壯藥潤喉飲治療急性咽炎網絡藥理學研究

陳仕鵬,謝瑞杰,劉代華*

(1.柳州市人民醫(yī)院 藥學部,廣西 柳州 545006;2.柳州市胃腸道中成藥工程技術研究中心,廣西 柳州 545006)

急性咽炎(Acute pharyngitis,AP)是臨床上常見的呼吸道傳染病之一,發(fā)生于人體咽部黏膜、黏膜下組織和淋巴組織的急性刺激,經常通過病毒和細菌感染觸發(fā)。該疾病在人群中分布非常廣泛,主要發(fā)生于季節(jié)變化時,除病毒病原體外,細菌病原體也可以導致咽喉感染[1]。廣義上急性咽炎常規(guī)治療包括抗生素及皮質類固醇?？股匾桩a生耐藥性,抗生素濫用會導致咽喉菌群失調,繼而造成雙重污染,甚至病情進一步惡化。同時,激素療法也可以對內分泌及體內水鹽代謝產生影響。與單一抗生素、糖皮質激素治療相比,中醫(yī)治療方法療效更加顯著,且不良反應相對較少,安全性更高[2]。因此,研發(fā)治療急性咽炎的中藥制劑,具有重要的現(xiàn)實意義。

潤喉飲(Runhou decoction,RHD)為柳州市人民醫(yī)院的中藥復方制劑,由壯藥十大功勞、木蝴蝶、桔梗、生地和淡竹葉五味中藥組成,以中、壯醫(yī)辨證理論為指導,具有清熱解毒、止渴生津、利咽潤肺、疏肝和胃的功效,在長期臨床實踐中,用于急性咽炎的治療,效果顯著,但其作用機制尚未明確。中藥復方憑借“多成分-多靶點-多途徑”的作用機制,具有特殊的治病功效。然而從分子水平和系統(tǒng)角度理解中藥方劑的科學基礎仍然是循證中醫(yī)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一[3]。網絡藥理學是隨著生物信息學和結構藥理學改進而興起的一種分析方法,基于疾病、基因、目標和藥物相互作用網絡,通過網絡分析系統(tǒng)地觀察藥物對于疾病網絡的干預和影響,解析藥物的作用機制并建立一種新策略闡述中藥方劑的組合規(guī)則,發(fā)現(xiàn)中藥藥物開發(fā)的有效成分和協(xié)同成分[4-5]。因此,本研究通過網絡藥理學研究RHD治療急性咽炎的作用機制,完善和補充RHD藥效學研究,促進RHD復方優(yōu)化及進一步開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 RHD制作工藝

淡竹葉150g,生地100g,木蝴蝶100g,十大功勞50g,桔梗50g,以上五味加2L水煎煮2次,每次1.5h,合并煎液過濾,濾液濃縮至相對密度為1.05～1.10,加乙醇使含醇量達到65%。放置12h以上使沉淀。取上清液回收乙醇濃縮至相對密度為1.25的浸膏。取浸膏1份加10份蔗糖粉及適量乙醇制成顆粒,干燥,即得。

1.2 RHD活性成分收集及篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)、SYMMAP數(shù)據(jù)庫2.0(http://www.symmap.org/)、中國醫(yī)藥百科全書2.0(ETCM 2.0,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)對RHD中5種藥材活性成分進行檢索并篩選。以類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18為參數(shù)對活性成分篩選[6],對于未提供化合物DL值的,采用ADMETlab網站(http://admet.scbdd.com/)預測化合物的DL值[7]。滿足條件的化合物為RHD潛在的活性成分。

1.3 RHD活性成分的靶點篩選及靶點預測

通過TCMSP和ETCM 2.0檢索活性成分時,可直接篩選其已知的作用靶點。對于SYMMAP數(shù)據(jù)庫篩選得到的活性成分,通過經SIB數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstarget prediction.ch/)預測其作用靶點[8]。將上述數(shù)據(jù)庫的結果合并獲得RHD活性成分的作用靶點。

1.4 疾病靶點搜集

分別以“Acute pharyngitis”“Pharyngitis”“Inflammation”為關鍵詞,通過TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫篩選與急性咽炎相關的基因,獲取急性咽炎疾病相關靶點。

1.5 RHD活性成分-作用靶點網絡圖構建

使用STRING數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行網絡互作分析,限定物種為人,獲取蛋白之間相互作用關系。取置信度0.9以上結果導入Cytoscape 3.7.1進行可視化分析,構建“RHD活性成分-作用靶點”網絡及“疾病-靶點”網絡。經Cytoscape軟件將上述網絡進行合并,獲取“RHD活性成分-治療急性咽炎作用靶點”網絡圖。利用Network Analyzer分析網絡圖的拓撲特征值,以節(jié)點形狀大小描述度中心性(Degree)。

1.6 生物信息學分析

為尋找靶點蛋白在生物學功能及信號通路中發(fā)揮的作用,采用R語言對靶點蛋白進行基因本體論分析(Gene ontology,,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,根據(jù)富集分析顯著性從中篩選出RHD治療急性咽炎可能的信號通路,并通過Pathview網站(https://pathview.uncc.edu/)顯示靶點蛋白在通路中的位置。

1.7 分子對接驗證

基于“1.6”項下富集結果,對RHD活性成分及篩選出的信號通路關鍵靶點進行分子模擬對接驗證。通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載蒲公英賽醇(Taraxerol)、黃芩素(Baicalein)、木樨草素(Luteolin)、槲皮苷(Quercetin)晶體3D結構,使用SYBYL 2.0軟件進行結構優(yōu)化。從RCSB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)獲得NF-κB(PDB代碼:2o61)、MAPK1(PDB代碼:4qpa)、AKT(PDB代碼:6hhh)、IKBKB(PDB代碼:4e3c)的蛋白結構,導入SYBYL 2.0中刪除配體和水分子從而暴露出蛋白結合活性口袋,采用Surflex-Dock(SFXC)對接模式,Surflex-Dock得分越高表示配體和受體的親和力越大。

2 結果

2.1 RHD活性成分及其對應靶點蛋白的收集與篩選

共篩選得到90個RHD中含有的活性化合物,其中有8個化合物為共有化合物。共篩選得到424個靶點蛋白,盡管每味藥作用靶點不盡相同,但有223個共同作用靶點,提示不同組成藥物間存在著相互協(xié)同作用機制,見圖1。

注:A:潤喉飲中五種藥材的活性化合物個數(shù);B:五種藥材藥活性化合物的作用靶點個數(shù)。

2.2 潤喉飲“活性成分-靶點-治療急性咽炎”網絡構建與分析

首先使用STRING數(shù)據(jù)庫構建RHD中424個作用靶點間的交互網絡,取置信度為0.9以上的網絡,得到潤喉飲“活性成分-靶點”網絡。共收集篩選得到129個急性咽炎相關靶點,通過STRING數(shù)據(jù)庫構建129個靶點間的交互網絡,取置信度為0.9以上的網絡,獲取“急性咽炎-相關靶點”網絡。通過Cytoscape 3.7.1軟件將兩個網絡合并,得到潤喉飲“活性成分-靶點-治療急性咽炎”網絡,網絡中節(jié)點的度值表示在蛋白相互作用網絡中與該節(jié)點直接相互作用的節(jié)點的數(shù)目,節(jié)點的度越大則其參與的生物功能越多[9]。以大于平均Degree值為條件篩選核心網絡,見圖2。該網絡包含98個節(jié)點(包括20個活性成分和72個作用靶點)和739條邊,靶點的平均Degree值為18.3,證明潤喉飲可通過多成分與多靶點相互作用治療急性咽炎,其中木蝴蝶、桔梗和十大功勞中的活性成分可能發(fā)揮主要作用。

圖2 潤喉飲“活性成分-治療急性咽炎靶點-作用通路”核心網絡

表1 潤喉飲“活性成分-治療急性咽炎靶點”網絡核心成分、靶點及其拓撲參數(shù)

2.3 富集分析和靶點映射

為進一步明確靶點蛋白的生物學功能,采用R語言對靶點蛋白進行GO注釋和富集分析。結果顯示,RHD治療急性咽炎的靶點蛋白主要分布于微膜結構域(Membrane microdomain),發(fā)揮細胞因子結合功能(Cytokine receptor binding),主要影響生物體應激進程(Response to xenobiotic stimulus)。為明確靶點蛋白調控的信號通路,對其進行KEGG富集分析。結果顯示RHD可調控Measles、AGE-RAGE、IL-17及Small cell lung cancer等信號通路,見圖3。由于潤喉飲治療急性咽炎的作用與抗炎有關,因此篩選與炎癥相關的IL-17信號通路,采用Pathview進一步將靶點蛋白映射整合在通路上,見圖4。

注:展示以P值從小到大排序前5的富集條目。

圖4 IL-17信號通路

圖5 活性成分與作用靶點分子對接

2.4 關鍵蛋白和通路的分子模擬對接

基于通路分析及生物學注釋結果,采用分子模擬對接技術驗證并通過Discovery Studio 4.5軟件可視化,以打分結果(Total score)大于4分表示化合物與靶點有較好的活性[10]。

3 討論

潤喉飲柳州市人民醫(yī)院經驗方,實踐證明治療急性咽炎療效俱佳,但其作用機理和成分配伍缺少科學的解釋。本研究首先通過收集和篩選潤喉飲中五種藥材已報道的活性成分及其靶點,構建潤喉飲“活性成分-靶點”網絡。共篩選和收集得到90個活性成分,其中只有8個為共有化合物,223個共同作用靶點,提示不同組成藥物間存在著相互協(xié)同作用機制,也有自身獨特的作用方式。其中木蝴蝶的活性成分最多,壯藥十大功勞收集的活性成分較少,可能是由于木蝴蝶的成分研究結果較多而十大功勞成分研究較少所致。本研究通過將潤喉飲“活性成分-靶點”網絡和急性咽炎相關“疾病-靶點”網絡合并,得到潤喉飲治療急性咽炎的“成分-靶點”網絡,并通過調整度值篩選獲取核心網絡。網絡中度值高的活性成分大多來源于木蝴蝶、桔梗和十大功勞,證明潤喉飲中主要為木蝴蝶、桔梗和十大功勞發(fā)揮抗炎功效。

為進一步了解作用靶點的生物學功能及調控通路,對靶點進行功能及通路富集分析。在所有富集信號通路中,IL-17信號通路與炎癥發(fā)生相關且顯著性排名較高,因此選擇IL-17信號通路為潛在的作用通路,并將潤喉飲中治療急性咽炎的靶點基因映射至該通路上,以便直觀篩選IL-17信號通路中的候選基因。結果顯示,潤喉飲治療急性咽炎的作用可能與調控NF-κB信號通路及MAPK信號通路相關。NF-κB信號通路與炎癥發(fā)生密切相關,在炎癥和氧化損傷的微環(huán)境下,IκK和IκB的激活可以促進NF-κB的磷酸化,導致不可逆的炎癥損傷,抑制IκK/IκB/NF-κB通路的激活可被視為治療靶點[11-12]。作為介導基本生物學過程和細胞對外部應激信號反應的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,MAPKs能夠調節(jié)炎癥和細胞凋亡介質的合成[13]。特別是,越來越多的證據(jù)表明MAPKs還參與NF-κB轉錄活性的調節(jié)[14]。除此之外,Akt也是潤喉飲篩選的靶點蛋白且在“成分-靶點”核心網絡中且度值排名靠前,研究表明,Akt是NF-κB的上游靶點之一[15]。因此采用分子對接技術研究槲皮苷、木樨草素、黃芩素和蒲公英賽醇及其靶點MAPK1、AKT、NF-κB1、IKBKB的對接方式,以對接分數(shù)判斷受體與配體間的親和力,得分大于4分表示與受體有較好結合活性。結果顯示,木蝴蝶和十大功勞的共有成分槲皮苷與MAPK1蛋白對接分數(shù)為5.18分,與AKT蛋白對接分數(shù)為3.88分,表示槲皮苷可能與MAPK1有相互作用。桔梗的活性成分木樨草素與AKT蛋白對接分數(shù)為5.93分,與MAPK1蛋白對接分數(shù)為5.99分,提示木樨草素可能同時激活AKT蛋白和MAPK1蛋白,抑制下游的炎癥因子合成。源自木蝴蝶的黃芩素與NF-κB上游蛋白IKBKB對接分數(shù)為4.27分,來源于淡竹葉的蒲公英賽醇與NF-κB蛋白對接分數(shù)僅3.21分,提示蒲公英賽醇與NF-κB可能對接活性較差,還需要通過實驗進一步探索。綜上,分子對接結果大部分驗證網絡藥理學結論,潤喉飲可能通過調控AKT/IKBKB/NF-κB與MAPK1/AP-1信號通路抑制炎癥因子表達而發(fā)揮抗炎作用。

本研究基于網絡藥理學分析,發(fā)現(xiàn)柳州市人民醫(yī)院制劑壯藥潤喉飲治療急性咽炎的潛在機制可能通過調控AKT/IKBKB/NF-κB與MAPK1/AP-1信號通路抑制炎癥因子的表達而發(fā)揮抗炎作用。其中壯藥十大功勞、木蝴蝶及桔梗發(fā)揮抗炎的主要作用,潤喉飲配方具有一定的藥用價值,獲得的關鍵靶標及具體調控機制還需進一步實驗研究加以探索及驗證,本研究初步揭示了壯藥潤喉飲治療急性咽炎的關鍵靶點及作用機制,為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。