白/硫蛋白緩沖體系重點(diǎn)參與Zn的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),而Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Zn-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族主要參與Zn的儲(chǔ)存及運(yùn)輸[19];金屬硫蛋白是具有抗氧化特性的Zn結(jié)合蛋白,可以保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激,其表達(dá)可降低高血糖誘導(dǎo)的器官中的氧化應(yīng)激、糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)[21]。另有研究表明,銅在機(jī)體內(nèi)主要以結(jié)合銅藍(lán)蛋白的形成存在,與了多種酶活性及生物代謝,Cu與Zn在人體中相互拮抗,如果體內(nèi)Cu元素增多,則會(huì)影響Zn元素的吸收使其大量丟失,促使糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。由此推測(cè),在大鼠T2DM發(fā)生過程中,蛋白結(jié)合形態(tài)Cu、Zn元素在大鼠T2DM發(fā)生過程中發(fā)生了顯著變化。

綜上所述,T2DM大鼠血清中Cu、Zn總形態(tài)的變化主要是由蛋白結(jié)合態(tài)變化引起,與非蛋白結(jié)合態(tài)含量變化無直接關(guān)聯(lián),蛋白結(jié)合形態(tài)Cu、Zn元素在大鼠T2DM發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。以上研究結(jié)果提示,下一步研究工作應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注元素的蛋白結(jié)合態(tài)的含量變化,可忽略元素非蛋白結(jié)合態(tài)含量變化。