大豆品種齊黃34 廣適性的遺傳分析

劉薇，王玉斌，李偉，張禮鳳，王彩潔，徐冉，戴海英，張彥威

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/山東省特色作物工程實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

大豆對(duì)光周期敏感[1-3]，這一特性直接反映在開花期、成熟期等生態(tài)適應(yīng)性相關(guān)性狀上。 具體表現(xiàn)為大豆品種在不同地區(qū)間引種會(huì)導(dǎo)致開花期和生育期改變，進(jìn)而影響產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株不能正常開花結(jié)實(shí)。 因此，大豆品種的適應(yīng)范圍非常狹窄，極大限制了品種的推廣及產(chǎn)量突破。

開花期是大豆適應(yīng)性的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)開花期調(diào)控基因的研究是大豆適應(yīng)性改良的重要切入點(diǎn)。 目前，包括E 系列基因(E1～E11)、J基因以及Tof11/12等在內(nèi)的與開花期相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)相繼被發(fā)現(xiàn)[4]。 在這些基因中，E1、E2、E3和E4基因的相互組合與大豆的開花期、生育期性狀密切相關(guān)[5-7]，其中E1對(duì)開花期及生育期的影響最大[8-11]。E1基因?yàn)槎箍谱魑锼赜校陂L(zhǎng)日下特異表達(dá)，其過量表達(dá)極顯著抑制大豆開花，是重要的開花抑制基因[12]。

齊黃34 是近年培育出的高產(chǎn)廣適大豆品種[13]，先后通過國(guó)家黃淮海北片和中片、山東省、江蘇省淮北和淮南區(qū)、貴州省審定，通過安徽省、河南省引種審批，是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部主導(dǎo)品種和主推的四大核心品種之一[14]。 該品種適應(yīng)范圍廣，適種范圍跨越了20 個(gè)緯度。 但是目前關(guān)于該品種的廣適性遺傳機(jī)理尚缺乏研究。

前期，我們利用齊黃34 和另一個(gè)黃淮海推廣品種冀豆17[15]為雜交親本衍生得到重組自交系群體，并基于此群體材料構(gòu)建了高密度遺傳圖譜[16]。 本研究利用該群體針對(duì)開花期進(jìn)行QTL 定位，以期闡明使齊黃34 適應(yīng)范圍廣的QTL 位點(diǎn)和關(guān)鍵基因，同時(shí)為齊黃34 的遺傳改良提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為齊黃34、冀豆17 及其雜交衍生的由256 個(gè)家系成員組成的重組自交系(RIL)群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表型統(tǒng)計(jì) 重組自交系群體分別在2018和2019 年6 月種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽試驗(yàn)基地，行長(zhǎng)為3 m，株距和行距分別為10 cm 和50 cm。 試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。 每行近一半的大豆植株開花時(shí)記為初花期。

齊黃34 和冀豆17 于2019 年種植于人工光照培養(yǎng)箱(溫度為26℃，12 h 光照/12 h 黑暗)進(jìn)行短日培養(yǎng)，分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)品種植株的開花時(shí)間。

1.2.2 QTL 分析 使用軟件IBM SPSS 對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。 使用QTL IciMaping V4.2 軟件[17]，利用區(qū)間作圖法(IM-ADD)進(jìn)行QTL 定位。 似然函數(shù)比值對(duì)數(shù)值(logarithm of odds，LOD)的閾值設(shè)為2.5。

1.2.3E1基因片段的克隆及序列分析 分別取齊黃34 和冀豆17 的葉片，提取RNA，并利用TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A，TAKARA)反轉(zhuǎn)錄。 以 E1 - F ( 5＇-ATGAGCAACCCTTCAGATGAAAG-3＇) 和 E1 - R ( 5＇-CTCCCTTATTGTTCATCTCCTC-3＇)為引物，利用KOD-FX 高保真酶(KFX-101，東洋紡生物科技有限公司)進(jìn)行E1部分序列的克隆。 擴(kuò)增體系:2×buffer 20 μL，2 mmol/L dNTP 8 μL，E1-F 1.5 μL，E1-R 1.5 μL，模板2 μL，KOD-FX 0.8 μL，ddH2O 4.2 μL。 擴(kuò)增程序:94℃2 min；98℃30 s，53℃30 s，68℃20 s，30 個(gè)循環(huán)；68℃5 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物直接交由擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 開花促進(jìn)基因GmFT2a實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 將齊黃34 和冀豆17 種植于人工氣候室，從出苗第4 天開始，每隔4 天取最上部葉片，迅速置于液氮中，帶回并保存在-80℃冰箱中備用。提取所有樣品的RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒TB GreenPremix Ex Taq(RR820A，TAKARA) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。GmFT2a的檢測(cè)引物為qGm-FT2a-F(5＇-TGGGGGAGTAATTGGGGATG-3＇) 和qGmFT2a - R (5＇-ACCTCATGGCCGAAACTAGC-3＇)；內(nèi)參基因的檢測(cè)引物為qGmActin-F(5＇-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3＇) 和 qGmActin - R( 5＇-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3＇)。 qRT -PCR 的反應(yīng)體系:2×TB GreenPremix Ex Taq10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。 反應(yīng)程序:95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。 利用2-ΔΔCt方法[18]進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花表型分析

表1 結(jié)果顯示，RIL 群體開花期存在較大差異，存在超高親和超低親現(xiàn)象。 2018 年RIL 群體的開花期范圍是28.0 ～57.0 d，標(biāo)準(zhǔn)誤差為7.21，峰度和偏度分別為-0.71 和0.50；2019 年RIL 群體的開花期為30.0 ～58.0 d，標(biāo)準(zhǔn)誤差為6.81，峰度和偏度分別為-0.58 和0.59。 RIL 群體兩年的開花期分布近似正態(tài)分布(圖1)，且峰度和偏度的絕對(duì)值均小于1，表明該群體可用于QTL 定位。

圖1 RIL 群體開花期表型數(shù)據(jù)頻率分布

表1 親本及RIL 群體開花期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(d)

2.2 大豆開花期性狀QTL 定位及分析

利用IM-ADD 法對(duì)開花期性狀進(jìn)行QTL 定位。 2018 年和2019 年均只檢測(cè)到1 個(gè)位于6 號(hào)染色體上的QTL。 兩個(gè)環(huán)境下該QTL 的LOD 值分別為26.81 和21.91，表型貢獻(xiàn)率分別為40.04%和33.93%。 該QTL 在兩個(gè)環(huán)境下的加性效應(yīng)均為負(fù)值，表現(xiàn)為負(fù)遺傳效應(yīng)(表2、圖2)。

圖2 不同環(huán)境下開花期相關(guān)QTL 位點(diǎn)

表2 大豆開花期QTL 定位結(jié)果

該QTL 區(qū)間內(nèi)存在36 個(gè)基因，其中13 個(gè)基因CDS 區(qū)在雙親間存在變異(表3)。 與父本冀豆17 相比，Glyma.06G206500 在齊黃34 中發(fā)生了移碼突變，其它12 個(gè)基因均發(fā)生了非同義突變。 Uniprot 數(shù)據(jù)庫注釋信息以及基因注釋分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)有兩個(gè)開花期調(diào)控相關(guān)基因，其中Glyma.06G205800(GmMDE06)是擬南芥AGL8的同源基因，Glyma.06G207800 是大豆生育期組主效基因E1。 Glyma.06G207800 在齊黃34 中是顯性E1基因型，而在冀豆17 中第44 位堿基是“C”，與參考基因組Williams 82 相同，為喪失了部分功能的e1-as基因型。

表3 QTL 位點(diǎn)中CDS 區(qū)突變基因

2.3 親本E1 基因的序列分析和開花促進(jìn)基因GmFT2a 表達(dá)量的檢測(cè)

對(duì)親本齊黃34 和冀豆17 的E1部分序列進(jìn)行克隆并測(cè)序發(fā)現(xiàn)(圖3)，齊黃34 中的E1基因編碼區(qū)第44 個(gè)核苷酸為G，與顯性E1序列完全相同；而冀豆17 的序列在第44 位堿基發(fā)生了改變，由G 變成了C，導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生了替換。 證實(shí)齊黃34 中E1確實(shí)是顯性基因型，而冀豆17 中為e1-as基因型。

圖3 齊黃34 和冀豆17 E1 部分序列比對(duì)

短日處理下，齊黃34 開花期極顯著晚于冀豆17(圖4A)。 齊黃34 和冀豆17 不同時(shí)期葉片中開花促進(jìn)基因GmFT2a表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果(圖4B)顯示，冀豆17 中GmFT2a的表達(dá)量在前期高于齊黃34，且在出苗18 天達(dá)到高峰；齊黃34 中GmFT2a的積累滯后于冀豆17，在出苗22 天達(dá)到高峰，之后表達(dá)量高于冀豆17。

圖4 冀豆17 和齊黃34 開花期比較(A)和GmFT2a 表達(dá)量(B)比較

3 討論

齊黃34 是高產(chǎn)廣適大豆品種，在黃淮海地區(qū)、長(zhǎng)江中下游地區(qū)以及貴州、廣西等低緯度地區(qū)均有較好的產(chǎn)量表現(xiàn)。 為挖掘齊黃34 開花期相關(guān)QTL，闡明其廣適性的遺傳機(jī)制，本研究以齊黃34 為母本，與大豆品種冀豆17 雜交構(gòu)建RIL 群體，并進(jìn)行了開花期性狀的QTL 定位。 由于冀豆17 開花早于齊黃34，RIL 群體在開花期表型上存在明顯的性狀分離；在2018、2019 年兩個(gè)環(huán)境中，均只檢測(cè)到了1 個(gè)QTL(qFT6)，位于6 號(hào)染色體，表型貢獻(xiàn)率最高達(dá)到40.04%。 值得注意的是，大豆生育期主效基因E1位于該QTL 區(qū)間內(nèi)。E1基因是大豆光周期響應(yīng)的核心調(diào)控因子，與開花期密切相關(guān)。 顯性E1基因過量表達(dá)將導(dǎo)致大豆開花明顯延遲，是十分重要的開花抑制基因。E1的變異類型主要包括e1-fs、e1-nl、e1-as和e1-b3a[11，12]，其中，e1-as基因型是E1基因的第44個(gè)堿基發(fā)生改變，使編碼蛋白的定位發(fā)生變化[12]。e1-as型植株開花及成熟早于E1基因型植株，也早于功能喪失型(e1-fs及e1-nl)植株。本研究證實(shí)E1在齊黃34 中為顯性，在冀豆17 中為e1-as基因型。 因此，E1基因可能是解釋齊黃34 和冀豆17 衍生的RIL 群體開花表型變異的關(guān)鍵基因，該基因的存在可能是使齊黃34 也適宜在除黃淮海地區(qū)以外的日照較短的低緯度地區(qū)種植的重要原因。

同時(shí)，在該區(qū)間內(nèi)還存在一個(gè)開花相關(guān)基因GmMDE06(Glyma.06G205800)。 有研究表明Gm-MDE06過量表達(dá)能促進(jìn)大豆開花[19]。 但目前GmMDE06基因單倍型與開花期的相關(guān)性尚未得到闡明。 本研究結(jié)果顯示，該基因在齊黃34 和冀豆17 中有一個(gè)氨基酸的差異，因此推測(cè)其可能也是造成RIL 群體表型變異的候選基因。

GmFT2a基因在大豆開花調(diào)控中起重要作用，是成花素候選基因[20-22]。 在E1過表達(dá)植株中，GmFT2a的表達(dá)量顯著下降[12]。 近期研究表明，E1直接調(diào)控GmMDE06進(jìn)而影響GmFT2a的表達(dá)[19]。 本研究中，齊黃34 前期的GmFT2a表達(dá)量低于冀豆17，且積累峰值滯后于冀豆17。 可能是由于齊黃34 中顯性E1基因?qū)mFT2a的抑制作用更強(qiáng)，造成了開花促進(jìn)基因表達(dá)量的降低進(jìn)而顯著縮短了其開花期。

本研究在齊黃34 和冀豆17 雜交產(chǎn)生的RIL群體中發(fā)現(xiàn)qFT6 位點(diǎn)，也解釋了齊黃34 不適宜在高緯度地區(qū)種植的原因:主要是因?yàn)镋1為顯性，在日照偏長(zhǎng)的高緯度地區(qū)對(duì)開花促進(jìn)基因GmFT2a的抑制作用更為強(qiáng)烈，導(dǎo)致齊黃34 開花過晚，甚至不能正常開花。 隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，今后可對(duì)齊黃34 中的E1進(jìn)行定向敲除，使其轉(zhuǎn)變?yōu)殡[性基因型，進(jìn)而創(chuàng)制出以齊黃34 為遺傳基礎(chǔ)但適宜在北方高緯度地區(qū)種植的優(yōu)異大豆種質(zhì)。