高效液相色譜檢測葡萄及葡萄酒中7 種有機酸方法的建立

沈 燕，張正文，劉興凱，王福成，邵學東*

（1.君頂酒莊有限公司，山東煙臺 265607；2.煙臺市蓬萊區(qū)葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心，山東煙臺 265699）

有機酸是葡萄果實及葡萄酒中體現(xiàn)風味的主要物質(zhì)之一，其含量是衡量葡萄果實成熟度和品質(zhì)的重要參數(shù)，在葡萄酒的釀造中發(fā)揮著關鍵作用，對酒的感官質(zhì)量有一定的影響，與酒的物理化學以及微生物穩(wěn)定性有著緊密聯(lián)系[1-4]。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸普遍存在于葡萄果實以及葡萄酒中，具有各自的特點及功效[4-5]。此外，有機酸含量的高低會直接影響葡萄酒的酸堿平衡與整體的口感風味[6-7]。

近年來，采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定葡萄及葡萄酒中有機酸的方法有很多，相較于氣相色譜、離子色譜以及其他的傳統(tǒng)檢測方法，HPLC 具有對樣品要求低、操作簡單、檢測時間短、結(jié)果準確、重復性好以及可同時檢測多種有機酸等優(yōu)點，應用廣泛[8]。液相設備和色譜柱型號不同，檢測條件及方法也不盡相同，導致有機酸檢測結(jié)果有差異。本研究擬用HPLC 法，在前人研究的基礎上，對檢測條件進行優(yōu)化，形成一套檢測葡萄及葡萄酒中有機酸的完整體系，為葡萄酒企業(yè)提供良好的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄及葡萄酒樣品，君頂酒莊有限公司；純凈水，娃哈哈宏振食品飲料貿(mào)易有限公司；濃硫酸（分析純），山東萊陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)精細化工廠；酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸、乳酸和乙酸（標準品），英國政府檢測標準集團。

1.2 儀器與設備

1260 Infinity II 高效液相色譜儀；G7114A1260 VWD 檢測器；Hi-Plex H 色譜柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）；PL Hi-Plex H 保護柱（50 mm×7.7 mm，8 μm），美國Agilent 公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HC-3016R 高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試樣處理

取5 mL 葡萄汁或葡萄酒于離心管中，在14 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min，抽取上清液，用0.45 μm 膜過濾，將濾液置于進樣小瓶中待測。

1.3.2 標準品處理

有機酸混合標準品配制前，將標準品分別注入儀器中，以確認各有機酸出峰順序及預計保留時間。混合標準品母液配制：酒石酸4 000 mg·L-1、蘋果酸4 060 mg·L-1、檸檬酸4 060 mg·L-1、乳酸4 100 mg·L-1、草 酸2 020 mg·L-1、 琥 珀 酸2 140 mg·L-1、 乙 酸2 100 mg·L-1，按照實驗要求稀釋到不同濃度梯度備用。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Hi-Plex H（300 mm×7.7 mm，8 μm）；波長：205 ～215 nm；流動相：0.004 ～0.008 mol·L-1硫酸水溶液；流速：0.4 ～0.8 mL·min-1；柱溫箱溫度：40 ～60 ℃；有機酸進樣量：5 ～15 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 檢測有機酸條件優(yōu)化

2.1.1 波長的選擇

根據(jù)馬永強等[8]的研究，在波長205 ～215 nm下進行有機酸的檢測。結(jié)果表明，在210 nm 波長下，7 種有機酸的響應值最高。

2.1.2 流動相的選擇

根據(jù)色譜柱使用要求及郭燕等[9]的研究，比較0.004 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.006 mol·L-1、0.007 mol·L-1和0.008 mol·L-1的硫酸作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，低濃度下（0.006 mol·L-1濃度以下），檸檬酸與酒石酸分離效果較差；高濃度下（0.006 mol·L-1濃度以上），整體分離效果都差。因此，選擇0.006 mol·L-1的硫酸作流動相。

2.1.3 流速的選擇

根 據(jù) 丁 玲 等[10]的 研 究， 在0.4 mL·min-1、0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1和0.8 mL·min-1流速下檢測有機酸。在低流速下，草酸的峰出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象，且檢測時間長，全部出峰所需時間約40 min；在高流速下，柱壓過高，可達48 MPa，而色譜柱最高壓力要求為50 MPa。因此，確定流速為0.6 mL·min-1。

2.1.4 柱溫的選擇

根據(jù)張軍等[11]的研究，選擇在柱溫為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃下對有機酸進行檢測。當柱溫較低時，檸檬酸與酒石酸的分離度過低，隨著柱溫的升高，二者分離度逐漸增大。60 ℃為Hi-Plex H 色譜柱的最高使用溫度，因此為了柱效以及長期檢測效果，確定檢測柱溫為55 ℃。

2.1.5 進樣量的選擇

根據(jù)丁青芝等[12]的研究，選擇進樣量為5 μL、10 μL、15 μL 檢測有機酸，當進樣量為5 μL 時，各有機酸的響應值相對較低，當進樣量為15 μL 時，檸檬酸與酒石酸的分離度不到1.5。因此，確定進樣量為10 μL。

綜上所述，HPLC 檢測有機酸的最佳色譜條件為紫外檢測波長210 nm；流動相0.006 mol·L-1硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱溫55 ℃；進樣量10 μL。

2.2 方法學研究

2.2.1 標準曲線的繪制

根據(jù)上述優(yōu)化得到的色譜條件，將不同濃度梯度的有機酸混合標準品進樣，得出7 種有機酸的色譜圖，見圖1。出峰時間在20 min 內(nèi)，分離度均大于1.5。用峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x，mg·L-1）繪制7 種有機酸標準曲線，見表1。

表1 有機酸的線性相關性

圖1 有機酸標準品的色譜圖

由表1 可知，7 種有機酸的峰面積和濃度的相關系數(shù)（R2）都在0.999 9 ～1.000 0，說明在相應的濃度范圍內(nèi)線性關系良好；各有機酸的最低檢出限在0.031 4 ～0.722 3 mg·L-1（信噪比（S/N≥3），說明該方法的靈敏度較高。

2.2.2 加標回收率

取一葡萄酒樣品，添加3 種不同濃度的有機酸標準品，重復檢測6 次，結(jié)果見表2。各有機酸加標回收率在95.24%～102.04%，相對標準偏差在0.16%～1.87%，表明該方法的準確性良好。

表2 有機酸加標回收率

2.3 HPLC 檢測有機酸方法的精密度

2.3.1 有機酸保留時間的重現(xiàn)性

取一葡萄酒樣品，重復檢測6 次，測定各有機酸的保留時間，結(jié)果見表3，各有機酸保留時間的標準偏差在0.005 ～0.073 min，相對標準偏差在0.029%～0.811%，說明在該條件下，有機酸保留時間具有良好的重現(xiàn)性。

表3 有機酸保留時間的重現(xiàn)性

2.3.2 有機酸含量的重現(xiàn)性

取一葡萄酒樣品，重復檢測6 次，測定各有機酸的平均含量，結(jié)果見表4。各有機酸含量的標準偏差在3.024 ～11.430 mg·L-1，相對標準偏差在0.388%～3.426%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

表4 有機酸含量的重現(xiàn)性

3 結(jié)論

本研究確定了HPLC 檢測葡萄以及葡萄酒中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸等7 種有機酸的方法，最佳色譜條件如下。色譜柱為Hi-Plex H；紫外檢測波長為210 nm；流動相 為0.006 mol·L-1的 硫 酸；流 速 為0.6 mL·min-1；柱溫為55 ℃；進樣量為10 μL。該方法樣品前處理簡便、檢測時間短、靈敏度高、精確性及準確性好，適用于葡萄及葡萄酒中有機酸的快速檢測。