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      基于生物信息學(xué)及分子對(duì)接研究天牛止眩膠囊治療原發(fā)性高血壓的潛在活性成分及分子機(jī)制

      2023-07-04 13:08:42蔡子杰姚昆鵬蔡虎志陳新宇
      中國現(xiàn)代醫(yī)生 2023年16期
      關(guān)鍵詞:分子機(jī)制分子對(duì)接生物信息學(xué)

      蔡子杰 姚昆鵬 蔡虎志 陳新宇

      [摘要]?目的?利用生物信息學(xué)及分子對(duì)接,探討天牛止眩膠囊治療原發(fā)性高血壓(essential?hypertension,EH)的潛在活性成分及分子機(jī)制。方法?利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)、BATMAN-TCM平臺(tái)篩選天牛止眩膠囊的活性成分及藥物靶點(diǎn),使用GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank檢索EH的疾病相關(guān)靶點(diǎn),采用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建“藥物–成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,應(yīng)用STRING平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用分析,使用R軟件包進(jìn)行基因本體論(gene?ontology,GO)與京都基因與基因組百科全書(Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes,KEGG)富集分析,運(yùn)用AutoDockTools及AutoDock?Vina進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證,使用PyMol軟件進(jìn)行可視化分析。結(jié)果?共篩選出天牛止眩膠囊有效成分53種,涉及相關(guān)靶點(diǎn)基因422個(gè)。篩選出關(guān)鍵活性化合物217個(gè),拓?fù)浞治龅贸龊诵陌悬c(diǎn)蛋白AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN等10個(gè),GO及KEGG富集分析結(jié)果提示天牛止眩膠囊干預(yù)EH主要涉及細(xì)胞對(duì)外的刺激、對(duì)活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)途徑與涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示FOS與槲皮素及山柰酚結(jié)合力最強(qiáng)。結(jié)論?天牛止眩膠囊中的槲皮素、山柰酚等多種關(guān)鍵活性成分可作用于FOS、JUN、AKT等多個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白,發(fā)揮調(diào)控血壓、降低心腦血管并發(fā)癥危險(xiǎn)等級(jí)、保護(hù)靶器官的作用。

      [關(guān)鍵詞]?天牛止眩膠囊;原發(fā)性高血壓;生物信息學(xué);分子對(duì)接;分子機(jī)制

      [中圖分類號(hào)]?R255.3;R256.2??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.009

      The?potential?active?ingredients?and?molecular?mechanism?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?treatment?of?essential?hypertension?based?on?bioinformatics?and?molecular?docking

      CAI?Zijie1,?YAO?Kunpeng1,?CAI?Huzhi2,?CHEN?Xinyu1,2

      1.Graduate?School?of?Hunan?University?of?Chinese?Medicine,?Changsha?410208,?Hunan,?China;?2.Department?of?Cardiovascular?Medicine,?the?First?Hospital?of?Hunan?University?of?Chinese?Medicine,?Changsha?410007,?Hunan,?China

      [Abstract]?Objective?The?potential?active?ingredients?and?molecular?mechanism?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?treating?essential?hypertension?(EH)?were?studied?based?on?bioinformatics?and?molecular?docking.?Methods?Traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform?and?BATMAN-TCM?datebase?were?used?to?screen?active?ingredients?and?drug?targets?of?Tianniu?Zhixuan?capsule.?GeneCards,?PharmGkb,?TTD?and?DrugBank?were?used?to?search?disease-related?targets?of?EH.?The?“drug-composition-target”?network?map?was?constructed?using?Cytoscape3.8.0?software.?STRING?platform?was?used?for?protein-protein?interaction?analysis,?R?software?package?was?used?for?gene?ontology?(GO)?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?(KEGG)?enrichment?analysis,?AutoDockTools?and?AutoDock?Vina?were?used?for?molecular?docking?verification,?PyMol?software?was?used?for?visual?analysis.?Results?A?total?of?53?effective?ingredients?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?were?screened,?involving?422?related?target?genes.?A?total?of?217?key?active?compounds?were?screened,?and?10?core?target?proteins?were?identified?by?topological?analysis,?including?AKT1,?MAPK8,?NFKB1,?FOS,?MAPK1,?JUN,?etc.?GO?and?KEGG?enrichment?analysis?indicated?that?the?intervention?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?EH?mainly?involved?various?biological?pathways?such?as?external?cell?stimulation,?response?to?activated?oxygen,?oxidative?stress?and?other?biological?pathways,?as?well?as?lipid?and?atherosclerosis,?fluid?shear?stress?and?atherosclerosis?and?other?related?pathways.?Molecular?docking?results?showed?that?FOS?had?the?strongest?binding?force?with?quercetin?and?kaempferol.?Conclusion?Quercetin,?kaempferol?and?other?key?active?ingredients?in?Tianniu?Zhixuan?capsule?can?act?on?FOS,?JUN,?AKT?and?other?core?target?proteins,?and?play?a?role?in?regulating?blood?pressure,?reducing?the?risk?level?of?cardiovascular?and?cerebrovascular?complications?and?protecting?target?organs.

      [Key?words]?Tianniu?Zhixuan?capsule;?Essential?hypertension;?Bioinformatics;?Molecular?docking;?Molecular?mechanism

      當(dāng)前,高血壓仍是全球疾病負(fù)擔(dān)較重的疾病之一,也是我國面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。由于經(jīng)濟(jì)及社會(huì)醫(yī)療資源分配的不均衡,中國高血壓人群的血壓控制不甚理想。中醫(yī)藥對(duì)控制血壓、保護(hù)靶器官、提高患者遠(yuǎn)期生存率、延緩心腦血管疾病進(jìn)展具有重要意義[3]。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制天牛止眩膠囊(原名血壓平膠囊)用于治療原發(fā)性高血壓(essential?hypertension,EH),可降低血壓,逆轉(zhuǎn)血管重塑,保護(hù)靶器官,改善心室重構(gòu)和胰島素抵抗,延緩左心室肥厚[4-6]。本文旨在利用生物信息學(xué)技術(shù)及分子對(duì)接方法,探討天牛止眩膠囊治療EH的作用機(jī)制,為后續(xù)課題組的進(jìn)一步驗(yàn)證提供思路。

      1??材料與方法

      1.1??有效成分篩選及作用靶標(biāo)預(yù)測

      天牛止眩膠囊由漢防己、牛膝、菊花、酸棗仁、天麻組成。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform,TCMSP)檢索漢防己、牛膝、菊花、酸棗仁的有效成分及相應(yīng)靶點(diǎn),篩選條件:生物利用度≥30%和類藥性≥0.18;在BATMAN-TCM平臺(tái)檢索天麻的有效成分及相應(yīng)靶點(diǎn),篩選條件:校正P<0.05及分?jǐn)?shù)截?cái)嘀怠?0。使用UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化天牛止眩膠囊有效成分靶點(diǎn)。

      1.2??疾病靶點(diǎn)的收集

      使用“essential?hypertension”作為關(guān)鍵詞,檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫,獲得EH的疾病靶點(diǎn)基因。篩選并合并上述基因庫中與EH相關(guān)基因,剔除重復(fù)基因。

      1.3??藥物-疾病核心作用基因篩選

      將天牛止眩膠囊的藥物靶點(diǎn)基因與EH疾病靶點(diǎn)基因映射,并繪制韋恩圖。借助Cytoscape3.8.0軟件,導(dǎo)入藥物靶點(diǎn)–疾病靶點(diǎn)映射交集文件,構(gòu)建“藥物–成分–靶點(diǎn)”圖。

      1.4??靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?/p>

      將獲得的交集靶基因?qū)隨TRING平臺(tái),設(shè)置物種為人類,最低互動(dòng)得分≥0.9,獲得蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein?interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,并刪除游離節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析,使用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?,?jì)算各節(jié)點(diǎn)度值,獲取核心靶點(diǎn)基因。

      1.5??富集分析

      利用R軟件包對(duì)交集基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes,KEGG)通路與基因本體論(gene?ontology,GO)富集分析。

      1.6??分子對(duì)接

      選擇藥物–成分–靶點(diǎn)中排名前2的活性化合物作為小分子配體,在PubChem?CID數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu),于Uniprot數(shù)據(jù)庫中查詢關(guān)鍵靶點(diǎn)信息,在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu),利用PyMOL軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子。使用AutoDockTools1.5.7軟件將晶體結(jié)構(gòu)加氫、加電荷。使用AutoDock?Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,計(jì)算最低結(jié)合能,使用PyMol軟件處理和可視化分子對(duì)接結(jié)果。

      2??結(jié)果

      2.1??活性成分篩選及作用靶標(biāo)預(yù)測

      于TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到40種化合物。其中防己3種、牛膝20種、菊花8種、酸棗仁9種。使用BATMAN-TCM平臺(tái)進(jìn)行補(bǔ)充,得到天麻相關(guān)化合物13種。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),通過匹配并篩選去除重復(fù)值,獲得422個(gè)靶點(diǎn)。

      2.2??疾病靶點(diǎn)的收集及藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集

      檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫,分別得到EH靶點(diǎn)2781、57、72、112、76個(gè),篩選并去除重復(fù)值后得到靶點(diǎn)2872個(gè),見圖1。藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)有217個(gè)交集,見圖2。

      2.3??篩選藥物-疾病核心作用基因

      將天牛止眩膠囊的預(yù)測靶點(diǎn)與EH的相關(guān)靶點(diǎn)取交集,再導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建“藥物–成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。圖中共計(jì)256個(gè)節(jié)點(diǎn),467條邊。天牛止眩膠囊中有效成分槲皮素、山柰酚、棕櫚酸、漢黃芩素、β-谷甾醇分別與101、39、33、31、24個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)。PTSG1(18個(gè))是有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量最多的基因,其次是PTGS2(17個(gè))、AR(16個(gè))和PGR(16個(gè))。

      2.4??PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?/p>

      將篩選的天牛止眩膠囊與EH的217個(gè)共同靶點(diǎn)提交至STRING平臺(tái),構(gòu)建天牛止眩膠囊干預(yù)EH的PPI網(wǎng)絡(luò),見圖4。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)圖中有162個(gè)節(jié)點(diǎn),633條邊。使用CytoNCA功能進(jìn)行拓?fù)浞治?,?duì)基因相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行篩選,得到13個(gè)核心基因。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示,核心基因前10位分別為TNF、EGFR、AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、TP53、ESR1、MAPK1、JUN,見圖5。

      注:右側(cè)黃色代表作用靶點(diǎn),左側(cè)圓圈代表藥物有效成分,淡紫色代表天麻有效成分,淡紅色代表酸棗仁有效成分,天藍(lán)色代表牛膝有效成分,墨藍(lán)色代表防己有效成分,深紫色代表菊花有效成分,淡粉色代表防己與牛膝共有有效成分,淡綠色代表菊花與牛膝共有有效成分,深綠色代表天麻與菊花有效成分

      2.5??富集分析

      將天牛止眩膠囊的217個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析,得到2778個(gè)GO富集條目,包括生物過程2440個(gè)、細(xì)胞組分103種和分子功能235種,得到195條KEGG通路。各選取生物過程、細(xì)胞組分、分子功能排名前10的GO條目繪制柱狀圖,選取KEGG通路前30的條目繪制氣泡圖,見圖6。

      A.FOS與槲皮素結(jié)合模式圖;B.FOS與山柰酚結(jié)合模式圖;C.JUN與槲皮素結(jié)合模式圖;D.JUN與山柰酚結(jié)合模式圖;E.AKT與槲皮素結(jié)合模式圖;F.AKT與山柰酚結(jié)合模式圖

      2.6??分子對(duì)接

      選取“藥物–成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中與靶點(diǎn)互動(dòng)關(guān)系密切程度居前的2個(gè)活性化合物(槲皮素、山柰酚)作為小分子配體。篩選2次拓?fù)浞治龊螳@得的前10核心靶點(diǎn)蛋白,選擇與活性成分有關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)蛋白(AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN),使用AutoDock?Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,并計(jì)算各個(gè)蛋白與小分子配體間的最低結(jié)合能,見表1。利用PyMol軟件數(shù)據(jù)庫可視化分析對(duì)接效果最好的6對(duì)分子–靶點(diǎn)模式圖,見圖7。

      3??討論

      根據(jù)高血壓病的發(fā)病癥狀,中醫(yī)將EH歸為眩暈、頭痛等范疇[7]。歷代醫(yī)家多認(rèn)為“諸風(fēng)掉眩,皆屬于肝”,從肝風(fēng)、肝陽角度論治高血壓病成為主流。其病機(jī)為肝陽上亢、痰飲內(nèi)停、腎陰虧虛,常夾雜發(fā)病。多治以平肝潛陽、化痰息風(fēng)、健脾祛濕、滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)陰填精法[3]。高血壓病責(zé)之在肝,其次為心、腎。肝體陰而用陽,賴陰血以滋養(yǎng),故肝陰不足,陽則易亢。另肝主疏泄,司條達(dá),疏泄失常,致肝郁氣滯、郁而化熱、耗傷陰血,可致肝陰虧虛、肝陽上亢或肝火熾盛。肝藏血,心主血,肝陰血不足,可致心火亢盛,心火亢盛可耗傷肝陰。腎藏精,肝陰虧損,下竭腎陰,水不涵木,肝陽亢盛。天牛止眩膠囊重在治肝,兼顧心、腎,共奏養(yǎng)肝柔肝、平肝潛陽、利尿定眩之效。

      前期研究發(fā)現(xiàn),天牛止眩膠囊可通過下調(diào)心肌組織Toll樣受體(Toll-like?receptor,TLR)2、TLR4、MyD88蛋白的表達(dá),從而抑制核因子κB(nuclear?factor-κB,NF-κB)活化,達(dá)到降血壓、改善高血壓所致的靶器官損傷、心室重構(gòu)等作用[6]。天牛止眩膠囊可改善EH患者的胰島素抵抗,減少EH患者的危險(xiǎn)因素,降低其危險(xiǎn)分層[4-5]?,F(xiàn)代藥理研究顯示,天麻素通過一氧化氮(nitric?oxide,NO)/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble?guanylate?cyclase,sGC)/環(huán)磷酸鳥苷(cyclic?guanosine?monophosphate,cGMP)介導(dǎo)的途徑參與內(nèi)皮依賴性舒張[8]。酸棗仁皂苷通過內(nèi)皮細(xì)胞通道增加Ca2+內(nèi)流誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial?nitric?oxide?synthase,eNOS)激活,并通過打開內(nèi)皮細(xì)胞BKCa和KATP通道誘導(dǎo)超極化降低血管張力、保護(hù)內(nèi)皮功能[9]。菊花的主要提取物黃酮類化合物可調(diào)節(jié)腸道菌群,抑制腸源性脂多糖/TLR4通路的激活,改善血管內(nèi)皮功能,起到降壓作用[10]。漢防己中所含的粉防己堿可通過抑制HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性、活性氧生成和谷胱甘肽耗竭,有效緩解氧化損傷,改善氧化應(yīng)激[11]。懷牛膝可通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激活eNOS,增加NO的產(chǎn)生,舒張血管[12]。另外,懷牛膝可下調(diào)巨噬細(xì)胞中的NF-κB和活化蛋白-1(activating?protein-1,AP-1)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible?nitric?oxide?synthase,iNOS)、環(huán)氧合酶2、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6和IL-1β表達(dá),發(fā)揮抗炎作用[13]。

      筆者采用生物信息學(xué)技術(shù)及分子對(duì)接方法,對(duì)天牛止眩膠囊治療EH進(jìn)行分子機(jī)制方面的探討。初步篩選出天牛止眩膠囊調(diào)控EH的主要活性成分為槲皮素、山柰酚。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),舒張血管平滑肌,改善血管內(nèi)皮功能障礙,起到調(diào)節(jié)血壓的作用[14]。其機(jī)制可能與槲皮素可顯著抑制NO、iNOS、IL-6、NF-κB的核易位、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和c-Jun?N末端激酶的產(chǎn)生有關(guān)[15]。槲皮素還可抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[16]。研究證實(shí)山柰酚有利尿和腎臟保護(hù)作用;山柰酚可通過NO/cGMP/cGMP依賴性蛋白激酶途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管松弛[17]。分子對(duì)接結(jié)果證實(shí),槲皮素、山柰酚等活性成分能以疏水鍵、氫鍵與核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接結(jié)合,且結(jié)合強(qiáng)度較高。

      天牛止眩膠囊調(diào)控EH的主要靶點(diǎn)與炎癥應(yīng)答、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞凋亡、血管重塑等有關(guān),涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、松弛素等多條信號(hào)通路。研究表明,上述通路廣泛參與高血壓的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫介導(dǎo)和血管內(nèi)皮功能障礙,并與內(nèi)皮損傷介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓導(dǎo)致的心室重構(gòu)及心肌纖維化有關(guān)[18-21]。

      本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,分析天牛止眩膠囊調(diào)控EH的機(jī)制。結(jié)果表明天牛止眩膠囊體現(xiàn)多通路、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用調(diào)控血壓的特點(diǎn),分子對(duì)接方法驗(yàn)證結(jié)果符合預(yù)期。

      [參考文獻(xiàn)][1] POULTER?N?R,?PRABHAKARAN?D,?CAULFIELD?M.?Hypertension[J].?Lancet,?2015,?386(9995):?801–812.

      [11] WANG?L,?CI?X,?LV?H,?et?al.?Isotetrandrine?ameliorates?tert-butyl?hydroperoxide-induced?oxidative?stress?through?upregulation?of?heme?oxygenase-1?expression[J].?Exp?Biol?Med?(Maywood),?2016,?241(14):?1568–1576.

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