長(zhǎng)裂藤黃化學(xué)成分的分離鑒定及其抗腫瘤活性初篩

張少武，應(yīng)晶晶，師馬俊杰，熊焯，孟祥敏，汪梁，孫雅婷（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110034）

長(zhǎng)裂藤黃（Garcinia lancilimba）為藤黃屬（Garcinia）植物，主要分布于我國(guó)云南、廣西等地區(qū)[1]。藤黃屬植物有著悠久的民間用藥歷史，具有消炎、止血和殺蟲之功效，用于治療潰瘍、濕瘡、出血及燙傷等[2]。藤黃屬植物的代表性化合物為呫噸酮類、間苯三酚類及萜類化合物等[3-5]，具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種藥理作用[6-9]。長(zhǎng)裂藤黃作為中國(guó)特有的藤黃屬植物，與其他藤黃屬植物相比，其化學(xué)成分和活性的相關(guān)研究很少，主要的化學(xué)成分包括呫噸酮類、聯(lián)苯類和黃酮類化合物，具有較好的抗腫瘤和抗病毒活性[10-14]。為了豐富藤黃屬植物的化合物資源，本文對(duì)長(zhǎng)裂藤黃葉的化學(xué)成分進(jìn)行研究，采用多種色譜手段進(jìn)行分離，共得到7個(gè)呫噸酮類化合物（見圖1），通過(guò)理化常數(shù)測(cè)定、波譜數(shù)據(jù)分析等方法分別鑒定為1，3，7-trihydroxy-2，4-diprenylxanthone（1）、globuxanthone（2）、2，6-dihydroxy-1，5-dimethoxyxanthone（3）、1，2，5-trihydroxyxanthone（4）、1，2，8-trihydroxyxanthone（5）、1，7-dihydroxyxanthone（6）、1，3，6，7-tetrahydroxy xanthone（7）。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of the compounds 1～7

1 材料

Bruker ARX-400核磁共振波譜儀（Bruker 公司，TMS內(nèi)標(biāo)）；高效液相色譜儀（日本島津，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC-6AB高壓輸液泵），色譜柱YMC-Pack Pro C18（5 μm，250×20 mm）；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；薄層硅膠板、200～300目硅膠（青島海洋化工廠），ODS柱色譜填料（15 μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司），Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（瑞典GE Healthcare公司）；色譜純甲醇（天津科密歐公司），氘代試劑DMSO-d6和CDCl3（美國(guó)Sigma公司），人原髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60（美國(guó)ATCC），噻唑藍(lán)（MTT，Biosharp公司），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司），其他常規(guī)試劑均為分析純；顯色劑（10% 硫酸乙醇）。五氟尿嘧啶（5-FU，美國(guó) Sigma公司）。

長(zhǎng)裂藤黃葉采自云南省西雙版納熱帶植物園，經(jīng)陳渝工程師鑒定為藤黃屬植物長(zhǎng)裂藤黃Garcinia lancilimba。

2 提取分離

長(zhǎng)裂藤黃葉12.4 kg用95%乙醇加熱提取3次，每次3 h，合并提取液，回收溶劑，將所得提取物分散于水中，用二氯甲烷等體積萃取并濃縮，得到二氯甲烷萃取物270 g。對(duì)二氯甲烷萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)（100∶0～0∶100）進(jìn)行梯度洗脫，得到5個(gè)組分Fr.A～Fr.E。對(duì)Fr.B組分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮系統(tǒng)（100∶3～100∶50）進(jìn)行梯度洗脫，得到8個(gè)亞組分Fr.B1～Fr.B8。Fr.B2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜和開放ODS柱色譜（30%～100%甲醇水）純化得到化合物1（6.5 mg）和化合物2（5.0 mg）。Fr.B4經(jīng)開放ODS柱色譜（30%～100%甲醇水）和高效液相色譜[70%甲醇水，流速2 mL·min－1，YMCPack C18（5 μm，250 mm×20 mm）]純化得到化合物6（12.0 mg，tR＝18.0 min）和化合物7（8.0 mg，tR＝13.5 min）。Fr.B6經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜和開放ODS柱色譜（50%～100%甲醇水）純化得到化合物3（7.0 mg）、化合物4（10.0 mg）和化合物5（4.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z381.2 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.08（1H，s，1-OH），7.34（1H，d，J＝8.7 Hz，H-5），7.23（1H，dd，J＝2.3，8.7 Hz，H-6），7.61（1H，d，J＝2.3 Hz，H-8），3.45（2H，d，J＝7.0 Hz，H-1'），5.28（1H，t，J＝7.0 Hz，H-2'），1.88（3H，s，4'-CH3），1.78（3H，s，5'-CH3），3.54（2H，d，J＝7.0 Hz，H-1''），5.26（1H，t，J＝7.0 Hz，H-2''），1.84（3H，s，4''-CH3），1.73（3H，s，5''-CH3）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：158.3（C-1），109.1（C-2），161.0（C-3），105.6（C-4），152.2（C-4a），119.0（C-5），120.5（C-6），153.2（C-7），109.0（C-8），120.7（C-8a），181.0（C-9），103.1（C-9a），152.2（C-10a），21.7（C-1'），121.9（C-2'），133.8（C-3'），26.1（C-4'），18.2（C-5'），22.3（C-1''），121.5（C-2''），135.7（C-3''），26.2（C-4''），18.0（C-5''）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[15]中的化合物基本一致，故鑒定為1，3，7-trihydroxy-2，4-diprenylxanthone。該化合物為首次從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到。

化合物2：黃色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z313.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.60（1H，s，1-OH），10.47（1H，s，2-OH），9.22（1H，s，5-OH），7.28（1H，s，H-3），7.30（1H，dd，J＝2.1，8.2 Hz，H-6），7.24（1H，t，J＝8.2 Hz，H-7），7.57（1H，dd，J＝2.1，8.2 Hz，H-8），6.31（1H，dd，J＝10.6，17.4 Hz，H-2'），5.05（1H，d，J＝17.4 Hz，Ha-3'），4.94（1H，d，J＝10.6 Hz，Hb-3'），1.60（6H，s，4'-CH3，5'-CH3）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：146.5（C-1），138.6（C-2），122.8（C-3），125.0（C-4），145.2（C-4a），145.8（C-5），120.1（C-6），123.8（C-7），114.3（C-8），120.1（C-8a），182.7（C-9），109.0（C-9a），145.8（C-10a），39.8（C-1'），146.5（C-2'），111.3（C-3'），26.9（C-4'），26.9（C-5'）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[16]中的化合物基本一致，故鑒定為globuxanthone。該化合物為首次從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到。

化合物3：黃色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z289.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.56（1H，s，2-OH），9.40（1H，s，6-OH），7.30（1H，d，J＝8.7 Hz，H-3），7.24（1H，d，J＝8.7 Hz，H-4），6.92（1H，d，J＝8.7 Hz，H-7），7.72（1H，d，J＝8.7 Hz，H-8），3.91（3H，s，1-OCH3），3.78（3H，s，5-OCH3）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：155.7（C-1），147.2（C-2），123.8（C-3），121.6（C-4），150.3（C-4a），134.5（C-5），145.6（C-6），115.6（C-7），114.0（C-8），116.4（C-8a），174.5（C-9），113.8（C-9a），150.0（C-10a），61.4（1-OCH3），61.1（5-OCH3）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[17]中的化合物基本一致，故鑒定為2，6-dihydroxy-1，5-dimethoxyxanthone。該化合物為首次從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到。

化合物4：黃色粉末（丙酮），10%硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z245.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.45（1H，s，1-OH），10.45（1H，s，2-OH），9.35（1H，s，5-OH），7.33（1H，d，J＝8.5 Hz，H-3），6.89（1H，d，J＝8.5 Hz，H-4），7.32（1H，brd，J＝8.1 Hz，H-6），7.24（1H，t，J＝8.1 Hz，H-7），7.61（1H，brd，J＝8.1 Hz，H-8）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：148.2（C-1），140.8（C-2），123.5（C-3），108.8（C-4），147.5（C-4a），146.4（C-5），120.3（C-6），124.6（C-7），115.0（C-8），120.0（C-8a），182.1（C-9），106.3（C-9a），145.4（C-10a）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[17]中的化合物基本一致，故鑒定為1，2，5-trihydroxyxanthone。該化合物為首次從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到。

化合物5：黃色粉末（甲醇），10%硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z245.0 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.10（1H，s，1-OH），11.56（1H，s，8-OH），7.37（1H，d，J＝8.6 Hz，H-3），6.69（1H，d，J＝8.6 Hz，H-4），7.02（1H，brd，J＝8.5 Hz，H-5），7.58（1H，t，J＝8.5 Hz，H-6），6.82（1H，brd，J＝8.5 Hz，H-7）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：150.2（C-1），142.8（C-2），125.5（C-3），109.2（C-4），149.5（C-4a），114.4（C-5），134.8（C-6），110.1（C-7），164.4（C-8），113.2（C-8a），179.3（C-9），106.3（C-9a），155.5（C-10a）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[18]中的化合物基本一致，故鑒定為1，2，8-trihydroxyxanthone。該化合物為首次從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到。

化合物6：黃色粉末（甲醇），10% 硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z229.1 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.65（1H，s，1-OH），10.10（1H，s，7-OH），6.78（1H，dd，J＝0.8，8.5 Hz，H-2），7.70（1H，t，J＝8.5 Hz，H-3），7.05（1H，dd，J＝0.8，8.5 Hz，H-4），7.55（1H，d，J＝9.0 Hz，H-5），7.36（1H，dd，J＝3.0，9.0 Hz，H-6），7.44（1H，d，J＝3.0 Hz，H-8）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[19]中的化合物基本一致，故鑒定為1，7-dihydroxyxanthone。

化合物7：黃色粉末（甲醇），10% 硫酸乙醇溶液顯黃色，ESI-MSm/z261.0 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：13.18（1H，s，1-OH），6.14（1H，d，J＝2.2 Hz，H-2），6.30（1H，d，J＝2.2 Hz，H-4），6.77（1H，s，H-5），7.35（1H，s，H-8）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：162.6（C-1），98.0（C-2），164.5（C-3），93.5（C-4），157.3（C-4a），102.2（C-5），151.1（C-6），143.7（C-7），108.0（C-8），111.5（C-8a），178.9（C-9），101.6（C-9a），154.2（C-10a）。該化合物的波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[20]中的化合物基本一致，故鑒定為1，3，6，7-tetrahydroxyxanthone。

4 抗腫瘤活性檢測(cè)

采用MTT方法檢測(cè)分離得到的呫噸酮類化合物對(duì)人原髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60的抑制活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，次日加入不同濃度分離得到的化合物稀釋液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后每孔加入50 μL 5 mg·mL－1的MTT溶液于37℃孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入200 μL DMSO溶解結(jié)晶，室溫振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量每個(gè)孔的光密度值（OD），并計(jì)算得到半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果顯示從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到的7個(gè)呫噸酮類化合物具有很好的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，其IC50值分別為7.1、3.8、16.2、13.7、23.5、22.0、18.4 μmol·L－1，陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶的IC50為3.4 μmol·L－1。

5 討論

藤黃屬藥用植物最具代表性的化合物為呫噸酮類化合物，本文從長(zhǎng)裂藤黃中分離得到了7個(gè)呫噸酮類化合物，其中化合物1～5為首次從該植物中分離得到，化合物6和7在已發(fā)表的大苞藤黃和長(zhǎng)裂藤黃相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道過(guò)。分離得到的7個(gè)化合物具有很好的HL-60細(xì)胞抑制活性，與簡(jiǎn)單氧代呫噸酮相比，結(jié)構(gòu)中含有異戊烯基的化合物表現(xiàn)出了更強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。該研究進(jìn)一步豐富了長(zhǎng)裂藤黃的次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，為其資源合理的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。從近幾年分離得到的化合物的結(jié)構(gòu)以及活性數(shù)據(jù)來(lái)看，長(zhǎng)裂藤黃仍有一定的研究發(fā)展空間，有待于進(jìn)一步深入研究。