漢防己甲素降低大鼠血尿酸水平的機(jī)制研究

吳曙智 葛朝洪 梅傳州 陳連國(guó) 鐘優(yōu)艷

[摘要]?目的?探討漢防己甲素對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸（uric?acid，UA）的影響。方法?將40只SPF級(jí)別雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對(duì)照組、高尿酸血癥模型組、別嘌醇模型組、漢防己甲素低劑量模型組和漢防己甲素高劑量模型組，每組8只。用腺嘌呤（200mg/kg）與氧嗪酸鉀（250mg/kg）聯(lián)合飼喂酵母飼料（10g/kg）的方法構(gòu)建高尿酸血癥的大鼠模型，空白對(duì)照組喂普通飼料。造模成功后，從第8天起，每天下午給予別嘌呤模型組大鼠灌胃別嘌呤醇（40mg/kg），漢防己甲素低劑量模型組、漢防己甲素高劑量模型組分別灌胃16mg/kg和32mg/kg漢防己甲素，空白對(duì)照組與高尿酸血癥模型組灌胃同等體積的生理鹽水。給藥后每周采集大鼠血液檢測(cè)UA、血肌酐（serum?creatinine，Scr）及血尿素氮（blood?uric?nitrogen，BUN）水平，處死后取肝臟檢測(cè)黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，XOD）和腺苷脫氨酶（adenosine?deaminase，ADA）活性。結(jié)果?干預(yù)1周時(shí)，除空白對(duì)照組外，各組UA水平均顯著升高（P<0.05），造模成功。與高尿酸血癥模型組相比，干預(yù)2周、3周、4周時(shí)，低劑量漢防己甲素組的UA、Scr和BUN水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)4周時(shí)，高劑量漢防己甲素模型組的UA水平顯著降低（P<0.05）。干預(yù)3周、4周時(shí)，高劑量漢防己甲素模型組Scr水平均顯著降低（P<0.05），干預(yù)2周時(shí)，高劑量漢防己甲素模型組的BUN水平顯著降低（P<0.05）。與高尿酸血癥模型組相比，高劑量漢防己甲素模型組XOD活性顯著降低（P<0.05），低劑量漢防己甲素模型組、高劑量漢防己甲素模型組ADA活性均顯著降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論?漢防己甲素對(duì)高尿酸血癥大鼠有改善效果，可能的機(jī)制是其對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞]?漢防己甲素；高尿酸血癥；血尿酸；黃嘌呤氧化酶

[中圖分類號(hào)]?R589??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.005

Study?on?the?mechanism?of?tetrandrine?to?reduce?blood?uric?acid?level?in?rats

WU?Shuzhi1，?GE?Chaohong2，?MEI?Chuanzhou2，?CHEN?Lianguo2，?ZHONG?Youyan3

1.Department?of?Neurology，?Wenzhou?Peoples?Hospital，?Wenzhou?325000，?China;?2.Department?of?Pharmacy，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Wenzhou?Medical?University，?Wenzhou?325000，?China;?3.Department?of?Pharmacy，?Wenzhou?Peoples?Hospital，?Wenzhou?325000，?China

[Abstract]?Objective?To?study?the?effect?of?tetrandrine?on?serum?uric?acid?（UA）?in?hyperuricemia?rats.?Methods?A?total?of?40?SPF-rated?male?rats?were?divided?into?blank?control?group，?hyperuricemia?model?group，?hyperuricemia?model?with?allopurinol?group，?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?low-dose?group?and?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?according?to?random?number?table?method，?with?8?rats?in?each?group.?The?rat?model?of?hyperuricemia?was?constructed?by?feeding?adenine?（200mg/kg）?with?potassium?oxyzincate?（250mg/kg）?in?combination?with?yeast?diet?（10g/kg），?while?the?blank?control?group?was?fed?with?normal?diet.?From?day?8?onwards，?the?rats?were?given?allopurinol?（40mg/kg）?by?gavage?in?the?afternoon?every?day，?16mg/kg?and?32mg/kg?of?tetrandrine?in?the?low-dose?model?group?and?high-dose?model?group?respectively，?and?the?same?volume?of?saline?in?the?blank?control?group?as?in?the?hyperuricemia?model.?After?administration，?blood?was?collected?weekly?from?the?rats?to?test?the?levels?of?blood?UA，?serum?creatinine?（Scr）?and?blood?urea?nitrogen?（BUN），?and?liver?was?taken?after?execution?to?test?the?activities?of?xanthine?oxidase?（XOD）?and?adenosine?deaminase?（ADA）.?Results?After?1?week?of?intervention，?UA?levels?were?significantly?higher?in?all?groups?except?the?blank?control?group?（P<0.05），?and?modelling?was?successful.?There?was?no?statistically?significant?difference?in?UA，?Scr?and?BUN?levels?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?low-dose?group?at?2?weeks，?3?weeks?and?4?weeks?of?intervention?compared?to?the?hyperuricemia?model?group?（P>0.05）.?At?4?weeks?of?intervention，?UA?levels?were?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?（P<0.05）.?At?3?and?4?weeks?of?intervention，?the?Scr?level?was?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?（P<0.05）.?At?2?weeks?of?intervention，?BUN?levels?were?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?（P<0.05）.?XOD?activity?was?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?compared?to?the?hyperuricemia?model?group?（P<0.05）.?The?ADA?activity?was?significantly?reduced?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?low-dose?group?and?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group，?and?the?differences?were?not?statistically?significant?（P>0.05）.?Conclusion?The?ameliorative?effect?of?tetrandrine?on?hyperuricemia?rats.?The?possible?mechanism?for?the?improvement?of?hyperuricemia?in?rats?is?the?inhibition?of?xanthine?oxidase?activity，?but?the?exact?mechanism?of?action?needs?to?be?further?investigated.

[Key?words]?Tetrandrine;?Hyperuricemia;?Blood?uric?acid;?Xanthine?oxidase

高尿酸血癥是導(dǎo)致痛風(fēng)的主要原因，主要的發(fā)病機(jī)制是血尿酸（uric?acid，UA）生成增加或排泄減少[1-2]。治療高尿酸血癥的藥物主要有抑制尿酸生成藥物（別嘌呤醇等）、促進(jìn)尿酸溶解藥物（拉布立酶等）、降低尿酸藥物（氯沙坦等）、促進(jìn)尿酸排泄藥物（苯溴馬隆等）[3-4]。目前，一線常用降尿酸藥物如別嘌呤醇和丙磺舒，長(zhǎng)期使用容易引起肝腎損害[5]、超敏反應(yīng)、遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)以及嚴(yán)重的皮疹等[6]。因此，尋找更安全有效的降尿酸藥物成為研究者的關(guān)注點(diǎn)之一。中藥治療高尿酸血癥的研究逐步受到關(guān)注[7]。漢防己甲素具有多種藥理作用[8-9]，研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素能夠降低SD大鼠血液中尿酸[10]?？紤]到漢防己甲素具有消腫、鎮(zhèn)痛、抗關(guān)節(jié)炎等作用，可能是一種潛在的降尿酸藥物。因此，本研究通過(guò)建立大鼠高尿酸血癥模型來(lái)探討漢防己甲素的降尿酸作用。

1??材料與方法

1.1??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重（200±20）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0020；動(dòng)物倫理號(hào)：wydw2022-0080]。40只實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，實(shí)驗(yàn)室溫度為（25±2）℃，濕度為（55±5）%，每天12h光照交替。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、高尿酸血癥模型組、別嘌醇模型對(duì)照組、漢防己甲素高劑量模型組和漢防己甲素低劑量模型組，每組8只。4個(gè)模型組每天上午用腺嘌呤（200mg/kg）與氧嗪酸鉀（250mg/kg）溶于聚乙二醇后的溶液灌胃并聯(lián)合酵母飼料（10g/kg）飼喂1周來(lái)構(gòu)建高尿酸血癥大鼠模型，空白對(duì)照組喂普通飼料并每天上午灌胃等量聚乙二醇。第8天開(kāi)始，4組酵母飼料灌胃組每天上午繼續(xù)灌胃腺嘌呤與氧嗪酸鉀，下午給予別嘌呤模型組灌胃40mg/kg的別嘌呤醇（溶于生理鹽水），漢防己甲素低劑量和高劑量模型組分別灌胃16mg/kg和32mg/kg漢防己甲素（溶于生理鹽水）；空白對(duì)照組與高尿酸血癥模型組灌胃同等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥21d，每周測(cè)量1次體質(zhì)量并進(jìn)行尾靜脈取血，全血離心取血清存于–80℃冰箱待檢。最后1周將大鼠處死，取肝臟，于液氮速凍后存于–80℃待測(cè)。

1.2??儀器與試劑

主要試劑：漢防己甲素（貨號(hào)：F-001-20g）和別嘌醇（貨號(hào)：A7690）分別購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司，腺嘌呤（貨號(hào)：A6279-100g）和氧嗪酸鉀（貨號(hào)：P137112-100g）分別購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司，20%含量的酵母飼料購(gòu)買于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。

主要儀器和耗材：大鼠灌胃針、高速離心機(jī)（型號(hào)5804R）、冰箱、電子天平及全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)AU5831）。南京建成生物工程研究所的檢測(cè)腺苷脫氨酶（adenosine?deaminase，ADA）試劑盒（A048-2-1，96T），Solarbio的黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，XOD）活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC1095）。

1.3??方法

1.3.1??血液指標(biāo)監(jiān)測(cè)??造模后每周大鼠尾靜脈取血（取血前12h禁食但不禁水），3500轉(zhuǎn)/min，離心10min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血中UA、血肌酐（serum?creatinine，Scr）、血尿素氮（blood?urea?nitrogen，BUN）水平。

1.3.2??臟器酶活性檢測(cè)??取0.10～0.15g肝臟，按照組織質(zhì)量（g）∶試劑體積（ml）=1∶10進(jìn)行混合，用玻璃勻漿器進(jìn)行冰浴勻漿，在4℃條件下，8500轉(zhuǎn)/min，離心10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

1.3.3??黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，XOD）活性檢測(cè)??按照XOD活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟操作，將離心后的上清液樣本和檢測(cè)試劑混勻，37℃水浴/恒溫培養(yǎng)箱放置20min，于96孔板中，測(cè)定530nm處吸光度，并按樣本蛋白濃度計(jì)算酶活。XOD活性（U/mg?prot）=（?A樣本÷?A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)）×1000×V樣÷（Cpr×V樣）÷T×F=12.5×?A樣本÷?A標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F。其中，單位（U/mg?prot）的定義為每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol?NO2-定義為一個(gè)酶活力單位。另外，?A樣本=A測(cè)定－A空白，?A標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)－A空白，C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液亞硝酸鈉的濃度（10μmol/ml），T為反應(yīng)時(shí)間（20min），Cpr為樣本蛋白濃度（mg/ml），F(xiàn)為稀釋倍數(shù)。

1.3.4??腺苷脫氨酶（adenosine?deaminase，ADA）活性檢測(cè)??然后按照ADA試劑盒測(cè)定步驟操作，將離心后的上清液樣本和檢測(cè)試劑混勻，37℃水浴/恒溫培養(yǎng)箱放置7min，于96孔板中546nm處連續(xù)2min吸光度值的變化，計(jì)算?A/min，并按樣本蛋白濃度計(jì)算酶活：組織ADA活性（U/g?prot）=（?A測(cè)定–?A空白）÷（?A標(biāo)準(zhǔn)-?A空白）×C標(biāo)÷Cpr。其中，C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液腺苷脫氨酶的濃度（38.6U/L），Cpr為樣本蛋白濃度（g/L）。

1.4??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??造模后體質(zhì)量變化情況

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組均出現(xiàn)大鼠死亡的現(xiàn)象，對(duì)照組1例，各模型組均2例。剔除所有死亡大鼠的數(shù)據(jù)指標(biāo)，各組取6只大鼠進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。造模后，除對(duì)照組外，各模型組大鼠的體質(zhì)量都有不同程度的減輕，見(jiàn)圖1。

2.2??UA水平比較

干預(yù)1周時(shí)，除空白對(duì)照組外，各組UA水平均顯著升高（P<0.05），造模成功。與高尿酸血癥模型組相比，干預(yù)2周時(shí)，別嘌呤醇模型組的UA水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)3周、4周時(shí)，別嘌呤醇模型組的UA水平顯著降低（P<0.05）；干預(yù)2周、3周、4周時(shí)，低劑量漢防己甲素組的UA水平與高尿酸血癥模型組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），干預(yù)4周時(shí)，高劑量漢防己甲素模型組的UA水平顯著降低（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3??Scr和BUN水平比較

各組大鼠初始（第0周）各組Scr和BUN水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)1周時(shí)，與空白對(duì)照組相比，各組Scr和BUN水平均顯著升高（P<0.05）。與高尿酸血癥組相比，干預(yù)2周、3周、4周時(shí)，別嘌呤醇模型組的Scr水平均顯著降低（P<0.05）；干預(yù)3周、4周時(shí)，高劑量漢防己甲素模型組Scr水平均顯著降低（P<0.05）；干預(yù)2周時(shí)，高劑量漢防己甲素模型組的BUN水平顯著降低（P<0.05）。干預(yù)2周、3周、4周時(shí)，低劑量漢防己甲素組的Scr和BUN水平與高尿酸血癥模型組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2、3。

2.4??XOD、ADA活性比較

高尿酸血癥模型組大鼠的XOD、ADA活性均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。與高尿酸血癥模型組相比，別嘌呤醇模型組大鼠的XOD、ADA活性均顯著降低（P<0.05），高劑量漢防己甲素組XOD活性顯著降低（P<0.05），高劑量漢防己甲素組ADA活性低于高尿酸血癥模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；低劑量漢防己甲素組大鼠XOD、ADA活性與高尿酸血癥模型組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2、3。

3??討論

高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸含量升高從而引發(fā)的疾病。UA水平偏高與多種疾病有關(guān)，已成為威脅患者健康的重要影響因素之一。UA的生成和排泄這兩個(gè)復(fù)雜的代謝過(guò)程與其發(fā)病有關(guān)，而發(fā)病的機(jī)制可能與嘌呤代謝特異性酶活性的異常或缺失有關(guān)[11-12]。中醫(yī)藥具有安全性高、療效好等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為高尿酸血癥的治療研究熱點(diǎn)之一[13]。

本研究中的高尿酸血癥大鼠造模方法主要參考石慧等[14]的文獻(xiàn)，采用酵母膏（10mg/kg）飼料喂養(yǎng)，結(jié)合腺嘌呤（100mg/kg）灌胃給藥聯(lián)合氧嗪酸鉀（300mg/kg）間隔（第1、3、7天）腹腔注射的方案誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠模型。該方案可在短期內(nèi)安全誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠模型，模型效果持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。為了方便給藥，本研究在此基礎(chǔ)上，每天上午給予大鼠灌胃含200mg/kg腺嘌呤及300mg/kg氧嗪酸鉀的混合溶液，結(jié)合酵母膏（10mg/kg）飼料喂養(yǎng)的造模方案來(lái)構(gòu)建本研究所需的高尿酸血癥模型大鼠。但200mg/kg腺嘌呤及300mg/kg氧嗪酸鉀在生理鹽水中溶解性差，靜置易沉淀，聚乙二醇可以親水又有一定的親脂性，是很好的溶劑和增溶劑，因此本研究選擇腺嘌呤（200mg/kg）與氧嗪酸鉀（250mg/kg）溶于聚乙二醇中灌胃并聯(lián)合酵母飼料（10mg/kg酵母）喂養(yǎng)的方式來(lái)構(gòu)建高尿酸血癥大鼠模型。本研究結(jié)果顯示，造模1周后，除空白對(duì)照組外，各組大鼠UA明顯升高，說(shuō)明模型造模成功，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠死亡例數(shù)在可接受范圍（2/8）。

另外，本研究結(jié)果顯示，與高尿酸血癥組相比，各模型組大鼠的Scr和BUN水平顯著升高，說(shuō)明該造模方法對(duì)大鼠的腎臟造成了一定損害，與石慧等[14]的報(bào)道一致。本研究結(jié)果顯示，XOD及ADA活性檢測(cè)結(jié)果顯示，高劑量的漢防己甲素能顯著抑制XOD的活性，對(duì)ADA活性可能也具有一定的效應(yīng)，且對(duì)Scr也有一定的調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明其可用于降低尿酸水平。究其原因，可能是漢防己甲素作為天然活性成分，影響嘌呤代謝中XOD的活性，從而抑制尿酸的生成，調(diào)控尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)腎臟排泄尿酸，改善高尿酸血癥所致的腎損傷[15]。

綜上所述，漢防己甲素對(duì)大鼠高尿酸血癥有一定的治療作用，具有潛在的藥用價(jià)值，下一步計(jì)劃漢防己甲素對(duì)肝臟XOD等關(guān)鍵酶活性的具體影響進(jìn)行深入研究。

[參考文獻(xiàn)][1] 繆建春，?楊泰源，?彭煒，?等.?萆薢車前茯苡湯對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸及黃嘌呤氧化酶的影響[J].?中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，?2016，?16（9）：?1166–1168.

[3] 孫珊珊，?曲連悅，?杜榮蓉，?等.?高尿酸血癥藥物治療研究進(jìn)展[J].?中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，?2019，?24（5）：?589–594