• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及分子對(duì)接探討黃芪治療胃癌的作用機(jī)制

    2023-07-04 13:08:42胡文杰王鈺婷于白莉
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2023年16期
    關(guān)鍵詞:生存分析黃芪胃癌

    胡文杰 王鈺婷 于白莉

    [摘要]?目的?探討黃芪治療胃癌的作用機(jī)制。方法?通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)檢索黃芪的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)。癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)下載胃癌基因表達(dá)譜及臨床特征數(shù)據(jù),采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted?correlation?network?analysis,WGCNA)識(shí)別胃癌共表達(dá)模塊。將黃芪的作用靶點(diǎn)與胃癌共表達(dá)模塊、差異基因取交集。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein?interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)并提取黃芪改善胃癌預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。通過GSE54129數(shù)據(jù)集、人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)、分子對(duì)接對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果?共檢索到黃芪有效活性成分16個(gè)及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)190個(gè);篩選得到差異表達(dá)基因2694個(gè),其中上調(diào)基因1124個(gè),下調(diào)基因1570個(gè);構(gòu)建的WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)青綠色模塊與胃癌有顯著而穩(wěn)定的相關(guān)性,構(gòu)建韋恩圖得到黃芪改善胃癌預(yù)后的27個(gè)差異表達(dá)基因。PPI網(wǎng)絡(luò)鑒定得到10個(gè)關(guān)鍵基因,其中,微囊蛋白1(caveolin?1,CAV1)、前列腺素E2受體EP3亞型(prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype,PTGER3)與胃癌患者的生存顯著相關(guān)。分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn),黃芪活性成分與PTGER3具有較好的結(jié)合能。結(jié)論?黃芪改善胃癌預(yù)后的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)CAV1和PTGER3有關(guān)。

    [關(guān)鍵詞]?黃芪;加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析;胃癌;生存分析;生物信息

    [中圖分類號(hào)]?R735.2??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.019

    The?mechanism?of?astragalus?in?treatment?of?gastric?cancer?based?on?TCGA?database?and?molecular?docking

    HU?Wenjie,?WANG?Yuting,?YU?Baili

    Department?of?General?Practice,?Hospital?of?Chengdu?University?of?Traditional?Chinese?Medicine,?Chengdu,?610075,?Sichuan,?China

    [Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?astragalus?in?treatment?of?gastric?cancer.?Methods?The?chemical?constituents?and?targets?of?astragalus?were?searched?through?traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform.?The?Cancer?Genome?Atlas?database?was?downloaded?for?gastric?cancer?gene?expression?data?and?clinical?data,?and?weighted?correlation?network?analysis?(WGCNA)?was?used?to?identify?gastric?cancer?co-expression?modules.?The?target?of?astragalus?was?intersected?with?gastric?cancer?co-expression?modules?and?differential?genes.?Potential?targets?were?validated?using?the?GSE54129?dataset,?Human?Protein?Atlas?database,?and?molecular?docking.?Results?A?total?of?16?active?ingredients?and?190?corresponding?targets?of?astragalus?were?retrieved.?2694?differentially?expressed?genes?were?screened,?of?which?1124?genes?were?up-regulated?and?1570?genes?were?down-regulated.?The?constructed?WGCNA?co-expression?network?showed?a?significant?and?stable?correlation?between?the?cyan?module?and?gastric?cancer,?and?27?differentially?expressed?genes?of?astragalus?were?obtained?by?constructing?the?Venn?diagram.?Ten?key?genes?were?identified?by?PPI?network,?among?which?caveolin?1?(CAV1)?and?prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype?(PTGER3)?were?significantly?correlated?with?the?survival?of?patients?with?gastric?cancer.?The?molecular?docking?results?showed?that?the?active?ingredients?of?astragalus?had?good?binding?energy?with?PTGER3.?Conclusion?The?mechanism?of?astragalus?improving?the?prognosis?of?gastric?cancer?may?be?related?to?regulating?CAV1?and?PTGER31.

    [Key?words]?Astragalus;?Weighted?correlation?network?analysis;?Gastric?cancer;?Survival?analysis;?Bioinformatics

    胃癌居全球癌癥發(fā)病譜的第5位與死因譜的第4位,據(jù)估計(jì)全球每年新增胃癌病例超過100萬(wàn)例[1-2]。在中國(guó),多數(shù)胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于疾病晚期,5年生存率不足50%[3]。胃癌的早期診斷較為困難,盡管采取新輔助化療、放射治療及免疫治療等多種治療手段,但其復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率仍較高[4]。因此,如何降低胃癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,減輕藥物不良反應(yīng),改善胃癌患者預(yù)后,是臨床研究的重點(diǎn)。黃芪具有補(bǔ)氣固表、托毒生肌的功效,其抗癌機(jī)制主要圍繞調(diào)節(jié)腫瘤免疫、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤細(xì)胞遷移侵襲、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗新生血管生成及聯(lián)合化療藥物的增效減毒等方面[5-6]。研究表明黃芪提取物可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞體外增殖且通過線粒體途徑誘導(dǎo)其凋亡,但黃芪改善胃癌預(yù)后的作用靶點(diǎn)及潛在機(jī)制目前尚未明確[5]。中藥成分復(fù)雜,作用靶點(diǎn)較多,本文通過生物信息學(xué)揭示黃芪在胃癌預(yù)后中的潛在價(jià)值,為黃芪治療胃癌的新藥開發(fā)及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

    1??材料與方法

    1.1??藥物靶點(diǎn)

    通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform,TCMSP)以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),得到黃芪的有效活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)矯正去重。

    1.2??胃癌基因表達(dá)譜下載及差異分析

    進(jìn)入癌癥基因組圖譜(The?Cancer?Genome?Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù),下載胃癌基因表達(dá)譜及相應(yīng)臨床特征數(shù)據(jù),去除臨床信息不全樣本,以P<0.05、|Log2FC|>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的基因并建立差異表達(dá)矩陣。

    1.3??加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

    利用R軟件將下載的胃癌基因表達(dá)譜進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted?correlation?network?analysis,WGCNA),構(gòu)建無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò),設(shè)置合適的閾值(β)。將β轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣(topological?overlap?matrix,TOM)及相應(yīng)的相異度(1-TOM),構(gòu)建1-TOM矩陣的層次聚類樹形圖,將相似的基因表達(dá)劃分為不同的模塊。將得到模塊中的基因靶點(diǎn)與黃芪的作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集,選取交集靶點(diǎn)最多的模塊作為目標(biāo)模塊。取目標(biāo)模塊、黃芪作用靶點(diǎn)、差異表達(dá)基因三者的交集,其共同靶點(diǎn)為黃芪改善胃癌預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。

    1.4??基因功能富集分析

    為了解黃芪改善胃癌患者預(yù)后的模塊基因的生物學(xué)功能,利用R軟件以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)模塊靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(gene?ontology,GO)富集分析,包括生物過程、細(xì)胞成分、分子功能三部分。

    1.5??蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

    將黃芪改善胃癌預(yù)后的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein?interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),下載TSV格式文件,導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)可視化圖。利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的最大團(tuán)中心性(maximal?clique?centrality,MCC)值,MCC值高的前10個(gè)基因被認(rèn)為是黃芪改善胃癌預(yù)后的關(guān)鍵基因。

    1.6??生存分析

    利用R軟件,對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Kaplan-Meier法對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行單因素生存分析,比較不同基因表達(dá)水平患者的總生存時(shí)間。

    1.7??數(shù)據(jù)驗(yàn)證

    為驗(yàn)證關(guān)鍵基因的穩(wěn)健性,進(jìn)入基因表達(dá)綜合(Gene?Expression?Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)集GSE54129,該數(shù)據(jù)集包括111例胃癌組織和21例癌旁組織的基因表達(dá)譜芯片,利用R語(yǔ)言對(duì)關(guān)鍵基因在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。人類蛋白質(zhì)圖譜(Human?Protein?Atlas,HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)提供大量特定人類組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索生存相關(guān)基因,下載該基因在胃癌組織與癌旁組織中的免疫組化圖譜,明確關(guān)鍵基因在胃癌組織中的蛋白水平。

    1.8??分子對(duì)接

    從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載小分子化合物的mol2格式文件,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein?Data?Bank,PDB)下載大分子蛋白結(jié)構(gòu),利用PyMOL軟件對(duì)大分子去除原配體,去水加氫處理。將大分子與小分子配體導(dǎo)入AutoDock軟件構(gòu)建活性口袋,明確中心位點(diǎn),進(jìn)行分子對(duì)接。

    2??結(jié)果

    2.1??成分靶點(diǎn)構(gòu)建

    通過TCMSP得到黃芪有效活性成分16個(gè)及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)190個(gè),構(gòu)建“成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)路,見圖1。圖中節(jié)點(diǎn)代表黃芪的有效活性成分及靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連線代表成分與靶點(diǎn)的關(guān)系,由圖1可知槲皮素(MOL000098)、山奈酚(MOL000422)、黃芪異黃烷苷(MOL000378)、刺芒柄花素(MOL000392)、異鼠李素(MOL000354)等成分為黃芪的主要活性成分。

    2.2??胃癌的差異基因分析

    從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載胃癌基因表達(dá)譜,篩選得到差異表達(dá)基因2694個(gè),其中上調(diào)基因1124個(gè),下調(diào)基因1570個(gè),根據(jù)結(jié)果繪制差異表達(dá)基因火山圖,見圖2。

    2.3??WGCNA

    基于1-TOM矩陣的基因?qū)哟尉垲悓?duì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊的聚類樹狀圖進(jìn)行排序,共確定14個(gè)模塊,繪制“模塊–臨床特征”熱圖。構(gòu)建的WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)青綠色模塊與胃癌有顯著而穩(wěn)定的相關(guān)性,將青綠色模塊、胃癌差異表達(dá)基因、黃芪作用靶點(diǎn)取交集構(gòu)建韋恩圖,得到黃芪改善胃癌預(yù)后的27個(gè)差異表達(dá)基因,見圖3。

    2.4??GO富集分析

    GO富集結(jié)果顯示,黃芪改善胃癌預(yù)后的27個(gè)關(guān)鍵基因主要富集在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)和細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程、基底質(zhì)膜和細(xì)胞基質(zhì)等細(xì)胞成分、G蛋白耦聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性和乙酰膽堿受體活性等分子功能,見圖4。

    2.5??PPI網(wǎng)絡(luò)

    STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),得到17個(gè)節(jié)點(diǎn),74條邊,圖中紅色及黃色節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵基因,見圖5。

    2.6??生存分析及HPA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

    在10個(gè)關(guān)鍵基因中,微囊蛋白1(caveolin?1,CAV1)、前列腺素E2受體EP3亞型(prostaglandin?E2?receptor?EP3?subtype,PTGER3)與胃癌患者的生存顯著相關(guān)(P<0.05),CAV1、PTGER3高表達(dá)的胃癌患者生存率均顯著低于低表達(dá)患者,見圖6。驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE54129表明,CAV1、PTGER3在腫瘤組織中高表達(dá)(P<0.05),見圖7。

    2.7??分子對(duì)接

    PDB數(shù)據(jù)庫(kù)暫未收錄CAV1蛋白,無(wú)法進(jìn)行分子對(duì)接,下載PTGER3蛋白(PDB?ID:6AK3)與黃芪的主要活性成分(Degree前5)進(jìn)行分子對(duì)接,見表1。其中槲皮素與山奈酚為主要作用于PTGER3的活性成分,與靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能均小于–5.0kcal/mol,表明配體分子均可與受體蛋白較好地結(jié)合。

    3??討論

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣存內(nèi),邪不可干”,胃癌的發(fā)生主要取決于正氣的盛衰。黃芪為補(bǔ)藥之長(zhǎng),在《神農(nóng)本草經(jīng)》中位列上品。研究表明,黃芪可提高人體免疫力[7]。黃芪作為單味中藥或配伍用藥在抗胃癌中應(yīng)用廣泛,但其存在有效成分、作用靶點(diǎn)、潛在機(jī)制不明確等問題,給臨床使用帶來一定困惑。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展為揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制提供新策略[8]。本研究通過收集胃癌的差異表達(dá)基因得到疾病靶點(diǎn),并構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),最后通過分子對(duì)接,HPA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多手段驗(yàn)證,為黃芪治療胃癌的作用機(jī)制提供新的見解。

    本研究發(fā)現(xiàn),槲皮素、山奈酚是黃芪改善胃癌預(yù)后的主要有效成分,該結(jié)果與黃芪指紋圖譜測(cè)定結(jié)果一致[9-10]。槲皮素和山奈酚均為黃酮類化合物,對(duì)腫瘤具有較好的抑制作用[11-12]。槲皮素能夠通過調(diào)控CAV1蛋白的表達(dá)有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。此外,槲皮素可通過抑制c-Jun/ATF2/Bcl-xL途徑增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)胃癌的凋亡誘導(dǎo)活性[14]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn),槲皮素通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡[15]。山奈酚通過上調(diào)P53基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并抑制PARP1基因和PARP1蛋白的表達(dá),造成DNA損傷,從而抑制胃癌細(xì)胞增殖[16-17]。槲皮素、山奈酚可作為黃芪治療胃癌的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

    GO富集結(jié)果顯示,黃芪改善胃癌患者預(yù)后的27個(gè)關(guān)鍵基因主要與細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)節(jié)、活性氧(reactive?oxygen?species,ROS)代謝過程有關(guān)。氧化應(yīng)激與腫瘤的關(guān)系非常復(fù)雜,ROS刺激腫瘤形成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/增殖,但高水平的ROS具有細(xì)胞毒性,可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。研究表明,黃芪可通過清除自由基抑制氧化應(yīng)激,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制增生[19-20]。

    本研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗新生血管生成的潛在作用[21]。CAV1是一種膜蛋白,在肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、肺癌等多個(gè)瘤種中高表達(dá),其可通過糖酵解、線粒體生物能量學(xué)、谷氨酰胺分解、脂肪酸代謝和自噬等參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22-23]。CAV1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮復(fù)雜的作用。胃癌早期,CAV1在胃上皮細(xì)胞的表達(dá)呈進(jìn)行性下降,而在胃癌晚期,CAV1表達(dá)上調(diào),并與胃癌不良預(yù)后呈正相關(guān)[24-25]。生存分析發(fā)現(xiàn),CAV1高表達(dá)提示預(yù)后不佳。研究還發(fā)現(xiàn)黃芪活性成分可逆轉(zhuǎn)si-CAV1對(duì)CAV1蛋白的抑制[26]。PTGER3是前列腺素E2作用的4種受體之一,對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成具有促進(jìn)作用[27]。研究表明PTGER3表達(dá)上調(diào)可能參與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展,且其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良[28]。張林等[29]發(fā)現(xiàn),黃芪主要活性成分槲皮素治療胃癌的主要靶點(diǎn)為PTGER3。分子對(duì)接結(jié)果表明,黃芪中主要活性成分能較好地與PTGER3結(jié)合。

    綜上,黃芪在改善胃癌患者生存預(yù)后中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制可能與CAV1、PTGER3等靶點(diǎn)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗新生血管生成有關(guān)。

    [參考文獻(xiàn)][1] SMYTH?E?C,?NILSSON?M,?GRABSCH?H?I,?et?al.?Gastric?cancer[J].?Lancet,?2020,?396(10251):?635–648.

    [17] 王麗君,?戴志升.?山奈酚對(duì)胃癌細(xì)胞PARP1以及P53基因表達(dá)的影響研究[J].?基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),?2020,?39(03):?1270–1274.

    猜你喜歡
    生存分析黃芪胃癌
    Huangqi decoction (黃芪湯) attenuates renal interstitial fibrosis via transforming growth factor-β1/mitogen-activated protein kinase signaling pathways in 5/6 nephrectomy mice
    “補(bǔ)氣之王”黃芪,你吃對(duì)了嗎?
    黃芪是個(gè)寶
    海峽姐妹(2019年3期)2019-06-18 10:37:30
    制造業(yè)出口貿(mào)易生存分析與跨國(guó)比較探討
    乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭死因與HBV抗原變異相關(guān)性的探討
    P53及Ki67在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義
    胃癌組織中LKB1和VEGF-C的表達(dá)及其意義
    醫(yī)學(xué)中生存分析的多結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)比例模型的實(shí)踐應(yīng)用
    原發(fā)性肺癌患者術(shù)后生存分析及影響因素評(píng)估
    胃癌組織中VEGF和ILK的表達(dá)及意義
    亚洲欧美精品自产自拍| 97在线人人人人妻| 国产精品嫩草影院av在线观看| svipshipincom国产片| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美日韩福利视频一区二区| 高清av免费在线| 人人澡人人妻人| 人人澡人人妻人| 一区二区三区乱码不卡18| 免费黄色在线免费观看| 免费日韩欧美在线观看| 秋霞在线观看毛片| 老熟女久久久| 国产精品久久久av美女十八| 欧美变态另类bdsm刘玥| 丝瓜视频免费看黄片| 美国免费a级毛片| 国产片内射在线| 国产国语露脸激情在线看| 热99久久久久精品小说推荐| 晚上一个人看的免费电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 超碰成人久久| 99九九在线精品视频| 婷婷色综合www| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲三区欧美一区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av卡一久久| 久久热在线av| 国产激情久久老熟女| 精品国产乱码久久久久久小说| 99热国产这里只有精品6| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 免费av中文字幕在线| 国产亚洲最大av| 中文字幕色久视频| 国产国语露脸激情在线看| 一区二区三区精品91| 亚洲七黄色美女视频| 深夜精品福利| 久久久欧美国产精品| 国产成人系列免费观看| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产av新网站| 18在线观看网站| 一区在线观看完整版| 国产成人91sexporn| 中文欧美无线码| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 色94色欧美一区二区| 天天添夜夜摸| 伦理电影大哥的女人| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品人人爽人人爽视色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜福利一区二区在线看| 精品亚洲成国产av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 少妇 在线观看| 黄色 视频免费看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 搡老岳熟女国产| av.在线天堂| 久久久久视频综合| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜精品国产一区二区电影| 国产免费又黄又爽又色| 久久狼人影院| 日韩一区二区视频免费看| 久久人妻熟女aⅴ| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩一区二区三区影片| 免费少妇av软件| 黄色视频不卡| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲成人av在线免费| 99热国产这里只有精品6| 久久韩国三级中文字幕| 欧美97在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 电影成人av| 满18在线观看网站| 久久人妻熟女aⅴ| 看非洲黑人一级黄片| 国产1区2区3区精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品免费大片| 老汉色∧v一级毛片| 在线天堂中文资源库| 国产 一区精品| 精品午夜福利在线看| 色婷婷av一区二区三区视频| 丰满乱子伦码专区| av在线播放精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 波野结衣二区三区在线| 日韩av免费高清视频| 欧美日韩av久久| 久久天堂一区二区三区四区| 成人国产麻豆网| 国产成人免费无遮挡视频| a级毛片黄视频| 亚洲综合精品二区| 99久国产av精品国产电影| 国产片特级美女逼逼视频| avwww免费| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 精品久久久久久电影网| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | bbb黄色大片| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产极品天堂在线| 久久韩国三级中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 高清在线视频一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品女同一区二区软件| 国产成人系列免费观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 免费黄网站久久成人精品| 日韩电影二区| 久久久久精品人妻al黑| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久国产一级毛片高清牌| 搡老乐熟女国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品久久久久成人av| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产 精品1| 亚洲久久久国产精品| 精品久久久久久电影网| 青春草国产在线视频| 看十八女毛片水多多多| 男女国产视频网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美精品一区二区大全| 国产成人免费无遮挡视频| 国产色婷婷99| 免费在线观看黄色视频的| 无限看片的www在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲免费av在线视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品免费视频内射| 久久天堂一区二区三区四区| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 色视频在线一区二区三区| 丝袜美足系列| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| a级片在线免费高清观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品国产国语对白av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 美女主播在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 精品酒店卫生间| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 韩国av在线不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产一区二区 视频在线| 久久精品国产a三级三级三级| 天天操日日干夜夜撸| 国产99久久九九免费精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久性视频一级片| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲,欧美精品.| 一区二区av电影网| 亚洲成人一二三区av| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品成人在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品av久久久久免费| 一级毛片电影观看| 午夜影院在线不卡| 成人国产麻豆网| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 我的亚洲天堂| 久久久精品免费免费高清| 操出白浆在线播放| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲精品乱久久久久久| 悠悠久久av| 国产福利在线免费观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 精品久久蜜臀av无| 自线自在国产av| 人成视频在线观看免费观看| 国产在视频线精品| 久久鲁丝午夜福利片| 在线观看三级黄色| 国产乱人偷精品视频| 久久99精品国语久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲情色 制服丝袜| 搡老岳熟女国产| av福利片在线| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 99久久综合免费| 另类亚洲欧美激情| 日韩制服骚丝袜av| 晚上一个人看的免费电影| 电影成人av| 99九九在线精品视频| 国产毛片在线视频| √禁漫天堂资源中文www| 九九爱精品视频在线观看| a级毛片在线看网站| 精品国产国语对白av| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕亚洲精品专区| 久久精品亚洲av国产电影网| 九色亚洲精品在线播放| 久久99一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 黄片小视频在线播放| 99精品久久久久人妻精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲五月色婷婷综合| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品.久久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 高清av免费在线| 9191精品国产免费久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成年美女黄网站色视频大全免费| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲 欧美一区二区三区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 自线自在国产av| 亚洲,欧美,日韩| 波多野结衣一区麻豆| 无限看片的www在线观看| 国产欧美亚洲国产| 久久久久久久精品精品| 男女床上黄色一级片免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品久久久av美女十八| 成人国产av品久久久| 麻豆av在线久日| 婷婷色综合www| 美女高潮到喷水免费观看| 成人影院久久| av视频免费观看在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久久久久国产电影| av福利片在线| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品视频女| 日本欧美国产在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 丰满少妇做爰视频| 看免费成人av毛片| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 中国三级夫妇交换| 国产野战对白在线观看| 性少妇av在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品一国产av| 在线观看www视频免费| 日韩一本色道免费dvd| 无限看片的www在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 尾随美女入室| 亚洲av福利一区| 悠悠久久av| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费高清在线观看视频在线观看| 99热网站在线观看| 在现免费观看毛片| 丝瓜视频免费看黄片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲av福利一区| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品.久久久| 99香蕉大伊视频| 色视频在线一区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 男女床上黄色一级片免费看| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费观看人在逋| 免费不卡黄色视频| av女优亚洲男人天堂| avwww免费| 国产福利在线免费观看视频| 国产精品三级大全| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲综合精品二区| 日日啪夜夜爽| 蜜桃在线观看..| 日韩av不卡免费在线播放| 天美传媒精品一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 人体艺术视频欧美日本| 午夜老司机福利片| 精品少妇内射三级| 日本91视频免费播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 在线精品无人区一区二区三| 久久久久久久精品精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费观看性生交大片5| 国产精品二区激情视频| av国产精品久久久久影院| 亚洲成人国产一区在线观看 | 无限看片的www在线观看| 大陆偷拍与自拍| 午夜91福利影院| 亚洲av电影在线进入| 嫩草影院入口| 亚洲欧美成人精品一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久精品国产综合久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩精品有码人妻一区| 99九九在线精品视频| 日韩电影二区| 免费在线观看黄色视频的| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品一国产av| 国产成人a∨麻豆精品| 国产不卡av网站在线观看| 香蕉国产在线看| 狂野欧美激情性bbbbbb| videosex国产| 激情五月婷婷亚洲| 丝瓜视频免费看黄片| 中文欧美无线码| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产高清不卡午夜福利| 久久综合国产亚洲精品| tube8黄色片| 男人操女人黄网站| a级毛片黄视频| 亚洲,欧美,日韩| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久久久人人人人人| 高清黄色对白视频在线免费看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品久久久久久电影网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人精品福利久久| 黄色怎么调成土黄色| 两个人免费观看高清视频| 99热网站在线观看| 黄色 视频免费看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 好男人视频免费观看在线| 日韩电影二区| 国产一区二区在线观看av| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 午夜福利,免费看| 成人黄色视频免费在线看| 人妻人人澡人人爽人人| avwww免费| 91aial.com中文字幕在线观看| 国精品久久久久久国模美| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲精品成人av观看孕妇| 宅男免费午夜| 久久这里只有精品19| 日韩 亚洲 欧美在线| 十八禁网站网址无遮挡| 精品午夜福利在线看| 另类精品久久| 亚洲av日韩在线播放| 9色porny在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 精品国产乱码久久久久久小说| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲成人国产一区在线观看 | 伊人久久国产一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品第二区| 男女下面插进去视频免费观看| 99久久综合免费| 深夜精品福利| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩视频精品一区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人精品无人区| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产免费现黄频在线看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 成人免费观看视频高清| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲av综合色区一区| 老司机影院毛片| 在线观看国产h片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 赤兔流量卡办理| 桃花免费在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 制服人妻中文乱码| 嫩草影视91久久| 又大又爽又粗| 大片免费播放器 马上看| 成年动漫av网址| 日本午夜av视频| av不卡在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 性少妇av在线| 少妇 在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产极品粉嫩免费观看在线| 激情视频va一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 飞空精品影院首页| 大香蕉久久网| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品,欧美精品| 9热在线视频观看99| 黄频高清免费视频| 丝袜美足系列| 欧美人与善性xxx| av网站在线播放免费| 晚上一个人看的免费电影| 久久久亚洲精品成人影院| 国产在视频线精品| 熟女av电影| 色婷婷av一区二区三区视频| 不卡av一区二区三区| 国产av精品麻豆| 午夜免费鲁丝| h视频一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 成年美女黄网站色视频大全免费| 天堂8中文在线网| 日韩视频在线欧美| 亚洲天堂av无毛| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天天操日日干夜夜撸| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品三级大全| 久久婷婷青草| 午夜久久久在线观看| 韩国精品一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 好男人视频免费观看在线| 90打野战视频偷拍视频| 国产成人免费无遮挡视频| 宅男免费午夜| 久久久精品94久久精品| 国产精品久久久av美女十八| e午夜精品久久久久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 婷婷色麻豆天堂久久| 老司机深夜福利视频在线观看 | 天堂8中文在线网| h视频一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲精品日本国产第一区| 美女高潮到喷水免费观看| 青青草视频在线视频观看| 激情视频va一区二区三区| 满18在线观看网站| av国产精品久久久久影院| 精品一区二区三卡| 人人妻人人澡人人看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 男女免费视频国产| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 国产 一区精品| 自线自在国产av| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲专区中文字幕在线 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 色网站视频免费| 丁香六月欧美| 久久亚洲国产成人精品v| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品一国产av| 日韩 亚洲 欧美在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 久热爱精品视频在线9| 视频在线观看一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产有黄有色有爽视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产在线视频一区二区| 天美传媒精品一区二区| av视频免费观看在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产成人欧美| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 99热全是精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 国产福利在线免费观看视频| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人精品久久二区二区91 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产极品天堂在线| 国产亚洲一区二区精品| 中文欧美无线码| 国产亚洲一区二区精品| 青草久久国产| 韩国高清视频一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 婷婷色av中文字幕| 制服诱惑二区| 亚洲专区中文字幕在线 | 久久精品国产a三级三级三级| videos熟女内射| 少妇人妻久久综合中文| 极品少妇高潮喷水抽搐| 99久久精品国产亚洲精品| 十八禁高潮呻吟视频| 99热网站在线观看| 精品亚洲成国产av| 一本色道久久久久久精品综合| 精品亚洲成国产av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日本欧美视频一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产又爽黄色视频| 国产亚洲欧美精品永久| 男人添女人高潮全过程视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美在线黄色| 久久ye,这里只有精品| 亚洲,欧美精品.| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久av网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产毛片在线视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 黑人猛操日本美女一级片| 男女床上黄色一级片免费看| 国产1区2区3区精品| 成人免费观看视频高清| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 一区二区三区精品91| 日韩一区二区三区影片| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产男人的电影天堂91| av视频免费观看在线观看| 两个人看的免费小视频| 久久久久久久久久久免费av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产国语露脸激情在线看|