基于DNA條形碼、多重PCR、熒光定量PCR對九香蟲及其混偽品進(jìn)行鑒定

王孟虎　孫一帆　左亞鋒　孟祥松　栗進(jìn)才　俞浩　許亮　康廷國

摘 要：目的：基于DNA條形碼、多重PCR、熒光定量PCR對市售九香蟲、小皺蝽及其摻雜樣品進(jìn)行鑒定。方法：利用通用引物COI進(jìn)行擴(kuò)增并測序，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹、二級結(jié)構(gòu)并計算種內(nèi)種間遺傳距離；基于COI序列設(shè)計九香蟲、小皺蝽特異性引物并進(jìn)行電泳，比較電泳條帶；基于COI引物進(jìn)行SBYR熒光定量PCR，觀察單一樣品及不同比例混合樣品的熔解曲線及其Tm值。結(jié)果：利用MEGA 11.0軟件分析顯示九香蟲、小皺蝽分別單獨(dú)聚為一支，其種間遺傳距離均大于0.22，種內(nèi)遺傳距離均小于0.02；兩者的二級結(jié)構(gòu)在整體框架具有明顯不同。基于特異性引物擴(kuò)增的九香蟲、小皺蝽均出現(xiàn)單一條帶，不同比例的混合樣品與混合引物進(jìn)行擴(kuò)增均出現(xiàn)2條條帶?；贑OI引物擴(kuò)增的九香蟲、小皺蝽熔解曲線Tm值分別為75℃、89℃，不同比例混合樣品的熔解曲線Tm值分別在75.00℃、89.00℃出現(xiàn)兩個峰值。結(jié)論：DNA條形碼能夠及二級結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確鑒定九香蟲、小皺蝽；多重PCR及基于SBYR熒光定量PCR不僅能夠準(zhǔn)確對單一九香蟲、小皺蝽進(jìn)行鑒定，也能夠?qū)Σ煌壤幕旌蠘悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；多重PCR；熒光定量PCR；二級結(jié)構(gòu)；九香蟲

中圖分類號：R932? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2023）02-0060-06

九香蟲為蝽科昆蟲九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥體[1]，其藥用歷史悠久，是一種藥用價值較高、營養(yǎng)價值較高的昆蟲類中草藥和保健食品[2]，具有抗菌[3]、抗癌[4]、鎮(zhèn)痛[5]、抗氧化[6]及改善生殖器官[7]的作用。已報道的九香蟲化合物包括脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、臭氣類、核苷類、多巴胺類化合物及其他營養(yǎng)成分。九香蟲體內(nèi)脂肪酸類化合物最多，包括油酸、亞油酸、軟酸、軟亞油酸、硬亞油酸等[8]。由此可見，九香蟲脂肪油主要是不飽和脂肪酸，占70%以上。另外九香蟲還富含維生素、微量元素、磷脂、蛋白質(zhì)及氨基酸，維生素中含有的維生素A及維生素C的含量較高。

市售九香蟲常見的混偽品是小皺蝽，小皺蝽除略小于九香蟲外，其他形態(tài)特征與其相似，小皺蝽常冒充小的九香蟲進(jìn)行銷售，若兩者進(jìn)行摻雜，極難鑒別。黃秋強(qiáng)等[9]人借助生物顯微鏡及掃描電鏡對九香蟲、小皺蝽進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)兩者的區(qū)別主要在腹背板。鞠康等[10]人對九香蟲及其混淆品微性狀鑒別研究，發(fā)現(xiàn)在頭部、前胸背板、小盾片、腹側(cè)緣、前翅、生殖節(jié)等方面均有較明顯的區(qū)別。李莎等人[11，12]發(fā)現(xiàn)九香蟲及其混偽品藥材性狀和顯微鑒別可以通過腹背板進(jìn)行鑒別；通過DNA條形碼技術(shù)和九香蟲的線粒體基因測序技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定九香蟲及其混偽品。

傳統(tǒng)鑒定方法可以通過性狀、顯微進(jìn)行鑒定，但其無法對摻雜一定比例的九香蟲藥材準(zhǔn)確鑒定摻雜基原。多重PCR技術(shù)是基于每個物種基因設(shè)計特異性引物，基于特異性引物擴(kuò)增的產(chǎn)物堿基長度不同，進(jìn)行電泳后其條帶位置不同，進(jìn)而對物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。利用SBYR熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其熔解曲線與堿基長度及堿基組成比例有關(guān)，設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增的產(chǎn)物堿基組成及長度不同，其熔解曲線亦不相同，根據(jù)熔解曲線Tm值不同進(jìn)行對物種進(jìn)行鑒定[13]。

1 材料與試劑

1.1 材料

從康美市場購買九香蟲正品5批次、小皺蝽5批次，九香蟲標(biāo)記分別為JXC-01？JXC-05，小皺蝽標(biāo)記分別為XZC-01？XZC-05。所有樣品均經(jīng)孟祥松主任中藥師鑒定，所有樣品儲存均存放在亳州學(xué)院冷庫內(nèi)。

1.2 儀器與試劑

實(shí)時熒光定量PCR（伯樂，CFX Connect），PCR儀（伯樂，T100）、低溫冷凍研磨儀（上海凈信，JX-CL）、全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀（上海培清，JS-2000）、JOANLAB多功能混勻儀（群安實(shí)驗儀器、VN-500Pro）、IKA漩渦混合器（艾卡，Vortex-1）、移液槍（賽默飛世爾）（ThermoFisherF3）、電泳儀（北京六一，EPS300）、粉碎機(jī)（美的，MJ-FP12X2-100）、Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒（生工，F(xiàn)C09KA4055）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（2000bp）（生工、B500350-0500）、SYBRGreen染料Mix（生工，I308KA3871）、4SGelRed（BBI，A616697-0500）、2×TaqMasterMix（諾唯贊，7E341F9）、TAE（50×）（biosharp，691176248）、瓊脂糖（恒奧生物，EZ6688C178）。

2 方法

2.1 DNA提取

取九香蟲、小皺蝽適量，用粉碎機(jī)粉碎，稱量粉末約30mg加入1.5mL離心管中，并向其中加入180uL的Buffer ACL及研磨珠，在低溫冷凍研磨儀研磨1min（60次/秒），低速離心去除泡沫，剩余操作均與Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒說明書相同，提取的DNA放置在-20℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件

COI序列擴(kuò)增正反引物詳見表1。PCR擴(kuò)增體系為50μL，含有正反向引物各2.0μL（2.5μmol/L），穩(wěn)定劑和溴酚藍(lán)燃料（TaqMasterMix）25μL，總DNA4.0μL（約40ng），加去RNA酶水17μL。擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min（35個循環(huán)）；72℃延伸5min。

2.3 電泳檢測DNA質(zhì)量

使用2.0%的瓊脂糖凝膠液倒入電泳槽中，靜置30min，用移液槍吸取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0μL、Marker 2.0μL，在120V電壓下電泳25min，取出放置凝膠成像系統(tǒng)中分析，與Marker比較后無雜帶并且清晰時拍照保存圖像。

2.4 測序

擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物委托上海生工進(jìn)行測序，測序產(chǎn)物為PCR反應(yīng)物，測序前PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化再進(jìn)行雙向測序，獲得雙向測序原始序列堿基及峰圖。

2.5 數(shù)據(jù)處理

測序所得的原始序列利用CodonCode Aligner 17.0軟件進(jìn)行查看、拼接校對，去除低質(zhì)量的序列及引物區(qū)，以堿基質(zhì)量不低于20為標(biāo)準(zhǔn)。將測得的COI序列用軟件MEGA11.0比對分析，去除多余的堿基?；贙2P模型進(jìn)行種間變異位點(diǎn)和遺傳距離分析，基于COI序列構(gòu)建二級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap（1000次重復(fù)）檢驗各分支的支持率。

2.6 特異性引物設(shè)計

根據(jù)所測的COI基因序列，利用軟件MEGA 11.0比對找到變異位點(diǎn)，利用Oligo 7.0軟件手動設(shè)計特異性引物并在NCBI上進(jìn)行引物Blast分析，確保設(shè)計的引物對九香蟲、小皺蝽均具有特異性，且其PCR擴(kuò)增長度不同，設(shè)計的引物詳見表1。

2.7 多重PCR擴(kuò)增

將特異性引物分別與對應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功后進(jìn)行電泳，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶位置。將九香蟲、小皺蝽DNA按1：1、3：1、6：1、9：1混合，加入混合引物和單一引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，觀察電泳條帶位置。

2.8 多重?zé)晒舛縋CR[15]

多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增程序為：95℃ 3min；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 15s，45cycles；熔解曲線程序為：95℃ 1min；58℃ 30s，0.5℃/min，升溫至95℃。PCR反應(yīng)體系為SYBR Green Mix 12.5μL，正反引物各1μL，模板2μL，加雙蒸水至25μL。將特異性引物、模板、SBYR染料等混合后分別進(jìn)行擴(kuò)增，記錄其擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線Tm值。將九香蟲、小皺蝽DNA按1：1、3：1、6：1、9：1混合，分別加入混合引物進(jìn)行擴(kuò)增，記錄其熔解曲線Tm值。

3 結(jié)果

3.1 DNA擴(kuò)增檢測

基于COI引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物并分別進(jìn)行電泳，電泳條帶清晰，表明DNA提取及擴(kuò)增成功。基于COI引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，其熔解曲線峰為單峰，說明PCR擴(kuò)增成功，詳見圖1。

3.2 種內(nèi)、種間遺傳距離分析

將拼接、去引物的COI堿基序列利用MEGA 11.0軟件進(jìn)行比對，長度為555bp。九香蟲種內(nèi)遺傳距離為0.00～0.004，小皺蝽種內(nèi)遺傳距離為0.00～0.009，種間遺傳距離為0.225～0.233，具體詳見表2。九香蟲與小皺蝽種間堿基不同位點(diǎn)有106個，九香蟲種內(nèi)堿基變異位點(diǎn)有2個，小皺蝽種內(nèi)堿基變異位點(diǎn)有6個。由表可知，九香蟲、小皺蝽種內(nèi)遺傳距離均小于0.020，種間遺傳距離遠(yuǎn)大于0.020，說明利用遺傳距離能夠準(zhǔn)確鑒別九香蟲、小皺蝽。

3.3 二級結(jié)構(gòu)

利用載體家（https：//www.vectorbuilder.cn/tool/dna-secondary-structure.html）在線網(wǎng)頁對所有樣品的堿基序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)構(gòu)建，詳見圖2。由圖可知，JXC-01～JXC-03二級結(jié)構(gòu)基本相同，JXC-04、JXC-05二級結(jié)構(gòu)基本一致，JXC-01與JXC-04相比，種內(nèi)二級結(jié)構(gòu)主要有3處不同。XZC-01、XZC-02種內(nèi)二級結(jié)構(gòu)基本相同，XZC-03、XZC-04、XZC-05與XZC-01相比分別有2、1、2處主要結(jié)構(gòu)不同。從構(gòu)建二級結(jié)構(gòu)中可以看出，九香蟲種內(nèi)二級結(jié)構(gòu)大致相同，小皺蝽種內(nèi)二級結(jié)構(gòu)雖有1～2處不同，但整體框架是相同的。而九香蟲與小皺蝽在種間的二級結(jié)構(gòu)整體框架是不同的，具有明顯的不同。說明利用二級結(jié)構(gòu)不僅可以對種間進(jìn)行鑒別，對種內(nèi)有少量堿基變異的序列也能夠顯示出來。對于種內(nèi)變異較少或遺傳距離較近的堿基序列，可以通過構(gòu)建二級結(jié)構(gòu)來更直觀地看到發(fā)生的堿基變異。

3.4 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

從GenBank上下載九香蟲同屬物種黑兜蟲（A. nigriventris Westwood）、小皺蝽同屬物種刺桐蝽（C. siccifolia Westwood）的COI堿基序列，序列號分別是JQ387600.1、MG838353.1，簡稱分別是GB-HDC、GB-CTC。對九香蟲、小皺蝽測序獲得的堿基序列及GenBank上下載的堿基序列利用MEGA11.0軟件進(jìn)行比對分析，設(shè)置bootstrap（1000次重復(fù)），構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，詳見圖3。由圖可知，九香蟲、小皺蝽、黑兜蟲、刺桐蝽分別單獨(dú)聚為一支，九香蟲與黑兜蟲聚為一大支，小皺蝽、刺桐蝽聚為一大支，這與現(xiàn)代分類親緣關(guān)系一致。說明利用NJ系統(tǒng)發(fā)育樹不僅能夠?qū)⑺姆N物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，也能夠判別物種的親緣關(guān)系，對現(xiàn)代物種分類提供一定的技術(shù)支持。

3.5 多重PCR特異性引物檢測

將九香蟲、小皺蝽的特異性引物分別與對應(yīng)的模板、混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳條帶詳見圖4。單一模板及混合模板分別與對應(yīng)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，其擴(kuò)增成功率均為100%。由圖可知，九香蟲在400～500bp間出現(xiàn)條帶，小皺蝽在200～300bp間出現(xiàn)條帶，這與九香蟲、小皺蝽擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度為473bp、255bp相對應(yīng)，說明設(shè)計的引物具有特異性。

3.6 多重PCR靈敏度檢測

提取按一定比例混合的九香蟲、小皺蝽樣品總DNA，并分別與單一引物、混合引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，詳見圖4。九香蟲：小皺蝽按1：1、3：1、6：1、9：1混合提取總DNA及擴(kuò)增產(chǎn)物用A、B、C、D表示，其中B1、C1、D1和E1為混合樣品DNA與混合特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，B2、C2、D2和E2為混合樣品DNA與九香蟲的特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶，B3、C3、D3和E3為混合樣品DNA與小皺蝽的特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶。

由圖可知，B1、C1、D1、E1均能產(chǎn)生兩條特異性條帶，分別是九香蟲擴(kuò)增產(chǎn)物長度473bp和小皺蝽擴(kuò)增產(chǎn)物長度255bp；B2、C2、D2、E2為單一條帶，其長度為473bp，B3、C3、D3、E3為單一條帶，其長度為255bp。說明利用多重PCR技術(shù)設(shè)計特異性引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳后，根據(jù)電泳條帶的有無來判斷樣品的基原及摻雜情況，鑒定摻雜的比例可達(dá)到10%，通過一次提取樣品，就能夠?qū)悠返幕M(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

3.7 熒光定量PCR單一樣品檢測

九香蟲、小皺蝽分別在與COI引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)后，啟動熔解曲線程序，九香蟲、小皺蝽熔解曲線均為單峰，測得九香蟲的Tm值為75℃，小皺蝽的Tm值為89℃。

3.8 熒光定量PCR混合樣品靈敏度檢測

將混合樣品分別按照1：1、3：1、6：1、9：1提取總DNA，向混合DNA加入COI引物，按照熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增并測定其熔解曲線的Tm值，詳見圖5。

由圖可知，九香蟲：小皺蝽按1：1、3：1、6：1、9：1比例混合的樣品其Tm值均約為75℃、89℃，而九香蟲、小皺蝽單一DNA的Tm值分別是75℃、89℃，說明基于COI引物可以對九香蟲摻雜小皺蝽的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，且小皺蝽的Tm值不隨樣品比例增減而改變，具有很好的操作性及識別度。

4 討論

九香蟲、小皺蝽分別屬于蝽科（Pentatomidae stinkbug）九香蟲亞科（Dinidoronae）兜蝽屬（Aspongopus）、皺蝽屬（Cydopelta），為同科不同屬的物種，兩者親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，故可以利用分子鑒定技術(shù)對其進(jìn)行鑒定。通過DNA條形碼、多重PCR、熔解曲線分別對九香蟲、小皺蝽進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)均能夠?qū)烧哌M(jìn)行有效鑒別。其中九香蟲、小皺蝽種間遺傳距離均大于0.2，說明兩者親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。二級結(jié)構(gòu)不僅能夠?qū)畔阆x、小皺蝽進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，種內(nèi)較少的堿基變異也能夠讓二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而更加直觀觀察到種內(nèi)堿基變異?；贑OI堿基序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹能夠準(zhǔn)確將九香蟲、小皺蝽、黑兜蟲、刺桐蝽鑒別開且根據(jù)聚類樹可以對親緣關(guān)系進(jìn)行判別。

基于多重PCR技術(shù)設(shè)計九香蟲、小皺蝽特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，單一模板、混合模板與單一引物進(jìn)行擴(kuò)增，均能夠得到明亮的單一條帶。不同比例的混合模板與混合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，在小于100bp、400～500bp、200～300bp出現(xiàn)3條電泳條帶，其中小于100bp的條帶最亮，擴(kuò)增產(chǎn)物的兩條條帶均比較暗淡，不同比例的混合模板條帶亮度基本一致。不同比例的混合模板與分別與九香蟲、小皺蝽特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)2條條帶，小于100bp的條帶基本上比目標(biāo)條帶要亮。以上小于100bp的條帶均較亮說明在反應(yīng)過程中出現(xiàn)了引物二聚體，抑制了目的基因進(jìn)行擴(kuò)增的速率，導(dǎo)致即使增加模板濃度也不能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增目的基因。混合引物進(jìn)行擴(kuò)增時，引物二聚體擴(kuò)增的效率大大提升，導(dǎo)致混合模板與混合引物進(jìn)行擴(kuò)增時，雖然目的基因都能夠擴(kuò)增成功，但目的條帶亮度均沒有達(dá)到引物二聚體、混合模板與單一引物擴(kuò)增條帶的亮度，其中亮度為引物二聚體>單一引物>混合引物。雖然設(shè)計的引物有引物二聚體產(chǎn)生，但依然能夠有效鑒別九香蟲摻雜10%小皺蝽的樣品，說明該方法可行，特異性引物有待進(jìn)一步優(yōu)化。

基于熒光定量PCR技術(shù)對九香蟲、小皺蝽進(jìn)行鑒定，分別與COI引物進(jìn)行擴(kuò)增，其熔解曲線Tm值分別為75℃、89℃，但九香蟲有一處小峰，Tm值約為66℃，可能為引物二聚體的Tm值，小皺蝽的Tm值峰形較好且無引物二聚體峰。按1：1、3：1、6：1混合模板與COI引物進(jìn)行擴(kuò)增時，均出現(xiàn)引物二聚體峰，九香蟲的峰形發(fā)生較大變化但依然呈現(xiàn)單峰，小皺蝽的峰形保持不變。說明小皺蝽即使模板濃度降低，但其熔解曲線的峰形及Tm值保持不變，利用該方法對九香蟲中摻雜小皺蝽的鑒定率可以達(dá)到10%的靈敏度，甚至可以有更高的靈敏度。

基于DNA條形碼、多重PCR、熒光定量PCR均能夠?qū)畔阆x、小皺蝽進(jìn)行鑒定及鑒別，多重PCR、熒光定量PCR均能夠達(dá)到10%的靈敏度，對摻雜小皺蝽的九香蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，為摻雜一定比例小皺蝽的九香蟲鑒定提供一定的思路及方法，為穩(wěn)定九香蟲市場提供一定的技術(shù)支撐。

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收稿日期：2022-10-23

通訊作者：許亮（1978-），男，遼寧沈陽人，博士，教授。研究方向：中藥鑒定與品質(zhì)評價。

基金項目：遼寧省“百千萬人才工程”資助項目；安徽高校自然科學(xué)研究項目（KJ2021A1143；KJ2020A0765）；亳州學(xué)院科研項目（BYZ2017C02；BYZXKTD202004；BYH202108）；高校學(xué)科（專業(yè)）拔尖人才（gxbjZD2020095）