血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的分子機制研究進展

劉丹媚,何璐,何朝勇

(1.中國藥科大學藥學院,江蘇 南京 210009;2.中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室,江蘇 南京 211198)

血管內(nèi)膜增生是由于血管壁損傷的一種愈合反應,其中涉及血管組織中眾多類型細胞的參與。當血管受到血管成形術(shù)、支架植入術(shù)和血流模式改變等侵襲時,內(nèi)皮細胞受損,血小板細胞發(fā)生聚集并招募白細胞黏附和浸潤損傷部位,引起血栓形成和炎癥。血小板和白細胞釋放的炎癥因子和生長因子促進平滑肌細胞從中膜向內(nèi)膜遷移并在內(nèi)膜下層增殖造成管腔內(nèi)狹窄[1]。正常生理情況下,VSMCs表現(xiàn)為靜止以及低增殖狀態(tài),通過促收縮型蛋白如α-SMA、SM22α、SMMHC和鈣調(diào)蛋白等,維持血管張力。當血管損傷后, VSMCs轉(zhuǎn)化為去分化型,收縮型蛋白顯著降低,引起VSMCs細胞增殖和遷移,進一步合成和分泌大量的細胞外基質(zhì),從而促進血管內(nèi)膜新生的形成[2]。以上表明,VSMCs表型轉(zhuǎn)化在血管內(nèi)膜新生的形成過程中扮演著舉足輕重的角色。

研究報道,機械力、整合素、細胞因子和生長因子等,通過調(diào)控VSMCs分化的核心轉(zhuǎn)錄因子參與VSMC表型轉(zhuǎn)化[3]。目前已報道的主要轉(zhuǎn)錄因子有血清響應因子(serum response factor,SRF)、心肌素(myocardin)、Krüppel-like因子4 (KLF4)、叉頭盒蛋白O4(forkhead box protein O4,FOXO4)、轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(ETS-like 1 transcription factor,ELK-1)、特異性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)和Yin Yang-1(YY1)等[4]。SRF作用于大多數(shù)收縮基因的近端啟動子或內(nèi)含子中的CArG[CC(A/T)6GG DNA序列]調(diào)控元件維持VSMCs收縮表型。心肌素以及心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A和B(myocardin-related transcription factors A and B,MRTF-A和-B)作為一種強有效的SRF共激活因子,增強SRF與CArG調(diào)控元件的結(jié)合和招募額外的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),KLF4是血小板衍生生長因子(PDGF-BB)引起的重要調(diào)控因子,通過調(diào)控多種機制下調(diào)收縮相關(guān)基因的表達,包括與G/C抑制元件結(jié)合和抑制Myocardin/SRF與CArG調(diào)控元件結(jié)合。SP-1 的磷酸化和核轉(zhuǎn)位促進KLF4的表達,促使VSMCs從分化向去分化轉(zhuǎn)變[6]。FOXO4抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子 Myocardin活性從而抑制 VSMCs 分化表型[7]。YY1通過抑制Myocardin的活性和阻礙SRF與CArG結(jié)合元件下調(diào)VSMC收縮型蛋白,如SM22α、SMα-actin和SMMHC[8]。轉(zhuǎn)錄因子ELK-1是ETS結(jié)構(gòu)域蛋白的三元復合物,p-ELK-1和KLF4共同結(jié)合G/C抑制元件抑制VSMCs收縮表型[9]。

因此,闡明VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制可能為治療血管內(nèi)膜增生性疾病提供理論基礎(chǔ)與潛在治療策略。本文將對近年來調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的細胞信號轉(zhuǎn)導和分子通路的研究做一綜述。

1 MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是屬于一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。配體與酪氨酸激酶受體結(jié)合后引起酪氨酸殘基磷酸化,進而激活大鼠肉瘤蛋白(Rat sarcoma,Ras) 、纖維肉瘤激酶(Rapidly accelerated fibrosarcoma,Raf) 、 絲裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)和MAPK,調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。真核細胞主要存在3條MAPK信號通路,即細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)通路、C-JUN N末端激酶(JNK-SAPK)通路和p38分裂原通路[10]。研究發(fā)現(xiàn),PDGF-BB、表皮生長因子(EGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等細胞因子,激活VSMCs中MAPK級聯(lián)反應調(diào)控VSMC去分化的轉(zhuǎn)錄因子,如SRF、KLF4和Elk-1等從而促VSMC增殖和遷移[11]。近年來,已有大量研究報道MAPK信號通路在內(nèi)膜新生中介導VSMCs增殖和遷移的作用。多種先導化合物,如斑蝥素[12]、百里醌[13]和三七皂甙R1[14]等均通過抑制MAPK信號通路,從而緩解VSMCs遷移以及增殖,進而減緩內(nèi)膜新生形成。

2 TGFβ信號通路

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是屬于一組調(diào)節(jié)細胞生長和分化的TGF-β家族成員之一。哺乳動物中包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3 這三種亞型,以無活性的前體形式,依賴于蛋白酶水解方式發(fā)揮生物學功能。研究表明,TGFβ對于VSMCs表型轉(zhuǎn)化具有重要的調(diào)控作用。TGF-β與TGF-β Ⅱ型受體(TβRⅡ)結(jié)合和磷酸化,激活Smad2/3/4復合物并易位細胞核,結(jié)合VSMCs基因啟動子中的特定DNA序列(Smad binding elements,SBE)或識別收縮表型相關(guān)基因的GC的啟動子序列,從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[15]。

小鼠VSMCs特異性敲除Smad4時,α-SMA、SM22α、calponin、SMMHC以及轉(zhuǎn)錄因子Myocardin和SRF的表達均顯著降低。ShRNA 沉默VSMC中Smad2和Smad3亦得到上述類似的結(jié)果,這表明Smad2/3/4通路是參與TGF-β誘導VSMCs的分化、增殖和遷移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。研究報道,Smad2/3可直接結(jié)合收縮表型特異性基因的啟動子或與SRF/Myocardin相互作用維持VSMCs收縮表型[17]。TGFβ激活SM22α轉(zhuǎn)錄依賴于 Smad3結(jié)合SM22α的第一個外顯子中的SBE并與SRF形成復合體[18]。Ad-Smad3轉(zhuǎn)染和TGFβ共刺激VSMCs通過上調(diào)Krüppel-like因子5(KLF5)抑制收縮表型[19]。除此之外,有文獻報道,TGFβ信號通路可引起MircoRNA(miRNA)變化,參與調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化。在人類冠狀動脈SMCs中,TGFβ1通過P38 AMPK和Smad3/4信號通路,顯著上調(diào)miR-143/145的表達,從而維持SMCs的分化表型[20]。

TGFβ對VSMCs增殖和遷移的調(diào)控作用頗具爭議。大量文獻證實,TGFβ作為VSMCs增殖的強效刺激因子。在移植動脈硬化的內(nèi)膜增生病灶中,TGFβ表達明顯增加。利用TβRI激酶抑制劑 SD-208可減緩小鼠主動脈同種異體移植物中的內(nèi)膜增生[21]。在體外實驗中,敲除Smad4或者下調(diào)Smad2和Smad3蛋白顯著抑制VSMCs的增殖和遷移[16]。在大鼠頸動脈損傷模型中,Smad3 的過表達激活ERK/MAPK級聯(lián)反應從而加劇VSMCs增殖[22]。上調(diào) TGF-β/Smad3 信號通路也被證明可刺激經(jīng)典 Wnt 的分泌,進而加強β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性促進 VSMCs 增殖[23]。但是,另外有研究表明,激活TGF- RII/smad2信號通路可降低PDGF-BB誘導的VSMCs增殖和遷移[23]。他莫昔芬誘導的SMCs特異性敲除TβRII成年小鼠表現(xiàn)出SMC基因表達異常和主動脈增厚等病變,這一結(jié)果表示VSMCs 基礎(chǔ)狀態(tài)下TGF-β信號通路有助于維持出生后主動脈穩(wěn)態(tài)[24]。綜上,TGF-β對VSMCs的調(diào)控呈現(xiàn)截然不同的結(jié)果,可能與影響下游信號通路密切有關(guān),從而共同維持內(nèi)部穩(wěn)態(tài)。

3 PI3K-Akt-mTOR信號通路

磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性,其p85亞基被G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或受體酪氨酸激酶(RTK) 激活后, p110 催化亞基轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上并催化磷脂酰肌醇(4,5)-雙磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸[phosphatidylinositol (3,4,5) -triphosphate,PIP3],其中PTEN可使PIP3 去磷酸化為 PIP2負調(diào)控PI3K 活性。第二信使PIP3招募并促使PDK1磷酸化 AKT,并將信號傳遞給雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)調(diào)控下游核糖體 S6 激酶(p70S6K)和4E 結(jié)合蛋白 1(4EBP1)等靶點從而參與VSMCs表型轉(zhuǎn)化和促進內(nèi)膜新生[25]。

大量文獻證明, PI3K/AKT/mTOR信號通路在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中起到促進去分化的作用。當VSMCs特異性缺失PTEN時,PI3K-AKT-mTORC1信號通路持續(xù)激活導致 SM22α和鈣調(diào)蛋白等收縮表型標志物減少以及加劇內(nèi)膜新生[26]。在正常生理狀態(tài)下,PETN與SRF的 N端結(jié)構(gòu)域相互作用促進SRF與VSMCs收縮表型基因的啟動子元件結(jié)合維持其收縮表型[27]。除此之外,mTORC1復合物在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中亦起到關(guān)鍵作用。研究表明,mTORC1/S6K通路誘導VSMCs去分化,而雷帕霉素治療可恢復VSMCs收縮表型并減少膠原合成[28]。雷帕霉素逆轉(zhuǎn)mTORC1/S6K對PI3K的抑制作用從而選擇性激活AKT2-FOXO4, FOXO4從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)解除對Myocardin的抑制作用,從而誘導SMMHC、SM-α-actin和鈣調(diào)蛋白的表達[29]。綜上,PI3K/AKT/mTOR信號通路有望成為防治血管內(nèi)膜新生相關(guān)疾病潛在靶點。

4 Notch信號通路

Notch信號通路是由受體Notch1、Notch2和Notch3,配體Jag 1(Jagged)和DLL (Delta-like) 4配體以及細胞內(nèi)效應分子組成。經(jīng)典Notch信號通路激活后,ADAM金屬蛋白酶和γ-分泌酶分別切割Notch受體的S2和S3位點,釋放Notch胞內(nèi)片段(Notch intracellular doain,NICD)并轉(zhuǎn)移至細胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL蛋白結(jié)合,調(diào)控下游靶基因HES(Hairy/enhancer of split)和HEY(Hey-hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif family members)等在內(nèi)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-ring-helix,bHLH)家族轉(zhuǎn)錄因子,從而調(diào)控細胞的生長和增殖[30]。

目前研究表明,Notch信號在內(nèi)膜新生中調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)化的作用尚不明確。大部分研究顯示Notch信號通路是VSMCs分化必不可少。在血管生成過程中,VSMCs表達Notch受體與血管內(nèi)皮細胞Jag1配體結(jié)合激活Notch信號通路從而誘導α-SMA和SM-22α等收縮表型標記物表達[31]。 腺病毒過表達VSMCs中NIC片段,并利用 RNA轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)分析和比較基因表達譜。結(jié)果表明,Notch信號通路的持續(xù)激活導致VSMCs收縮表型相關(guān)基因如SMMHC、Myocd、Cnn-1等表達增強[32]。在內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞共培養(yǎng)的3D細胞模型中,siRNA干擾內(nèi)皮細胞表達Jag1,可使平滑肌細胞Notch3和收縮表型標記蛋白SM22α和calponin降低[33]。另有研究證明Jag1/Notch信號通路靶向激活miR143/145從而間接調(diào)控VSMC分化相關(guān)的基因表達[34]。但仍有少部分研究支持Notch信號通路可促進VSMCs向合成型轉(zhuǎn)化。在體外實驗中,組成性活化人VSMCs的 NICD1和NICD3持續(xù)激活Notch信號通路從而下調(diào)平滑肌收縮表型標記物α-actin、calponin、myosin和smoothelin表達[35]。

由于體內(nèi)復雜的生理環(huán)境和病理因素,Notch信號通路在內(nèi)膜新生中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。對人動脈內(nèi)膜切除術(shù)后動脈粥樣硬化斑塊的血管組織進行Notch蛋白免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)Notch1定位于內(nèi)皮細胞,而Notch2和Notch3定位于中膜和內(nèi)膜的VSMCs,且 Notch3蛋白定位與SMMHC高度重合以及表達豐富。由此可得出 Notch3可能是人類動脈粥樣硬化斑塊中更穩(wěn)定的SMC標記物[36]。在肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)小鼠模型中,Notch3標記的VSMCs亞群是新生內(nèi)膜細胞的主要來源[37]。因此,抑制Notch信號通路可能改善內(nèi)膜新生。大量研究表明,Notch1和Notch3可促進VSMCs增殖和遷移。研究證實,VSMCs中Notch信號通路特異性失活可減少動脈粥樣斑塊中纖維帽的產(chǎn)生[38]。局部血管周圍遞送 Notch 1 siRNA 可顯著抑制血管損傷誘導的內(nèi)膜新生[39]。在小鼠靜脈移植模型中,γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch1信號通路從而減緩靜脈移植內(nèi)膜增生[40]。此外,可溶性Jagged-1被證明可阻斷Notch1/Hey2信號通路發(fā)揮治療小鼠靜脈移植再狹窄[41]。相反,Notch2在內(nèi)膜新生中扮演不同的角色。研究發(fā)現(xiàn), Notch2主要定位于受損血管非增殖區(qū)域,正向調(diào)節(jié) VSMC 中 Jag-1 誘導的 p27kip1表達和停滯生長。因此,Notch2 的激活可能負向調(diào)節(jié) VSMC 增殖以減輕血管病變的嚴重程度[42]。但有趣的是,VSMCs特異性缺失Notch2對血管內(nèi)膜新生影響不大,這一結(jié)果表明血管重塑過程中存在其他途徑和介質(zhì)補償Notch2的缺失[43]。Baeten等[44]進一步研究證實Notch2和Notch3對PDGF-BB誘導的增殖具有相反的作用。PDGF-BB處理降低Notch2表達但增加Notch3表達。雖然Notch2和Notch3在調(diào)節(jié)VSMC增殖方面的作用相反,但其均促進收縮分化。

綜上所述,Notch通路在VSMC表型調(diào)控中作用的不一致性,可能是由于配體的特異性和選擇性激活不同的Notch家族成員。因此,選擇特異性靶向 Notch配體或受體有助于精準防治血管重構(gòu)類疾病。

5 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt是一種以自分泌或旁分泌發(fā)揮作用的分泌型糖蛋白。Wnt/β-catenin信號通路由分泌蛋白Wnt家族、Frizzled家族跨膜受體家族、糖原合成激酶3(GSK3)、腺瘤病大腸桿菌APC、Axin、β-catenin以及TCF/LEF(T細胞因子/淋巴增強因子)家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組成。正常狀態(tài)下,β-catenin與鈣粘蛋白相互作用固定在細胞膜上介導細胞黏附,或在胞質(zhì)中通過 APC/Axin/GSK-3β 復合體磷酸化后進行泛素化降解。 當Wnt/β-catenin信號通路激活時可導致β-catenin在細胞質(zhì)中積累并易位至細胞核,作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子有助于靶基因的TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄激活[45]。

近年研究表明,Wnt/β-catenin信號通路參與VSMCs表型轉(zhuǎn)化從而促進內(nèi)膜新生形成。在頸總動脈結(jié)扎小鼠模型中,β-catenin在內(nèi)膜新生VSMCs中高度表達。Wnt/β-catenin促進 VSMCs增殖和遷移主要通過促增殖基因Cyclin D的上調(diào)和增殖抑制基因p21的下調(diào)[46-47]。因此,抑制β-catenin可作為改善血管狹窄的潛在療法。在頸動脈結(jié)扎后,VSMCs特異性敲除 β-catenin抑制新生內(nèi)膜VSMCs增殖,進而減緩血管腔內(nèi)狹窄。Mmp2、Mmp9、Sphk1和S1pr1等合成表型標志物在β-catenin缺失的VSMCs中表達減少。應用β-catenin抑制劑PKF118-310和ICG-001治療發(fā)現(xiàn)以劑量依賴的方式抑制VSMCs的增殖[48]。Williams等[49]證實Ad-TOPTK腺病毒選擇性地靶向殺死β-catenin激活的細胞可抑制新生內(nèi)膜的形成,這表明該基因治療方法可能具有治療內(nèi)膜新生的潛力,從而降低靜脈移植和支架動脈的失敗率。綜上,研究選擇性靶向抑制Wnt/β-catenin通路可為治療血管重塑疾病提供潛在靶點。

6 Hippo信號通路

Hippo信號通路是由多個激酶及其下游轉(zhuǎn)錄因子組成抑制細胞生長的通路。目前,Hippo信號通路的胞外信號通路和膜受體還不明確。當感知到外界信號時,胞內(nèi)啟動磷酸化MST1/2和LATS1/2激酶級聯(lián)反應并作用于下游效應因子YAP(yes-associated protein)和TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)誘導其降解。反之,YAP或TAZ易位進入細胞核與轉(zhuǎn)錄增強子激活域(TEADs)形成復合物,調(diào)控增殖基因表達[50]。研究表明,在發(fā)育期和成熟期中Hippo信號通路對VSMCs表型表現(xiàn)出不同的調(diào)控作用。小鼠VSMCs特異缺失TEAD1由于血管壁發(fā)育不良在第14.5天出現(xiàn)胚胎致死性,這表明Hippo信號通路參與胚胎期VSMCs分化調(diào)控過程,是正常動脈血管發(fā)育所必需的[51]。但VSMCs在靜息狀態(tài)時, miR-15b/16靶向抑制Hippo/YAP從而維持VSMCs的收縮表型[52]。YAP/TAZ誘導VSMCs合成型主要通過阻礙SRF/Myocardin復合物與VSMC收縮基因啟動子CArG區(qū)域的結(jié)合和促進TEAD 靶基因CyclinD1表達從而發(fā)揮生物學功能[53-54]。

近來研究表明,Hippo/YAP信號通路在血管再狹窄中起到重要作用。大鼠頸總動脈結(jié)扎誘導的動脈重塑模型中,其模型組頸總動脈YAP、TAZ和TEAD1蛋白水平明顯表達增加。VSMCs特異性敲除TEAD1和YAP可抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化和減緩小鼠內(nèi)膜增生[55]。Hippo信號通路除了直接調(diào)控增殖基因外,近年來被證明可上調(diào)PDGF-BB/PDGFRβ信號通路,參與 VSMCs增殖和新內(nèi)膜形成。抑制VSMCs內(nèi)源性 PDGFRβ可抑制其YAP1 的基礎(chǔ)表達,表明血管損傷誘導的 PDGFRβ表達正反饋調(diào)節(jié) YAP1 的表達[56]。除此之外,亦有文獻報道Hippo信號通路與mTORC1通路協(xié)同調(diào)控細胞的生長和增殖。研究表明,TEAD1通過轉(zhuǎn)錄因子SLC1A5,激活mTORC1信號通路,促進VSMCs增殖和新生內(nèi)膜形成[57]。由于Hippo信號通路胞外信號通路不明確,有文獻報道GPCR信號會與Hippo信號通路發(fā)生串聯(lián)作用。3′-5′環(huán)磷酸腺苷(cAMP)可通過PKA磷酸化和降解YAP/TAZ從而抑制TEAD誘導的增殖和遷移[58]。血栓素A2受體信號通路也被證明可調(diào)控YAP/TAZ去磷酸化并入核從而促進VSMCs的遷移和增殖[59]。同時,有研究發(fā)現(xiàn)YAP的轉(zhuǎn)錄水平受SP-1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。利用SP-1抑制劑光輝霉素藥物洗脫支架顯著抑制YAP的表達從而減輕血管成形術(shù)中的支架內(nèi)再狹窄[60]。因此,激活Hippo或抑制YAP可能成為減少內(nèi)膜形成的潛在治療靶點。

7 總結(jié)與展望

綜上所述,VSMCs具有高度可塑性,在各種因素刺激下發(fā)生可逆地表型轉(zhuǎn)化。VSMCs在分化表型和去分化表型之間的可逆轉(zhuǎn)變是維持正常血管發(fā)育、成熟、修復和再生的重要組成部分,參與生物合成、增殖、遷移和收縮等多種生物學功能。本文綜述主要闡述MAPK、TGFβ、Notch、PI3K-AKT-mTOR、Wnt/β-catenin以及 Hippo信號通路調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化在內(nèi)膜新生中的作用(見圖1)。但是,目前關(guān)于內(nèi)膜新生中VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用尚不明確。在內(nèi)膜新生這一復雜的病理過程中,VSMCs表型轉(zhuǎn)化不僅受到某個信號蛋白的影響,且多個信號通路網(wǎng)絡參與調(diào)控其過程。因此,今后的研究工作重點主要探討各個信號分子以及各個信號通路之間的相互聯(lián)系以及在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用,從而影響血管重塑疾病。識別驅(qū)動VSMCs可塑性、異質(zhì)性和表型轉(zhuǎn)化的分子機制為防治血管重塑疾病提供潛在靶點。

圖1 VSMCs表型轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導