健力生機本草菁萃安全性及補腎壯陽功效研究

趙宏偉,申李丹,王 磊,史建勛,黃先菊*

(1.無限極(中國)有限公司,廣東 廣州 510000;2.中南民族大學,湖北 武漢 430074;3.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校,浙江 寧波 315100)

中醫(yī)中的“腎”涵義非常豐富;它是人的先天之本,主骨生髓,能藏五臟和生殖之精,主津液代謝和納氣,開竅于耳及前后二陰。中醫(yī)認為精子稀少屬虛勞范疇,多因先天稟賦不足,或房勞過度損傷腎精,或大病久病,氣血兩虧,腎精化源匱乏,最終導致腎精不足而成本癥,因此說腎之虛損是導致精子稀少的直接原因。腎陽是機體生命活動的原動力,為生命之根本,腎陽虛證是中醫(yī)的基本證候之一[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為,腎陽與神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)關系密切,是多系統(tǒng)和多器官功能的綜合表現(xiàn)[2]。而人體講究陰平陽秘,養(yǎng)生學家常形象地把人的生命比喻成一盞油燈,陰精是燈油,陽氣是燈光,陰精足而陽氣旺。如果不經(jīng)辨證單純補腎壯陽,就如燈油耗盡不去添油,卻撥燈心加燈捻,反而會進一步耗損陰精,油盡而燈枯,有如竭澤而漁,或可取效一時,最終還是對人嚴重有損。因此補腎填精滋陰是治本之方,所謂油旺燈明,水火既濟,中醫(yī)把這種方法稱之為“添油之法”[3]。

1 研究背景

健力生機本草菁萃(Jianlishengji herbal extract,JLSJ)根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論組方,是一種以溫腎助陽、補氣、益精填髓為組方原則,由管花肉蓯蓉、熟地黃、肉桂、核桃仁、龍眼肉等補益類道地中草藥組成的保健食品。方中管花肉蓯蓉為君藥,溫補腎陽,益精血;配伍龍眼肉、紅棗益氣,補益心脾;枸杞子、熟地黃、核桃肉滋陰填髓,滋補肝、腎之陰,通命門,利三焦,陰陽相生,剛柔相濟,使腎之元氣生化無窮;佐以五味子益氣生精,收斂固澀;肉桂補火助陽,溫陽通脈,鼓舞氣血,防滋膩之滯。諸藥合用,溫腎助陽、補氣、滋陰之虛以生氣,使腎陽振奮,氣化復常。大量實驗表明,其中多種傳統(tǒng)藥材具有滋陰補腎、溫腎助陽的保健作用。例如,管花肉蓯蓉可通過抑制氧自由基保護腎臟組織,增加腎血流量,起到補腎壯陽的作用[4]。本產(chǎn)品已在香港、臺灣、泰國等海外市場上市,且前期開展過提高缺氧耐受力和緩解體力疲勞功效研究及代謝組學研究[5]。為進一步驗證產(chǎn)品無毒副作用,且具有壯陽功效,本研究旨在對該復方開展毒理安全性和補腎壯陽、滋陰填精功效試驗,研究以SD大鼠為實驗對象,觀察JLSJ低中高劑量對大鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)、陰莖勃起指數(shù)(Penile erection index,PEI值)、陰莖勃起潛伏期、血清睪酮水平、精子活力等指標的影響,并與有確切壯陽療效的東革阿里進行對比,旨在探討JLSJ的壯陽功效。

2 實驗材料與儀器

2.1 實驗動物

毒性實驗:SPF級健康SD大鼠,體質(zhì)量175～190g,雌雄各半。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006,合格證編號:11400700253600。實驗動物使用許可證號SYXK(鄂)2014-0077,使用證號:00270497。

藥效實驗:SPF級SD大鼠7～8周齡,體質(zhì)量160～180g,選取雄性大鼠。由湖北省實驗動物中心提供,飼養(yǎng)于中南民族大學SPF級大鼠實驗室。實驗動物及飼料生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2015-0018,實驗動物質(zhì)量合格證號:NO.00015037。所有動物實驗均已通過中南民族大學倫理審查委員會審查,倫理證號為:2016-scuec-0089。

大鼠均為籠養(yǎng),飲用水為除菌凈化水;飼料為Co60輻照實驗顆粒鼠糧,由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司生產(chǎn);實驗室溫度為20～24℃,濕度為40%～70%;12h的明暗周期。

2.2 實驗藥物與試劑

健力生機本草菁萃(Lot:IFM2902),由無限極研發(fā)中心提供;陽性對照品東革阿里水提取物,由無限極研發(fā)中心提供;XT-2000i型全自動動物血液細胞分析儀,日本希森美康公司;BS-820全自動生化分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;PB 302型電子天平,瑞士梅特勒公司;BS110S型電子天平,北京賽多利斯天平有限公司;ASP200S型真空組織脫水機、EG1150型包埋機、EG1150C型包埋冷凍臺、RM2265型全自動切片機、HI1210 攤片機、HI1220烤片機,Leica Biosystems Nussloch GmbHo DM2500顯微照相儀,Leica Microsystems;H-1850R高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

樣品制備:將管花肉蓯蓉(128mg)、肉桂(42mg)、熟地黃(240mg)、五味子(70mg)、枸杞子(240mg)、核桃仁(210mg)、龍眼(285mg)、酸棗仁(285mg)粉碎并過篩(65目)加水適量,浸泡超聲后過濾,合并濾液,減壓濃縮濾液,得到浸膏。

3 實驗方法

3.1 毒性試驗

3.1.1 動物分組與劑量設計 取SD大鼠88只,按體質(zhì)量隨機分成4組,分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組及陰性對照組;每組均為雌雄各11只。高、中、低三個劑量組分別給予0.5、0.25、0.125g·mL-1三種濃度的樣品溶液灌胃,陰性對照組給予純化水灌胃,每天灌胃1次,灌胃體積均為1.0mL/100g,則高、中、低劑量組的劑量分別為5、2.5、1.25g/kg,分別相當于人攝入量(以每日口服3g、體質(zhì)量60kg計,折算劑量則為0.05g/kg)的100倍、50倍、25倍。每天灌胃1次,連續(xù)30天。每周按動物體質(zhì)量調(diào)整一次灌胃量。

3.1.2 觀察指標 (1)一般觀察。每日觀察并記錄所有動物的一般表現(xiàn)、行為、呼吸、中毒表現(xiàn)及死亡情況。

(2)體質(zhì)量和攝食量。每周稱1次體質(zhì)量、2次食物攝入量。計算每周及總的食物利用率。周食物利用率(%)=周體質(zhì)量增加量/周飼料攝入量×100%,總食物利用率=試驗期間動物體質(zhì)量總增加量/飼料總攝入量×100%[6]。

(3)血液學及生化指標。灌胃30天后,末次灌胃后大鼠禁食16h,大鼠用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉,用真空采血管于腹主動脈取抗凝血(EDTAK2抗凝)及未抗凝血后,腹主動脈放血處死,抗凝血用于檢測血液學指標,未抗凝血分離血清后用于檢測血液生化指標。

血液學指標檢測如下數(shù)據(jù):測定血紅蛋白(Hb)、紅細胞計數(shù)(RBC)、白細胞計數(shù)及分類(WBC&DC)。

血液生化指標檢測如下數(shù)據(jù):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG),計算白蛋白/球蛋白比值(ALB/GIO)。

(4)大體解剖。試驗結束時對所有大鼠進行大體檢查,全面細致觀察各組大鼠的器官和組織。

(5)臟器質(zhì)量和臟/體比值[6]。稱量肝、腎、脾、卵巢(雌性)、睪丸(雄性)的絕對質(zhì)量,臟/體(%)=臟器絕對質(zhì)量/動物體質(zhì)量×100%(動物體質(zhì)量為禁食后的體質(zhì)量)。

3.2 藥效學評價

3.2.1 動物分組與劑量設計 取SD雄性大鼠50只,按體質(zhì)量隨機分為5組,每組10只。分別為正常組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,低、中、高三個劑量組分別給予0.05g·mL-1、0.1g·mL-1、0.3g·mL-1三個濃度的樣品溶液灌胃,分別相當于人攝入量(以每日口服3g、體質(zhì)量60kg計,折算劑量為0.05g/kg)的5倍、10倍、30倍。陽性對照組給予濃度為0.053g·mL-1(31.8/3mg/kg,0.5mL/100g)的東革阿里水提取物灌胃,相當于人體推薦量的5倍。

3.2.2 觀察指標 (1)大鼠體質(zhì)量稱重。給藥前,將大鼠稱重后隨機分組。給藥后每周固定時間稱重1次,實驗結束繪制體質(zhì)量變化曲線。

(2)各組大鼠PEI值測定。適應性喂養(yǎng)5天后,每天1次,連續(xù)給藥灌胃四周,對照組給予等體積生理鹽水。每組動物每周進行2次性行為學觀察。給藥完畢,每組動物分為3批,3～4只老鼠/籠,以雌鼠在籠外做誘導,人工觀察大鼠陰莖勃起時間(陰莖勃起潛伏期:從觀察時間開始,到陰莖首次勃起需要的時間),并用攝像頭連續(xù)記錄90min內(nèi)大鼠陰部理毛、爬背次數(shù)和參與動物數(shù),并計算PEI值。

PEI=每組大鼠相關性行為反應總次數(shù)×每組中有相關性行為反應的大鼠數(shù)/每組大鼠數(shù)量

(3)血清睪酮水平檢測。連續(xù)給藥4周后,眼角靜脈叢采血1.5mL,靜置1h,3 000r/min離心30min,取血清,ELISA試劑盒檢測血清睪酮水平。

(4)精子活力評定[7]及臟器系數(shù)比。用1%戊巴比妥鈉(0.2mL/100g)腹腔麻醉,下腹正中切口,提出睪丸,找出睪丸和附睪,分離出睪丸和附睪,稱重,然后用眼科剪剪下附睪,將一側附睪從中間剪斷,取附睪尾端,置于2mL PBS中(37℃,預溫),用眼科剪剪成3段,溫育10min,待附睪精子充分游離后顯微鏡下計數(shù),計算精子活力:精子活力=(計數(shù)室總精子數(shù)-不能前進運動的總精子數(shù))÷計數(shù)室總精子數(shù)。

最后將動物安樂死,再取精囊腺和提肛肌,將所有臟器稱重,計算臟器系數(shù)比。

3.3 統(tǒng)計學處理

使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計分析。結果用平均值±標準差(SD)表示。組間差異采用ANOVA分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

4 實驗結果

4.1 毒性實驗

4.1.1 一般觀察 試驗過程中,各組動物外觀、行為、毛發(fā)等一般表現(xiàn)正常,無死亡情況發(fā)生。

4.1.2 動物體質(zhì)量 試驗過程中,各組大鼠體質(zhì)量正常增長,受試物各劑量組大鼠每周體質(zhì)量與陰性對照組比較差異均無顯著性意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 JLSJ對大鼠體質(zhì)量的影響

4.1.3 攝食量及食物利用率 (1)攝食量。試驗過程中,受試物各劑量組大鼠每周攝食量與陰性對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 JLSJ對大鼠周攝食量的影響

(2)總食物利用率。受試物各劑量組大鼠體質(zhì)量總增重、總攝食量、總食物利用率與陰性對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 JLSJ對大鼠總食物利用率的影響

4.1.4 血液學指標 血液學檢測指標中,受試物各劑量組與陰性對照組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表4。

表4 JLSJ對大鼠血液學指標的影響

4.1.5 血液生化指標 血液生化學指標中,受試物各劑量組與陰性對照組相比,指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表5。

表5 JLSJ對大鼠血液生化指標的影響

4.1.6 臟器質(zhì)量及臟/體比值 受試物各劑量組大鼠肝臟、腎臟、脾臟、卵巢(雌性)、睪丸(雄性)的臟器質(zhì)量和臟/體比值與陰性對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表6。

表6 JLSJ對大鼠臟器質(zhì)量及臟/體比值的影響

4.2 壯陽功效

4.2.1 體質(zhì)量增長曲線 圖1顯示,給藥3周以后,健力本草菁萃低劑量組體質(zhì)量增長略低于正常組。中劑量組大鼠體質(zhì)量增加明顯,第4周后體質(zhì)量增長到(339.4±16.9)g,體質(zhì)量增長率達到119.8%,顯著高于正常組(體質(zhì)量329.8±21.7g,體質(zhì)量增長率93.8%)和東革阿里組(體質(zhì)量332.4±18.7g,體質(zhì)量增長率85.3%)。其他組體質(zhì)量增長與正常組相比變化不大。

注:與正常對照組相比;#P<0.05,##P<0.05,與陽性對照組相比。

4.2.2 臟器系數(shù)比 給藥完畢,摘取各組大鼠的睪丸、附睪、提肛肌及精囊腺稱重,比較各組間臟器系數(shù)比。結果如圖2A所示,各組間睪丸臟器系數(shù)有增加趨勢,但統(tǒng)計學無差異。除睪丸臟器系數(shù)比無明顯差別外,東革阿里藥材及健力本草菁萃各組均出現(xiàn)了臟器系數(shù)比值的增加,其中精囊腺的增加最為明顯。健力本草菁萃中高劑量組作用與陽性對照組基本相當。

注:與正常對照組相比。

4.2.3 大鼠PEI值 給藥后,陽性對照組東革阿里水提取物及JLSJ組低中高劑量組的大鼠爬背、陰部理毛及陰莖勃起等性反應時間增加,強度增強。如圖3所示,東革阿里組平均PEI值顯著高于正常組,JLSJ低、中、高劑量組平均PEI值均高于正常組,與正常組比較,統(tǒng)計學處理有顯著性差異。與東革阿里組比較無統(tǒng)計學差異。

注:與正常對照組相比。

4.2.4 陰莖勃起潛伏期 與給藥前相比,給藥2周后陽性對照組東革阿里水提取物及JLSJ組大鼠的陰莖勃起潛伏期均縮短(表7及圖4),部分組別藥物組效果強于陽性對照組。中劑量組表現(xiàn)尤其突出。

圖4 各組大鼠給藥后陰莖勃起潛伏期變化

4.2.5 血清睪酮結果 血清睪酮檢測結果(圖5)顯示,與正常對照組相比,低、中、高劑量的JLSJ均能提高血清睪酮水平;與陽性對照組相比,低、中劑量組的作用優(yōu)于陽性對照東革阿里組。結果顯示,低、中、高劑量的JLSJ均有一定的壯陽功效。

注:與正常對照組相比;#P<0.05,與陽性對照組相比。

4.2.6 精子活力結果 精子活力檢測結果如圖6,與正常組對比,JLSJ低、中、高劑量組均能增強雄性大鼠精子活力,且具有劑量依賴性關系,其中高劑量組作用與陽性對照組相當。結果顯示,低、中、高劑量的JLSJ均有一定的壯陽功效。

注:與正常對照組相比;#P<0.05,##P<0.01,與陽性對照組相比。

5 討論

睪酮作為一種雄激素,對于男性特征發(fā)育、精子發(fā)育、性器官發(fā)育、性沖動的產(chǎn)生等方面起著重要作用,維持高水平的血清睪酮含量是提高性欲的基礎[8]。經(jīng)研究表明,睪酮的產(chǎn)生可能是促性腺激素活性以及類固醇成分形式的前體可用性增加的結果[9]。睪酮的分泌可以促進雄激素活性以及男性附屬性器官的發(fā)育,例如前列腺、精囊、輸精管和附睪等[10]。睪酮的作用機制可能與跨越靶細胞中蛋白質(zhì)形成速率的增加有關。在短短幾分鐘內(nèi),睪酮在酶5 α reductase的幫助下轉(zhuǎn)化為二氫睪酮(DHT),DHT與細胞質(zhì)中的受體蛋白結合并遷移到細胞核,刺激DNA和RNA轉(zhuǎn)錄過程[11]。RNA聚合酶被激活,最終蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加,這導致體質(zhì)量和第二性器官的質(zhì)量增加[12]。使得第二性器官的臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)比也增加。該機制可能導致陰莖血流量增加,從而改善勃起功能[13],進而提高陰莖勃起指數(shù)(PEI值)和縮短陰莖勃起潛伏期,有助于改善性行為。因此,維持男性體內(nèi)睪酮水平在探究壯陽功效研究中顯得至關重要?；谏鲜隼碚?本研究以血清中睪酮水平作為切入點,將睪酮水平和精子活力作為改善性行為的首要判斷依據(jù),并進一步通過測量體質(zhì)量、第二性器官臟器系數(shù)差異、PEI值和陰莖勃起潛伏期等一系列指標來判斷其壯陽功效和作用機制。

隨著國家“一帶一路”倡議的推動,越來越多功效顯著無毒副作用的藥食同源中草藥健康食品走出國門,造福東南亞地區(qū)。東南亞國家對壯陽類保健食品需求旺盛。在馬來西亞,東革阿里被視作國寶級藥材,當?shù)匕傩粘Ｒ詵|革阿里的根作為藥物用于改善男性性功能。有文獻報道,東革阿里原產(chǎn)于印度尼西亞、馬來西亞、越南以及柬埔寨、緬甸、老撾、泰國等地,是亞洲著名的可用于壯陽的民間藥物之一。因其在民間的廣泛應用引起了馬來西亞和美國醫(yī)學界的高度重視[14-16],近年來作為有壯陽功效的植物藥廣受國外醫(yī)藥界推崇?，F(xiàn)代研究表明服用東革阿里根部提取物可以提高血清睪酮水平和增強性能力,有較明顯的壯陽功效[17-18],而且未發(fā)現(xiàn)有毒副作用。但同時,東革阿里的提取物中含喹啉類化合物,該類化合物被認為是自然界中最苦的化合物之一,因此,市面上出現(xiàn)了很多沒有苦味的東革阿里提取物,而這些要么是偽品,要么功效較低。由于東革阿里本身口感差和資源匱乏問題,在使用過程中給消費者帶來了諸多不便?；诖?本研究以東革阿里提取物的壯陽功效作為參考,進一步關注壯陽保健食品本身的口感及資源利用方面的問題,旨在尋找一種安全有效、無不良口感且資源更為豐富的壯陽類植物產(chǎn)品[19]。

本研究以JLSJ作為研究對象,依托傳統(tǒng)中醫(yī)理論進行組方,具有多成分、多途徑、多靶點共同調(diào)控的特點。以SD大鼠為實驗動物,將JLSJ按相當于人攝入量的100倍、50倍、25倍對大鼠連續(xù)灌胃30天,動物一般觀察未見明顯的中毒癥狀和死亡,各劑量組大鼠體質(zhì)量增長量、食物利用率、肝腎臟器指數(shù)和血液學血液生化學指標與陰性對照組相比,差異均無顯著意義,證明其安全無毒無明顯的毒副作用,大鼠生長狀態(tài)良好,并且對其生長有一定促進作用。同時,以SD雄性大鼠為實驗動物,將JLSJ按相當于人攝入量的5倍、10倍、30倍對大鼠連續(xù)灌胃4周,經(jīng)研究,其與有明確的壯陽功效的東革阿里陽性對照藥相比,可增加動物精子活力,增進性反應時間與次數(shù),提高性激素水平及性器官臟器系數(shù)比,其壯陽功效相當,甚至更好,具有較好的壯陽保健功效。且無論是功效、口感和資源利用方面都更具優(yōu)勢。但本研究雖已證明JLSJ的組方在壯陽方面有顯著功效,但并未從其具體物質(zhì)基礎水平開展研究,這也是未來我們將繼續(xù)研究的方向。

6 結論

JLSJ在臨床劑量范圍內(nèi)無明顯毒副作用,具有明確的壯陽功效,且與有明確的壯陽功效的陽性對照藥東革阿里相比在功效、口感和資源利用方面都更具優(yōu)勢,對于本土藥用植物資源的深度開發(fā)利用具有積極意義。