廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及質(zhì)量評價

向燕芬 鄧桂珠 甘國興 盧泳 龍國斌 朱衛(wèi)星

【摘 要】 目的：制備廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑并評價其質(zhì)量。方法：收集10批廣東紫珠藥材制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測定標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH和出膏率，建立標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜并采用化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)行評價。結(jié)果：10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH為4.4～5.3，出膏率為11.9%～26.1% ，指紋圖譜有10個共有峰，且10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.90。結(jié)論：制備的廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有一定的代表性，建立的指紋圖譜方法可行。

【關(guān)鍵詞】 廣東紫珠；標(biāo)準(zhǔn)湯劑；指紋圖譜

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）02-0024-05

Preparation and Quality Evaluation of Standard Decoction of Callicarpa Kwangtungensis

XIANG Yanfen1，2 DENG Guizhu1，2 GAN Guoxing1，2* LU Yong1，2 LONG Guobin1，2 ZHU Weixing1，2

1.Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qingyuan 511500，China;

2.Engineering Technology Research Center of Fresh Medicine and National Medicine

of Guangdong Province， Qingyuan 511500，China

Abstract：Objective To prepare standard decoction of Callicarpa kwangtungensis and evaluate its quality.Method 10 batches of Callicarpa kwangtungensis were collected and prepared for standard decoctions.The pH and extraction rate were determined.The standard decoction fingerprint was established with HPLC and evaluated with chemo-metrics method. Result The pH in 10 batches of Callicarpa kwangtungensis standard decoction were from 4.4 to 5.3，the extraction rates were from 11.9% to 26.1%.10 peaks were identified in the HPLC fingerprint，and the similarity was higher than 0.90 between the fingerprints of 10 batches of standard decoction and the control finger-print.Conclusion The Callicarpa kwangtungensis standard decoction was represent-ative，and the fingerprint method was feasible.

Keywords：Callicarpa Kwangtungensis;Standard Decoction; Fingerprint

廣東紫珠是馬鞭草科植物廣東紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun.的干燥莖枝和葉，具有收斂止血、散瘀、清熱解毒的功效［1］。目前有關(guān)于廣東紫珠化學(xué)成分、藥理作用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報道［2-7］，但是沒有關(guān)于廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報道。本研究制備廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑并評價其質(zhì)量，為廣東紫珠不同的飲片用藥形式之間劑量換算提供參考，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和療效的一致性。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備 e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司），XS205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），F(xiàn)E28型pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）， RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），等。

1.2 試劑與藥材 連翹酯苷B對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，純度98.46%，批號：MUST-20111105），色譜純磷酸為上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；色譜純乙腈及分析純甲醇均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；超純水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；廣東紫珠藥材在集貿(mào)市場收集。

2 方法與結(jié)果

2.1 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 收集10批廣東紫珠藥材，參考《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》［8］的方法，分別稱取廣東紫珠藥材100 g，置于3000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取30 min，趁熱用200目篩過濾，藥渣加8倍量水，加熱回流提取20 min，趁熱用200目篩過濾，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃減壓濃縮至500 mL，即得0.2 g·mL-1的廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH測定 采用pH計測定10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH，重復(fù)3次，取平均值為廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH。10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH為4.4～5.3，平均pH為4.6。結(jié)果見表1。

2.3 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率 精密量取廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速稱定重量，計算廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率，重復(fù)3次，取平均值為廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率。10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為11.9%～26.1%，平均出膏率為21.8%。結(jié)果見表1。

2.4 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜建立及評價

2.4.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫，0～35 min，5%A，95%B；35～40 min，5%～9%A，95%～91%B；40～55 min，9%～10%A，91%～90%B；55～80 min，10%A，90%B；80～81 min，10%～11A，90%～89%B；81～91 min，11%A，89%B；91～92 min，11%～10%A，89%～90B；92～130 min，10%A，90 %B；130～131 min，10%～12%A，90 %～88%B；131～151 min，12%～13%A，88 %～87%B；151～175 min，13%～14%A，87 %～86%B；柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長332 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 取連翹酯苷B對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度54.153 μg·mL-1，過0.45 μm的微孔濾膜，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.3 供試品溶液制備 取標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 精密度試驗 取同一供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果各色譜峰相對保留時間的RSD均<1.0%，相對峰面積的RSD均<4.5%，表明儀器具有良好的精密度。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明各色譜峰相對保留時間的RSD均<1.0%，相對峰面積的RSD均<4.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗 取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品6份，按2.4.3項下方法制備供試品溶液，2.4.1項下色譜條件測定，結(jié)果各色譜峰相保留時間的RSD均<1.1%，相對峰面積的RSD均<4.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 指紋圖譜分析 將10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”（2012版），采用中位數(shù)法和多點矯正法，時間寬度0.9 min，生成相應(yīng)的對照指紋圖譜1，其中共有峰10個，通過對照品指認(rèn)出8號峰為連翹酯苷B。相似度分析結(jié)果表明，10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度均大于0.90，符合標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度要求（大于0.90）。結(jié)果見表2，如圖1。

2.4.8 指紋圖譜聚類分析（HCA） 采用 SPSS 26.0 數(shù)據(jù)分析軟件，對10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的相對峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接法，測量區(qū)間為歐氏距離，聚類結(jié)果見圖2，10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑可分為2類，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7為第1類，GD1、GD2、GD3為第2類。

2.4.9 主成分分析（PCA） 選擇10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的10個共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入 SIMCA-P＋12.0軟件進(jìn)行 PCA 處理，得分矩陣圖見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 批樣品聚為2組，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7為一組，GD1、GD2、 GD3為第2組，與 HCA 結(jié)果一致。

2.4.10 正交偏最小二乘法判別分析 （OPLS-DA） 將10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的10個共有峰的峰面積導(dǎo)入 SIMCA-P＋12.0軟件進(jìn)行OPLS-DA處理，得分矩陣圖如圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 批樣品聚為2組，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7為一組，GD1、GD2、 GD3為第2組，且與 PCA 和 HCA 結(jié)果一致。圖5中的點離原點越遠(yuǎn)，表明對應(yīng)變量（色譜峰）權(quán)重值越大，結(jié)合以變量重要性投影（VIP）值＞1 為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異組分，如圖6。結(jié)果共找到1個已知成分連翹酯苷B。

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中要求藥材樣品需具有代表性，收集的藥材樣品應(yīng)不少于10批，盡可能包括不同產(chǎn)區(qū)的藥材樣品。本研究收集廣東紫珠藥材10批，其中廣西產(chǎn)7批、廣東產(chǎn)3批，未能收集到湖南和江西產(chǎn)的藥材樣品。《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中要求采用加熱回流提取和減壓濃縮的方法制備標(biāo)注湯劑。因此，根據(jù)廣東紫珠藥材的特點，選擇浸泡時間為30 min，采用加熱回流提取，第一次加10倍量水，提取30 min，第二次加8倍量水，提取20 min，合并濾液后減壓濃縮制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價 《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中要求以pH、出膏率范圍、成分轉(zhuǎn)移率范圍、指紋圖譜或特征圖譜等指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量。本研究中，10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH為4.4～5.3，平均pH為4.6，符合《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中各批次值在均值加減3倍SD范圍的要求；出膏率為11.9%～26.1%，平均出膏率為21.8%，廣東產(chǎn)的出膏率均低于廣西的；各批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.90，符合《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中相似度不低于0.90的要求。由于在藥店和醫(yī)療機(jī)構(gòu)無法買到廣東紫珠飲片，本研究所用廣東紫珠的種植時間和存放時間均無法確定，其指標(biāo)成分含量可能存在較大差異，所得成分轉(zhuǎn)移率范圍沒有指導(dǎo)意義，因此本研究未測定廣東紫珠中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，計算其成分轉(zhuǎn)移率。

3.3 指紋圖譜條件選擇 本研究根據(jù)2020年版中國藥典第一部，考察了265 nm、254 nm和332 nm 3個檢測波長，發(fā)現(xiàn)以332 nm為波長，色譜峰數(shù)量較多，面積較大，色譜圖基線最佳。在332 nm檢測波長下，分別考察了甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水等流動相的色譜圖情況。甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水為流動相，色譜圖峰數(shù)量較少，峰形較差，基線較差，色譜峰分離度較差。乙腈-0.05%甲酸水為流動相，色譜圖峰形較好，但峰面積較大的色譜峰分離度較差。乙腈-0.1%磷酸水為流動相，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量較多，色譜峰分離度較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水為廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的流動相。

本研究參考《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》的要求制備了10批廣東紫珠藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并以pH、出膏率、指紋圖譜等為指標(biāo)進(jìn)行評價。但是由于在藥店和醫(yī)療機(jī)構(gòu)無法買到廣東紫珠飲片，本研究收集的廣東紫珠產(chǎn)地較少，也沒有測定廣東紫珠指標(biāo)性成分連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，計算化學(xué)成分轉(zhuǎn)移率，存在一定的不足。今后如果能收集到合適的廣東紫珠飲片，將進(jìn)一步補(bǔ)充完善相關(guān)研究，使結(jié)果更加科學(xué)合理。

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（收稿日期：2022-05-25 編輯：劉 斌）