基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究馬錢子治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制*

陳玉婷,余 薇,鎮(zhèn)樹清,熊 麗**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北省咸寧麻塘中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕病科)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,其特征是進行性破壞性關(guān)節(jié)損傷和關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1]。關(guān)節(jié)受累通常與清晨僵硬對稱,其發(fā)病機制尚不完全清楚[2],據(jù)估計,全球RA的患病率在0.5%～1.0%[3]。RA的治療藥物包括非甾體類抗炎藥(如阿司匹林)[4]、慢效抗風(fēng)濕藥(如青霉胺)[5]和腎上腺皮質(zhì)類固醇(如氫化可的松)[6]。然而,這些西藥主要用于減輕癥狀,大多數(shù)表現(xiàn)出長期的不良反應(yīng)和毒性[7]。因此,需要新的策略來改善抗關(guān)節(jié)炎藥物的治療效果并降低毒性。RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇,其中,風(fēng)寒濕邪、經(jīng)絡(luò)不暢、痰瘀互結(jié)是導(dǎo)致RA發(fā)生、發(fā)展的病機關(guān)鍵。

馬錢子(semen strychni,SS)是臨床上比較常用的一味中藥,其別名有馬前、番木鱉、大方八、苦實等,始載于《本草綱目》,是馬前科植物云南馬前(strychnospier 2rtana A1 W1 will)或馬前(S.nux-Vomica L)的成熟種子[8]。馬錢子含有單體多肽,且有很強的抗炎、抗風(fēng)濕及類激素樣作用。其含有的多肽神經(jīng)毒素有神經(jīng)阻斷劑作用,能改善局部微循環(huán),從而起到明顯的鎮(zhèn)痛作用[9]。馬錢子在民間可用于治療RA和面神經(jīng)麻痹[10]。文獻報道[11]馬錢子可以影響單胺氧化酶含量以及色氨酸和多巴胺的代謝途徑,從而改變大腦中乙酰膽堿(ACH)等神經(jīng)遞質(zhì)的水平。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了馬錢子中RA的活性成分及其潛在靶點,對馬錢子有效成分-交集靶點-RA進行系統(tǒng)可視化網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建,對靶基因進行GO功能富集分析、KEGG信號通路分析,進而闡明馬錢子抗RA的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址及軟件

TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、GeneCards(https:// www.genecards.org)、DisGeNET(https://www.disgenet.org)、OMIM(https://www.omim.org)、Uniprot(https:www.uniprot.org)、Venny2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)、STRING(http://string-db.org/cgi/input.pl)、微生信(www.bioinformatics.com.cn)、軟件Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)和軟件Cytoscape3.9.0。

1.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析

1.2.1 馬錢子的活性成分和抗RA的靶點選取

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(traditional chinese medicine database and analysis platform,TCMSP)獲得了馬錢子的有效成分并通過Uniprot轉(zhuǎn)化其相應(yīng)的靶點,并使用“馬錢子”進行關(guān)鍵詞搜索,篩選出口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥20%,類藥性(drug-likeness,DL)≥0.1的信息。為了確定活性成分的靶點,刪除了重復(fù)的值,并利用蛋白質(zhì)序列和功能信息資源數(shù)據(jù)庫UniProt確定了馬錢子的靶點,利用Cytoscape3.9.0軟件繪制了活性成分和目標(biāo)之間的網(wǎng)絡(luò)圖譜。

1.2.2 疾病RA靶點的篩選

通過在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Rheumatoid arthritis”進行檢索。首先,在搜索框中輸入“Rheumatoid arthritis”之后點擊查詢,出現(xiàn)該疾病相關(guān)的基因,先后計算兩次GeneCards所得數(shù)據(jù)中Relevance score的中位數(shù),分別是0.55和1.12,篩選出中位數(shù)大于等于1.12的疾病靶點,取這兩個數(shù)據(jù)庫所得疾病靶點的并集并去除重復(fù)項后,得到RA的靶點。

1.2.3 馬錢子有效成分和RA交集靶點的獲取及蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)

網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將馬錢子有效成分和RA的靶點導(dǎo)入Venny2.1.0中制作韋恩圖,得到馬錢子有效成分與RA的交集靶點,導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中進行PPI分析。限定物種為“Homo Sapiens”,設(shè)置最低置信度為0.4,同時勾選隱藏游離的點,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖下載TSV格式并上傳至cytoscape 3.9.0軟件中,應(yīng)用CytoNCA插件計算各節(jié)點的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值,篩選核心靶點。

1.2.4 GO和KEGG富集分析

利用生物信息學(xué)開源軟件Bioconductor在R語言內(nèi)安裝運行clusterProfiler、Stringin、DOSE和Pathview程序,對其進行生物學(xué)過程的GO、KEGG功能富集分析,并通過微生信平臺進行可視化顯示。GO基因功能從生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三方面注釋藥物治療疾病的作用靶蛋白在基因功能中的作用,為闡明藥物治療疾病的靶點在信號通路中進行KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 馬錢子的活性成分和抗RA的靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索“馬錢子”,篩選出刺罌粟堿[(S)-Stylopine]和(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色氨酸-4-酮[(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one]等12個有效成分,其中OB≥20%、DL≥0.1,見表1。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將有效成分的靶點與人類基因名進行匹配,刪除重復(fù)值,并確定了32個潛在靶點。如圖1所示,Degree表示是在網(wǎng)絡(luò)分析中刻畫節(jié)點最直接度量指標(biāo),節(jié)點度越大就意味著這個節(jié)點的度中心性越高,該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。刺罌粟堿和(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色氨酸-4-酮Degree最高,所以它們可能是馬錢子治療RA兩個主要有效成分。

表1 馬錢子活性成分的篩選

利用GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫,對關(guān)鍵字進行“Rheumatoid arthritis”搜索,分別識別出5319和27個靶點。對從這兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的目標(biāo)數(shù)據(jù)進行合并和重復(fù)數(shù)據(jù)刪除后,鑒定出5319個RA靶點。最后,本研究使用維恩圖總結(jié)了馬錢子和RA有17個共同靶點,以便進一步分析,見圖2A。關(guān)于這些目標(biāo)的詳細信息見表2。此外,這17個RA交集靶點根據(jù)其細胞功能分為5類,其中跨膜信號受體(PC00197 35.29%)是最富集的類,見圖2B。

圖2 馬錢子抗RA的交集靶點的獲取及蛋白互作(PPI)

表2 馬錢子與RA交集靶點

將馬錢子有效成分與RA的17個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行PPI分析。PPI網(wǎng)絡(luò)包含17個節(jié)點,35條邊,平均度為4.12度(圖2C)。以NR3C1、SLC6A4、PTGS2、PGR、ESR1、AR、OPRM1、ADRB2、NR3C2和HTR3A為Degree排序前十核心靶點。其中,NR3C1、SLC6A4和PTGS2是相關(guān)性最高的前三個靶點,Degree分別為8、8和7,見圖2D。結(jié)果表明馬錢子成分通過多個靶點和生物學(xué)機制對RA有效。

2.2 馬錢子有效成分-交集靶點-RA構(gòu)建

為了探討馬錢子的有效成分治療RA的作用機制,利用馬錢子中的17個交集靶點和12個有效成分構(gòu)建了馬錢子-RA-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。刺罌粟堿[(S)-Stylopine](Degree=9)有效成分的靶點最多,表明馬錢子的有效成分很可能成為治療RA的重要機制。

圖3 馬錢子成分-靶點-疾病圖

2.3 馬錢子對RA的潛在作用機制

為了研究馬錢子對RA的潛在協(xié)同機制,在R語言內(nèi)安裝運行clusterProfiler和Stringin等程序,對其進行生物學(xué)過程的GO、KEGG功能富集分析。根據(jù)GO生物功能分析,BP條目861個,CC條目98個,MF條目127個,分別選取前10進行繪圖(圖4A-C)。BP主要是細胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路(GO:0030518)、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路(GO:0043401)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始(GO:0006367)、類固醇激素反應(yīng)(GO:0048545)和細胞對多巴胺的反應(yīng)(GO:1903351)等。CC主要集中突觸前膜(GO:0042734)、突觸后膜(GO:0045211)和突觸膜(GO:0097060)上。MF主要集中核受體活性(GO:0004879)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性(GO:0098531)和類固醇激素受體活性(GO:0003707)等方面,這表明馬錢子在多種生物學(xué)方面對RA的發(fā)生發(fā)展都有影響。

圖4 馬錢子活性成分抗RA關(guān)鍵靶基因富集分析

為了找出與馬錢子治療RA靶點有效成分相關(guān)的信號通路,進行KEGG富集通路分析,得到相關(guān)性最高的前20條信號通路(圖4D)。神經(jīng)活性配體受體相互作用通路(hsa04080)、化學(xué)致癌-受體激活通路(hsa05207)、血清素突觸通路(hsa04726)和鈣信號通路(hsa04020)等。KEGG通路富集分析見表3。

3 討 論

為了研究馬錢子對RA的治療作用,并揭示其潛在的分子機制,本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,確定了馬錢子中有12種抗RA成分的17個潛在靶點。在12種有效成分中,刺罌粟堿[(S)-Stylopine]有9個抗RA靶點。既往研究表明[12],馬錢子可以治療RA,但其作用機制尚不明確。到目前為止,關(guān)于刺罌粟堿和(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色氨酸-4-酮治療RA的還未有研究報道。本研究綜合探討了馬錢子對RA的治療作用。

根據(jù)研究結(jié)果,馬錢子的神經(jīng)活性配體受體相互作用通路和血清素能突觸通路是治療的重要途徑,可能是刺罌粟堿等活性成分中樞和外周兩種途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用以及降低血清中的血清素(5-HT)減少炎癥因子的分泌,達到治療的效果。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),NR3C1、SLC6A4和PTGS2是排名前三的靶點,推測馬錢子在RA治療中尤為重要。NR3C1核受體亞家族3C組成員1是重組蛋白屬于糖皮質(zhì)激素受體,它調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體(corticoid receptor,GR)參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)系統(tǒng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。與GR結(jié)合的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素(GCs)是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞合成和分泌的,能調(diào)節(jié)心血管功能,活化中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抑制免疫/炎癥反應(yīng)等多種生理、病理過程,是一種強有力的物質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[13]。SLC6A4是血清素轉(zhuǎn)運蛋白基因,PTGS2是前列腺素生物合成中的核心酶,有研究表明[14],SLC6A4和PTGS2這些目標(biāo)主要與氧化應(yīng)激、激素失調(diào)等有關(guān)。

進一步進行GO生物過程富集分析和KEGG信號通路分析,GO生物過程富集主要包括細胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路和RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始等。KEGG信號通路得到20條信號通路與治療RA有關(guān),其中神經(jīng)活性配體受體相互作用通路、化學(xué)致癌-受體激活通路、血清素突觸通路和鈣信號通路等。核心靶點NR3C1、SLC6A4和PTGS2主要富集神經(jīng)活性配體受體相互作用通路和血清素能突觸通路。據(jù)報道[15],NR3C1多態(tài)性與某些免疫介導(dǎo)疾病的易感性和類固醇治療敏感性的差異有關(guān)。血清素能突觸中5-羥色胺2受體調(diào)控的SLC6A4出現(xiàn)顯著高表達[16]。PTGS2已被證明在阿爾茨海默病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17-18]。PTGS2可能通過激活其下游通路(如PI3K/AKT通路)來增加炎癥趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生,從而促進神經(jīng)元凋亡和炎癥并抑制神經(jīng)突生長[19]。通過對馬錢子抗RA相關(guān)的作用靶點進行GO生物過程富集分析、KEGG信號通路分析,證明了馬錢子是通過多靶點、多通路發(fā)揮治療RA的作用。

綜上所述,本研究通過藥理學(xué)方法確定了馬錢子治療RA的關(guān)鍵成分、核心靶點和途徑?；谶@些證據(jù)表明,刺罌粟堿和(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色氨酸-4-酮可能通過神經(jīng)活性配體受體相互作用通路和血清素能突觸通路作用于NR3C1、SLC6A4、PTGS2靶點。馬錢子可能是通過神經(jīng)活性配體受體相互作用通路、下調(diào)血清素能突觸通路發(fā)揮抗RA作用的,以期為今后深入研究馬錢子治療RA的關(guān)鍵機制提供理論依據(jù)。