交叉引物擴(kuò)增法檢測食品中大腸桿菌不耐熱腸毒素的探討

李偉 任重杰

摘 要：CPA技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)相比，既避免了對昂貴的儀器設(shè)備的依賴性，又能減少檢測費(fèi)用，且由于其特異性高、靈敏度高，可大幅度提高檢測速度。本文基于交叉引物擴(kuò)增法技術(shù)及應(yīng)用，設(shè)計(jì)了使用該方法檢測食品中大腸桿菌不耐熱腸毒素的實(shí)驗(yàn)，以期能夠?yàn)橄嚓P(guān)人員提供借鑒與幫助。

關(guān)鍵詞：交叉引物擴(kuò)增法；大腸桿菌；不耐熱腸毒素

Detection of Heat Labile Enterotoxin of Escherichia coli in Food by Cross Primer Amplification

LI Wei， REN Zhongjie

（Yuncheng County Inspection and Testing Center， Heze 274700， China）

Abstract： Compared with the conventional PCR technology， CPA technology can not only avoid the dependence on expensive instruments and equipment， but also reduce the detection cost， and because of its high specificity and sensitivity， it can greatly improve the detection speed. Based on the technology and application of cross primer amplification， this paper designed an experiment using this method to detect heat labile enterotoxin of Escherichia coli in food， in order to provide reference and help for relevant personnel.

Keywords： cross primer amplification; Escherichia coli; heat labile enterotoxin

近年來，由于食品行業(yè)的迅速發(fā)展，食源性致病微生物引發(fā)的食物中毒、食源性疾病的發(fā)生率不斷增加，給人們的健康和生活帶來極大的威脅，同時也給我國的公共健康和經(jīng)濟(jì)帶來了巨大損害。由于食物環(huán)境的原因，大腸桿菌不耐熱腸毒素一直是引起食物中毒的主要原因。因此，快速、靈敏地檢測出大腸桿菌不耐熱腸毒素對食品安全管理具有重要意義。

1 交叉引物擴(kuò)增法技術(shù)及應(yīng)用

1.1 交叉引物擴(kuò)增方法概述

交叉引物擴(kuò)增技術(shù)是一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。交叉引物擴(kuò)增技術(shù)采用一種DNA聚合酶，在溫度為62 ℃的恒溫下保溫1 h，即可特異、快速、高效地完成核酸的擴(kuò)增[1]。本技術(shù)與快速檢測技術(shù)（如快速檢測紙條、一次性核酸檢測設(shè)備）的組合，為臨床快速檢測、分子診斷、檢疫和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的檢測方法。

1.2 交叉引物擴(kuò)增方法特點(diǎn)

交叉引物擴(kuò)增方法在檢驗(yàn)檢疫、檢測突發(fā)傳染病和醫(yī)院的早期篩查中得到了廣泛的應(yīng)用。由于CPA的成本較低，CPA的擴(kuò)增只能在離心機(jī)和諸如水浴、金屬浴等簡單的恒溫裝置中進(jìn)行。由于其操作簡單，且對操作者不具備太高的操作水平要求，一般人只要經(jīng)過簡單的訓(xùn)練或自學(xué)就可熟練使用，這為推廣這項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)造了良好的條件。該方法具有很好的特異性，能為6個目標(biāo)基因區(qū)設(shè)計(jì)6～8條特異引物，以確保反應(yīng)的特異性[2]。同時，其靈敏度高，可從少量復(fù)制中分離到目標(biāo)基因，其敏感性能夠達(dá)到10個拷貝。產(chǎn)品的檢測方法簡單，特異性高，可用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行鑒定，也可將熒光染料添加到擴(kuò)增產(chǎn)品中，根據(jù)顏色的改變來判斷，也可采用一次性的抗污染核酸檢測設(shè)備進(jìn)行檢測，降低了假陽性的發(fā)生概率。

1.3 交叉引物擴(kuò)增反應(yīng)原理

CPA擴(kuò)增系統(tǒng)主要由置換引物、交叉引物和Bst DNA聚合酶組成，通過Bst DNA聚合酶的鏈替換，可實(shí)現(xiàn)DNA的連續(xù)重復(fù)擴(kuò)增。CPA的擴(kuò)增過程包括以下幾個步驟。①生成具有交叉引物位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。PFs的5末端和反交引物PRa的雜交序列是一致的。在交叉引物的前面，排列著替代引物。取代引物的濃度比交叉引物要低。BST DNA聚合酶可通過替換的方式，在不同的位置上不斷地延伸出不同的交叉引物。固定的前鏈5末端是由替換引子和交叉引子不斷地?cái)U(kuò)展而形成的。PFa也是同樣的原理，它可通過伸展和排列來形成另外一條固定的鏈條[3]。②擴(kuò)增交叉引物。該排列鏈由末端新生成的引物位點(diǎn)構(gòu)成，并將其3端交叉引物的導(dǎo)入點(diǎn)模板。利用引物的不斷雜交、延伸以及擴(kuò)增產(chǎn)物自身的雜交延伸，可形成多個引物雜交，加快擴(kuò)增進(jìn)程。③對產(chǎn)品的生成進(jìn)行檢測。在反應(yīng)完成后，會產(chǎn)生一種單鏈、雙鏈、半雙鏈的混合物。

1.4 交叉引物擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測方法

CPA方法得到的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上顯示為一條帶狀。通過電泳觀察，可判斷是否出現(xiàn)了一個梯度條?？蓪⑶度氲臒晒馊玖希ㄒ忆邋V、SYBR Green I）等加入反應(yīng)系統(tǒng)，且根據(jù)反應(yīng)溶液中熒光強(qiáng)度的改變判定產(chǎn)品的生成，從而判定是否有擴(kuò)增反應(yīng)。若將1 μm SYBR GreenI型熒光染料加入雙鏈DNA的小溝中，在產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物時，可與DNA雙鏈連接，使熒光染料從橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色[4]。利用一次性的核酸檢測儀和核酸膜色譜快速檢查紙等產(chǎn)品，對顯色試紙進(jìn)行目視判讀，只在C質(zhì)控區(qū)處有一條紅線時，判定為陰性，即沒有反應(yīng)；若有兩條紅線，分別在T檢測區(qū)和C質(zhì)控區(qū)，判定為陽性，表示有反應(yīng)，若無紅線，則判定為無效。

2 材料與方法

2.1 模板的制備

用麥康凱瓊脂平板37 ℃下培養(yǎng)C83903（LT）菌株16～24 h。用LB液為載體，在37 ℃下，用200 r·min-1的振蕩試驗(yàn)研究了該菌的生長特性。將5 mL的培養(yǎng)基，在10 000 r·min-1下進(jìn)行3 min的離心，將上清液作為DNA模板，貯存于-20 ℃的無菌環(huán)境下備用。

2.2 生豬肉人工隨機(jī)污染

用麥康凱培養(yǎng)基C83903（LT'*）菌株在37 ℃下過夜培養(yǎng)，稀釋1 000倍后，將其稀釋菌液與無LT毒素的豬肉樣品進(jìn)行混勻。在10 000 r·min-1的條件下離心3 min后，將上清液排出，用1 mL 0.9%的生理鹽水進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，再用腸毒素大腸埃希氏菌對樣本進(jìn)行人工污染，并進(jìn)行記錄。

2.3 特異性檢測

采用14個試驗(yàn)菌（6個大腸桿菌和8個非大腸桿菌），將其與LAMP法進(jìn)行對比。反應(yīng)完成后，將預(yù)先滴入的SYBR GreenI型熒光染料與所述擴(kuò)增產(chǎn)品相混合，在自然和紫外線下進(jìn)行觀察，使用濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

2.4 人工污染生豬肉樣本的檢測

采用CPA法、LAMP法、qPCR法，對人工感染經(jīng)產(chǎn)腸毒素的大腸埃希氏菌生豬肉樣本共計(jì)50例進(jìn)行了檢驗(yàn)，采用DNA萃取試劑對豬肉樣品進(jìn)行處理，以DNA基因組為模板，以2%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測CPA、LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，并與qPCR進(jìn)行對比。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測方法的建立與優(yōu)化

該引物的特異性較強(qiáng)， 在60 ℃、60 min條件下可大量擴(kuò)增LT毒素，用2%的瓊脂糖電泳法檢測，其陽性呈不規(guī)則的梯形條紋，而在陰性對照組中無條帶。用華峰管另一頭的SYBR GreenI染料與反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行混合，用肉眼觀察，在正試管中呈綠色，陰性試樣為橙色；在紫外線的作用下，陽性管的熒光呈綠色，而陰性管則不變，如圖1所示。

通過實(shí)驗(yàn)，對反應(yīng)溫度、Bst聚合酶、dNTPs、Mg、甜菜堿濃度和擴(kuò)增時間進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)62 ℃、64 ℃、66 ℃是最佳的擴(kuò)增溫度；采用8 U/管Bst聚合酶法進(jìn)行擴(kuò)增，得到的條帶最明顯，最佳的Bst聚合酶濃度是8 U/管；在0.3 mmol·L-1 dNTPs中，dNTPs的擴(kuò)增條件最為明顯；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在45 min內(nèi)，樣品中有一條明顯的階梯狀條紋，但隨著反應(yīng)時間的延長，條帶的亮度沒有顯著的改變，因此45 min是最佳的擴(kuò)增時間。按上述原理進(jìn)行CPA反應(yīng)，最佳Mg濃度為2.0 mmol·L-1，甜菜堿濃度為0.8 mol·L-1。

3.2 特異性試驗(yàn)

采用CPA法，對14個不同的細(xì)菌進(jìn)行了特異性測定，并重復(fù)了3次。用瓊脂糖電泳法測定了2個帶有LI+基因的菌株，其余12個是未攜帶LI+基因的菌株，與LAMP的檢測結(jié)果相吻合，證明了該方法的特異度較高。

3.3 人工污染生豬肉樣本檢測結(jié)果

采用CPA法和LAMP法，對50例無菌感染的豬肉樣品進(jìn)行了快速檢測。結(jié)果表明，CPA、LAMP法各檢測到7個帶有LT的基因，與qPCR的檢測結(jié)果基本相符，其檢出率為14%。

4 結(jié)論與討論

本文通過優(yōu)化反應(yīng)溫度、酶濃度、dNTPs濃度等因素，構(gòu)建了一種快速、特異、靈敏度高的新型CPA探針。與LAMP法比較，該方法特異性強(qiáng)，從加樣到反應(yīng)結(jié)束，只需1.5 h就能完成目標(biāo)基因的特異擴(kuò)增，而對非攜帶目標(biāo)基因的鑒定結(jié)果為陰性[5]。本文采用人工污染的生豬肉模擬樣品，采用熒光PCR技術(shù)，采用CPA、LAMP法進(jìn)行人工感染，其陽性檢出率達(dá)到14%（7/50），表明CPA是一種新的檢測技術(shù)，可滿足食品衛(wèi)生領(lǐng)域微生物質(zhì)量檢驗(yàn)的需要。

CPA擴(kuò)增時，由于系統(tǒng)中DNA的連續(xù)合成，會導(dǎo)致大量的焦磷酸鎂沉淀，因此可通過是否有白色沉淀來判斷，但當(dāng)LT毒素基因擴(kuò)增時，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的乳白色沉淀，而用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測，可看到不同尺寸的區(qū)域帶階梯狀結(jié)構(gòu)[6]。為了避免在打開瓶蓋時產(chǎn)生的大量氣溶膠對周圍環(huán)境的影響，本文選擇廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的華峰管進(jìn)行可視化檢測，將SYBR綠色I(xiàn)型染料和反應(yīng)系統(tǒng)的混合液加入華峰管，使二者在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行混合，以確定反應(yīng)的效果，有效地防止了氣溶膠所致的交叉污染。

綜上，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是一種非常危險(xiǎn)的病原體，會引起食源性疾病，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法，對于保證食物安全和人體的健康非常重要。交叉引物擴(kuò)增法具有時間短、成本低、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，且無需特殊、昂貴的儀器和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，為食品致病菌的檢測開辟了一條新途徑。

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作者簡介：李偉（1982—），男，山東菏澤人，大專，助理工程師。研究方向：食品檢測。