反向離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定地夸磷索鈉含量

張小平，魏 淵，朱永星

（1. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇恒新藥業(yè)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009）

干眼癥的發(fā)病原因包括淚液質(zhì)和量異常，動(dòng)力學(xué)異常的內(nèi)膜穩(wěn)定性下降，眼部神經(jīng)異常，眼部炎癥導(dǎo)致角膜、結(jié)膜細(xì)胞損傷等，我國(guó)發(fā)病率為21%～30%［1］，且趨于年輕化、大眾化［2-3］。目前，治療干眼癥的常規(guī)方法是運(yùn)用人工淚液或聯(lián)合抗炎藥物滴眼［4］，常用藥物有聚乙二醇［5］、普拉洛芬聯(lián)合玻璃酸鈉［6］、石斛夜光丸聯(lián)合玻璃酸鈉［7］、環(huán)孢素A［8］等。3%地夸磷索鈉滴眼液于2010 年在日本上市，2017 年10 月進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，臨床治療干眼癥療效良好［9-13］。地夸磷索鈉作用于眼結(jié)膜上皮及杯狀細(xì)胞膜上的P2Y2 受體，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，促進(jìn)水分及黏蛋白的分泌，進(jìn)而改善干眼癥癥狀，是一種治療干眼癥的新型藥物［14-17］。截至2022 年5 月25 日，國(guó)內(nèi)尚無(wú)藥品生產(chǎn)企業(yè)取得地夸磷索鈉滴眼液批準(zhǔn)文號(hào)，也無(wú)其含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本研究中采用反向離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定了地夸磷索鈉的含量［18］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP211D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬(wàn)分之一）；UV - 2600i 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，LC - 2030 Plus 型高效液相色譜儀，LC - 20 AD 型高效液相色譜儀，均購(gòu)自日本島津公司；Agilent 1220 infinity LC 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；DL -204 型電熱恒溫干燥箱（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；KQ-800DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為1 600 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

地夸磷索鈉對(duì)照品（廣東先強(qiáng)藥業(yè)有限公司，批號(hào)為211002，純度為99.8%）；地夸磷索鈉（批號(hào)分別為220301，220302，220303），純化水，均由江蘇恒新藥業(yè)有限公司自制；乙腈（德國(guó)默克集團(tuán)）；磷酸二氫鉀、氫氧化鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；四丁基硫酸氫銨（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Thermo Scientific?C18柱（100 mm×4.6 mm，3μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）-乙腈（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取地夸磷索鈉樣品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加純化水適量，超聲（功率為1 600 W，頻率為40 kHz）20 min 使其徹底溶解，加純化水定容，搖勻，即得供試品溶液。取地夸磷索鈉對(duì)照品適量，置電熱恒溫干燥箱中干燥至恒重，取10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加純化水適量，超聲使溶解，加純化水稀釋并定容，即得對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液，以純化水為陰性對(duì)照品溶液，各10μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品溶液在此色譜條件下的理論板數(shù)按地夸磷酸鈉峰計(jì)為6 237，拖尾因子為0.909。地夸磷索鈉理論板數(shù)不低于4 000，拖尾因子應(yīng)不大于1.5，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰。色譜圖見(jiàn)圖1。

1. 地夸磷索鈉A. 對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對(duì)照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Diauafosol sodiumA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

破壞性試驗(yàn)：取地夸磷索鈉樣品100 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，按2.2 項(xiàng)下方法制備濃度為1 mg/mL的供試品溶液，平行6份，除1份溶液未經(jīng)破壞外，其余溶液分別經(jīng)強(qiáng)酸（2 mol/L HCl溶液、室溫3 h）、強(qiáng)堿（2 mol/L NaOH溶液、室溫3 h）、強(qiáng)氧化（3%H2O2溶液室溫3 h）、熱（100 ℃水溶0.5 h）、強(qiáng)光［（4 500±500）Lx照射1 d］條件破壞，破壞后，調(diào)pH至中性，加純化水衡釋為質(zhì)量濃度為100μg/mL的溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液經(jīng)酸破壞后峰面積減小，熱破壞后峰面積增大，對(duì)堿、氧化、強(qiáng)光破壞相對(duì)穩(wěn)定，各降解產(chǎn)物均能較好分離，且對(duì)地夸磷索鈉主峰無(wú)干擾。

檢測(cè)限與定量限確定：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加純化水逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比（S/N）為3和10時(shí)待測(cè)成分的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果地夸磷索鈉檢測(cè)限為0.01μg/mL，定量限為0.03μg/mL。

線性關(guān)系考察：取地夸磷索鈉對(duì)照品0.032 36 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加純化水適量，逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為3.23，32.30，161.50，323.00，484.50，646.00μg/mL 的系列溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以地夸磷索鈉質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=11 346X+35 924（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，地夸磷索鈉質(zhì)量濃度在3.23～646.00 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取地夸磷索鈉對(duì)照品適量，加純化水分別制成質(zhì)量濃度為40，100，400μg/mL 的溶液，在日內(nèi)各重復(fù)進(jìn)樣5 次，并連續(xù)測(cè)定5 d。結(jié)果地夸磷索鈉低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液日內(nèi)及內(nèi)間精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD均≤2.0%（n= 5）。取同一批（批號(hào)為220301）樣品適量，按2.2 項(xiàng)下方法配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL 的供試品溶液，在同一試驗(yàn)室的不同時(shí)間，由不同操作人員分別用島津LC - 2030 Plus 型、Agilent 1220 infinity LC 型、島津LC-20 AD 型高效液相色譜儀測(cè)定樣品含量，結(jié)果中間精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD為0.52%。上述結(jié)果表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為220301）適量，按2.2項(xiàng)下方法配制成質(zhì)量濃度為100 μg/ mL 的供試品溶液，平行5 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣測(cè)定2 次，記錄色譜圖。結(jié)果地夸磷索鈉的平均含量為99.60%，RSD為0.36%（n=10），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為220301）0.010 05 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的供試品溶液，分別于室溫放置0，1，2，4，6，8，10，12 h時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果的RSD為0.69%（n= 8），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為220301）適量，共9份，分別置100 mL容量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.401 0 mg / mL 的對(duì)照品溶液20，25，30 mL，各3 份，如純化水適量，超聲使溶解，加純化水定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 地夸磷索鈉加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of diauafosol sodium（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批（批號(hào)分別為220301，220302，220303）樣品各適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定2次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量分別為99.84%，99.97%，99.35%，RSD分別為0.13%，0.06%，0.20%（n=2）。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

前期試驗(yàn)中，取對(duì)照品10 mg，精密稱定，加純化水，制成每1 mL 溶液中含地夸磷索鈉50μg 的溶液，采用紫外分光光度計(jì)于200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果地夸磷索鈉溶液約在205 nm 及262 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，由于205 nm 只檢測(cè)到該峰末端部分，屬紫外末端吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇262 nm。

3.2 色譜柱選擇

C18或C8反相色譜柱常用于分離弱極性、中性、非極性化合物，用C18或C8短柱（100 mm×4.6 mm，3μm）分離地夸磷索鈉，保留時(shí)間為1.0 min，換為長(zhǎng)柱（250 mm×4.6 mm，5μm）保留時(shí)間僅延長(zhǎng)至2.0 min，由于地夸磷索鈉顯極性，故在反相色譜柱中的保留時(shí)間極短。

3.3 磷酸鹽緩沖液配制方法選擇

地夸磷索鈉解離常數(shù)為6.3，在流動(dòng)相為pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中以解離型居多，若選擇氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，溶液中的鈉離子會(huì)對(duì)藥物中的鈉離子形成干擾，降低含量測(cè)定的準(zhǔn)確度，偏差變大；若將pH 調(diào)節(jié)劑換為氫氧化鉀，可避免外源性鈉離子對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。地夸磷索鈉為弱酸類物質(zhì)，流動(dòng)相中需加入季銨類離子對(duì)（四丁基硫酸氫銨）［19］等正離子與藥物磷酸基團(tuán)的負(fù)離子（反離子）生成不帶電荷的中性離子對(duì)，增加供試品在反相色譜柱中的溶解度，增大分配系數(shù)，改善分離效果，延長(zhǎng)保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)樣品充分分離。故磷酸鹽緩沖液配制方法為取磷酸二氫鉀6.80 g，氫氧化鉀1.316g，四丁基硫酸氫銨5.0 g，加純化水1 000 mL，調(diào)pH 至6.8。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，四丁基硫酸氫銨緩沖鹽溶液室溫放置8 h 以上可見(jiàn)渾濁，故需臨用現(xiàn)配。

3.4 流動(dòng)相比例選擇

隨著流動(dòng)相中乙腈濃度的增大，藥物出峰時(shí)間提前，保留時(shí)間變短，為了延長(zhǎng)藥物在色譜柱中的保留時(shí)間，建議流動(dòng)相中乙腈濃度不超過(guò)20%，故選擇磷酸鹽緩沖液與乙腈體積比為85∶15（V/V）。

3.5 進(jìn)樣時(shí)間選擇

樣品連續(xù)進(jìn)樣時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，超過(guò)6 h，色譜峰逐漸漂移，峰形走樣變形，理論板數(shù)變小，拖尾因子變??；超過(guò)10 h，單峰變?yōu)殡p峰，理論板數(shù)進(jìn)一步變小，柱效下降，易導(dǎo)致泵和色譜柱損壞。故建議進(jìn)樣時(shí)間控制在4 h內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)束后需加倍延長(zhǎng)沖洗色譜柱的時(shí)間。

3.6 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可為地夸磷索鈉原料藥及其制劑的研發(fā)提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)，為其正式標(biāo)準(zhǔn)的擬訂提供參考。