膽汁酸對凡納濱對蝦生長性能、消化酶活性及免疫代謝相關(guān)因子基因表達的影響

黃義棚 白慧穎 袁春營崔青曼

（天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457）

膽汁酸（BA）是膽汁的主要脂質(zhì)成分，具有抑菌、乳化、免疫、營養(yǎng)及保護肝、腸功能等作用[1]。目前，BA作為促生長添加劑、抗氧化劑等廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中。飼糧中添加適宜水平的BA對水產(chǎn)動物的生長性能、消化酶活性、機體代謝、免疫功能和腸道微生物區(qū)系[2-5]均具有積極影響；BA 還參與凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病的發(fā)病過程[6]。

BA是蝦蟹類維持正常生長不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，對蛻皮激素的生成具有促進作用。凡納濱對蝦是世界對蝦養(yǎng)殖的三大品種之一，屬于一種高蛋白低脂肪的優(yōu)質(zhì)蝦種，具有較高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值。本試驗探討了BA對凡納濱對蝦生長性能、消化酶活性及免疫代謝相關(guān)基因表達的影響，為BA在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物及餌料

試驗用凡納濱對蝦由天津市晟淼水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供，體重（5.68±0.49）g。BA購自山東龍昌動物保健品有限公司，有效物質(zhì)含量30%?；A(chǔ)餌料由天津凱源飼料有限公司生產(chǎn)，粒徑1.0 mm，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)餌料組成及營養(yǎng)水平 單位：%

1.1.2 主要儀器設(shè)備

立式蒸汽滅菌器購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，PCR 擴增儀、Gel Doc EZ Imager 凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司，MIKRO 200R 離心機、UNIVERSAL 320R冷凍離心機購自德國Hettich科學(xué)儀器公司；T6紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗設(shè)計

選擇450只凡納濱對蝦，隨機分為5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30 只蝦，每個重復(fù)在一個容器中飼養(yǎng)（730 mm × 490 mm × 420 mm）。對照組、0.5 g/kg 組、1.0 g/kg 組、2.0 g/kg 組、4.0 g/kg 組分別在基礎(chǔ)餌料中添加0、0.5、1.0、2.0、4.0 g/kg的BA。試驗期4 w。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)期間，投飼量按照對蝦體重的4%～5%進行投喂，每天投喂3次。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，溶解氧＞6 mg/L，水溫27～29 ℃，鹽度18‰～20‰。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，分別對各組凡納濱對蝦進行計數(shù)，測定體重，計算成活率、增重率、特定生長率。

式中：N0為對蝦初始數(shù)量；Nt為對蝦試驗?zāi)?shù)量；M0為對蝦初重（g）；Mt對蝦末重（g）；t為試驗天數(shù)。

1.4.2 消化酶活性

凡納濱對蝦饑餓24 h，解剖，取出肝胰腺、胃和腸道，使用濾紙將表面水分吸干，分別稱取適量樣品，加入9 倍體積預(yù)冷的生理鹽水勻漿（冰浴），8 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，采用文獻[7]方法略加修改，測定消化酶活性。

1.4.3 實時定量PCR檢測對蝦肝胰腺相關(guān)因子基因表達

18S rRNA（內(nèi)參）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LZM）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、Toll 受體（TLR）、線粒體ATP 合酶亞單位α 前體（ATPase）和糜蛋白酶（chymotrypsin）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其引物序列見表2。

表2 免疫代謝相關(guān)因子基因的引物序列

目的基因的檢測采用StepOnePlusTM 實時PCR 系統(tǒng)（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。PCR 程序按照文獻[8]的方法進行。采用2-△△Ct方法分析基因的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，LSD法進行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA對凡納濱對蝦的生長性能的影響（見表3）

表3 BA對凡納濱對蝦的生長性能的影響

由表3可知，隨著餌料中BA水平升高，對蝦的增重率、特定生長率和成活率均先增加后降低，2.0 g/kg組和4.0 g/kg 組對蝦的增重率和特定生長率顯著低于其他組（P＜0.05），4.0 g/kg 組對蝦的成活率顯著低于其他組（P＜0.05），且以1.0 g/kgBA 添加組成活率最高。研究表明，對蝦餌料中適量添加BA 能夠明顯提高對蝦生長性能，超量添加會妨礙對蝦的生長。

2.2 BA 對凡納濱對蝦胃、肝胰腺、腸消化酶活性的影響（見表4）

表4 BA對凡納濱對蝦胃、肝胰腺、腸消化酶活性的影響 單位：U/mg prot

由表4可知，2.0 g/kg組、4.0 g/kg組對蝦胃、肝胰腺、腸的蛋白酶活性顯著低于其他組（P＜0.05）。2.0 g/kg組對蝦胃和肝胰腺的淀粉酶活性顯著低于對照組、0.5 g/kg組和1.0 g/kg 組（P＜0.05），4.0 g/kg 組對蝦肝胰腺和腸道淀粉酶活性顯著低于其他組（P＜0.05）。與對照組相比，0.5 g/kg 組、1.0 g/kg 組對蝦胃、肝胰腺、腸的脂肪酶活性顯著提高（P＜0.05）；2.0 g/kg 組、4.0 g/kg 組對蝦肝胰腺和腸道的脂肪酶活性顯著低于其他組（P＜0.05）。研究表明，適量BA（0.5、1.0 g/kg）能夠提高對蝦脂肪酶活性，對蛋白酶和淀粉酶活性影響較小，超量BA（2.0、4.0 g/kg）會降低3種消化酶活性。

2.3 BA 對凡納濱對蝦肝胰腺免疫相關(guān)因子基因表達的影響（見表5）

表5 BA對凡納濱對蝦肝胰腺免疫相關(guān)因子基因表達的影響

由表5可知，與對照組相比，0.5 g/kg組、1.0g/kg組對蝦肝胰腺CAT和GST的基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），1.0 g/kg組對蝦肝胰腺TLR基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），4.0 g/kg組對蝦肝胰腺5種基因表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），2.0 g/kg 組對蝦肝胰腺CAT、TLR、GST基因表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。0.5 g/kg組、1.0 g/kg組對蝦肝胰腺5種基因表達水平顯著高于2.0 g/kg組及4.0 g/kg 組（P＜0.05）。研究表明，適量添加BA（0.5、1.0 g/kg）能夠提高對蝦肝胰腺免疫相關(guān)基因的表達，超量BA會降低免疫相關(guān)基因的表達。

2.4 BA 對凡納濱對蝦肝胰腺代謝相關(guān)因子基因表達的影響（見表6）

表6 BA對凡納濱對蝦肝胰腺代謝相關(guān)因子基因表達的影響

由表6可知，與對照組相比，0.5 g/kg組、1.0 g/kg組對蝦肝胰腺ATPase和chymotrypsin的基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），4.0 g/kg 組對蝦肝胰腺ATPase和chymotrypsin的基因表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。0.5 g/kg 組及1.0 g/kg組對蝦肝胰腺ATPase和chymotrypsin的基因表達水平顯著高于2.0 g/kg組、4.0 g/kg組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 BA對凡納濱對蝦生長性能的影響

膽汁是一種黃綠色液體，在肝臟中由膽固醇產(chǎn)生，儲存于脊椎動物的膽囊中，作為乳化劑可促進脂肪消化和脂溶性營養(yǎng)素吸收，能夠促進膽固醇和有毒代謝物的排泄[9]。本試驗條件下，適量BA（1.0 g/kg）對凡納濱對蝦生長具有明顯的促進作用，在草魚[5,10-11]、加州鱸[12-13]、花鱸[14]、大菱鲆[15]、大黃魚[16-17]、齊口裂腹魚[18-19]、軍曹魚[20]、異育銀鯽[21]、吉富羅非魚[22]、中華絨螯蟹[23]和凡納濱對蝦[24]的研究中也得到了證實。本試驗發(fā)現(xiàn)，餌料中添加0.15 g/kg的BA可促進羅非魚的脂質(zhì)代謝，從而促進羅非魚生長。但過量攝入BA會誘發(fā)膽結(jié)石形成，擾亂脂質(zhì)代謝，降低羅非魚的生長性能[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，超量添加BA可明顯降低凡納濱對蝦的生長性能。

3.2 BA對凡納濱對蝦消化酶活性的影響

甲殼動物消化酶的活性與其食性、發(fā)育階段、營養(yǎng)、溫度、pH 值、鹽度等諸因素密切相關(guān)。BA 可顯著提高吉富羅非魚肝臟和腸道中的脂肪酶活性，對蛋白酶也具有一定影響[25]。翟少偉等[22]發(fā)現(xiàn)，300 mg/kg 的BA 可顯著提高吉富羅非魚腸道脂肪酶和蛋白酶活性；草魚腸道及肝胰臟的消化酶活性均隨BA添加量的增加呈先升高后下降的趨勢，且均高于對照組[11]。低魚粉餌料中添加0.5%、1.0% BA 可有效提高中華絨螯蟹肝胰腺、腸道的總蛋白酶和脂肪酶活力[23]。隨著高脂餌料中BA 水平增加，齊口裂腹魚肝胰腺蛋白酶活性、肝胰腺和前腸中的脂肪酶活性先升高后降低，前腸和中腸中的蛋白酶活性、中腸中的脂肪酶活性逐漸升高，且BA對后腸蛋白酶和脂肪酶活性以及前腸、中腸、后腸和肝胰腺淀粉酶活性無明顯影響[19]。草魚腸道各段及肝胰臟的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均隨BA添加量的增加呈先升高后下降的趨勢[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，餌料中添加適量BA對凡納濱對蝦蛋白酶和淀粉酶活性影響較小，但可顯著提高對蝦的脂肪酶活性，可能是BA鹽作為乳化劑乳化脂肪，使脂肪乳化成微滴，增加了胰脂肪酶的作用面積。本試驗還發(fā)現(xiàn)，超量BA對于對蝦的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均具有顯著的抑制作用。

3.3 BA對凡納濱對蝦免疫代謝相關(guān)基因表達的影響

CAT、GST 以及TLR 為蝦蟹類肝胰腺的重要免疫因子，在甲殼動物免疫防御中具有重要作用，ATPase和chymotrypsin在蝦蟹動物的生理代謝中起重要作用。草魚低蛋白高脂餌料中添加適宜水平BA，上調(diào)了草魚腸道SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、GST和谷胱甘肽還原酶（GR）基因表達和活力，從而提高抗氧化損傷能力[11]。1 500 mg/kg BA 能夠顯著激活大口黑鱸肝臟中絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（ERK1/2），參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移等多種生理過程，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及細胞存活、凋亡環(huán)節(jié)中具有關(guān)鍵調(diào)控功能[26]。高脂餌料組中，添加BA 顯著升高了紅鰭東方鲀肝臟CAT的基因表達量[27]。本研究結(jié)果顯示，添加1.0 g/kg BA 顯著提高了凡爾濱對蝦肝胰腺中CAT、TLR、GST、ATPase 和chymotrypsin的基因表達水平，推測適量的BA 能夠提高凡納濱對蝦的抗氧化能力和消化能力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，餌料中添加1.0 g/kg BA 可以增強凡納濱對蝦脂肪酶活性，上調(diào)免疫和代謝相關(guān)因子的基因表達，從而提高對蝦的生長性能。過量添加BA（4.0 g/kg）會降低消化酶活性、肝胰腺免疫和代謝相關(guān)因子的基因表達，從而降低對蝦的生長性能。