“多光子吸收四苯乙烯三吡啶Fe(II)配合物的合成及ROS探索”實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)施結(jié)果與探討

張瓊　汪琪琦　王仁昊　肖文巖　蔣藝銘　李勝利

摘 要：主要介紹安徽大學(xué)專門為國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃設(shè)計(jì)的“多光子吸收四苯乙烯三吡啶Fe（II）配合物的合成及ROS探索”實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)施結(jié)果與探討。以四苯乙烯三聯(lián)吡啶Fe（II）配合物的合成為基礎(chǔ)，圍繞創(chuàng)新和創(chuàng)業(yè)兩大目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)配合物多光子吸收性質(zhì)創(chuàng)新，探索配合物的ROS性能，評(píng)估化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果。全文以實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析、反思、判斷。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探索配合物在癌癥治療方面的實(shí)際應(yīng)用，使其具有創(chuàng)業(yè)潛力。

關(guān)鍵詞：無機(jī)及分析化學(xué)；鐵配合物；多光子吸收；ROS檢測(cè)

中圖分類號(hào)：G642.1；O614.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2023）02-0098-04

在我國(guó)當(dāng)前的教學(xué)改革中，如何把創(chuàng)新發(fā)展的思想融入大學(xué)的日常教學(xué)，培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的大學(xué)生是核心問題。綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)可以把基礎(chǔ)化學(xué)與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技能有機(jī)地結(jié)合起來，使學(xué)科的研究前沿與其融為一體，能充分體現(xiàn)學(xué)科交叉發(fā)展，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)造性[1，2]。

在無機(jī)及分析化學(xué)教學(xué)中，d區(qū)元素相關(guān)內(nèi)容通常在學(xué)期中旬之后講解，內(nèi)容多，學(xué)時(shí)少[3]。在本科階段無機(jī)及分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中，有關(guān)d區(qū)鐵錳配合物的實(shí)驗(yàn)更是少之又少。在學(xué)生完成了無機(jī)及分析化學(xué)理論及實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)后，我們專門安排了大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃，即組織和引導(dǎo)學(xué)生從配合物制備入手，圍繞配合物的合成及性質(zhì)，以配合物詳細(xì)的制備流程和光譜性質(zhì)為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，鞏固學(xué)生的理論知識(shí)。結(jié)合長(zhǎng)期積累的實(shí)驗(yàn)與教學(xué)工作經(jīng)驗(yàn)，專門為國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃量身定制“多光子吸收四苯乙烯α三聯(lián)吡啶Fe（II）配合物的合成及ROS探索”實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究構(gòu)效關(guān)系，探索配合物在生物醫(yī)藥方面的實(shí)際應(yīng)用，使其具有創(chuàng)業(yè)潛力。

三聯(lián)吡啶（tpy）是N^N^N型三齒配體，在配位化學(xué)領(lǐng)域中占據(jù)重要的地位[4，5]。三聯(lián)吡啶和其衍生物具有三個(gè)N-配位點(diǎn)，三聯(lián)吡啶衍生物及其組裝的配合物材料可以按照用途的要求，通過制備新配體和選擇合適的金屬中心離子，以此調(diào)整控制配合物的功能。因此，在催化、光電功能材料、生物傳感、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值[6，7]。

該創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃以多光子吸收過渡金屬配合物的生物成像應(yīng)用為導(dǎo)向，設(shè)計(jì)合成多光子吸收有機(jī)配體，通過引入四苯乙烯基團(tuán)來增強(qiáng)配體的生物相容性，由于四苯乙烯是經(jīng)典的聚集誘導(dǎo)發(fā)光特征配體[8]，配合物大共軛體系可促進(jìn)產(chǎn)生非線性光學(xué)活性；同時(shí)鐵配合物中Fe2+可與H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基（·OH），這也使得其具有化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過科研前沿成果，了解配合物基本概念及鐵系配合物最新研究進(jìn)展，掌握鐵系配合物的合成方法及光物理性質(zhì)，學(xué)會(huì)使用大型儀器進(jìn)行光物理性質(zhì)測(cè)試及分析測(cè)試數(shù)據(jù)。

1.2 試劑、儀器

藥品和試劑：配體FA，六氟磷酸鉀，無水乙腈，二氯化鐵，溶劑均為分析純，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行干燥和純化后使用。

儀器：手持LED燈（美國(guó)GE公司）、傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet FT-IR NEXUS 870 spectrometer）、紫外可見分光光度計(jì)（UV-265）、質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap XL mass spectrometer）、全自動(dòng)協(xié)調(diào)飛秒激光器（Ti：95藍(lán)寶石，80MHz，140fs，Chameleon Ⅱ 680nm-900nm）。

1.3 雙光子吸收截面

論文通過開孔Z-掃描對(duì)配合物FA-Fe-FA的雙光子吸收性質(zhì)進(jìn)行探索，通過Z掃描測(cè)試可以直接得到入射功率和出射功率，并進(jìn)一步得到測(cè)試樣品的透過率T（z），基于空間和時(shí)間高斯脈沖，歸一化的能量透射率T（z）由以下方程得到：

λ是入射光波長(zhǎng)，ω0為入射光束腰的半徑，α0為樣品在工作激光下的線性吸收系數(shù)，Z為樣品距離焦點(diǎn)的位移，是曲線的橫坐標(biāo)，I0為焦點(diǎn)處的入射光強(qiáng)度，Leff是有效樣品厚度，雙光子吸收截面：

式中的h為普朗克常數(shù)，γ為入射光的頻率，NA=6.02×1023為阿伏伽德羅常數(shù)，d為樣品濃度。

通過此公式計(jì)算得出雙光子吸收系數(shù)β以及雙光子吸收截面σ的值。

1.4 合成與表征

FA的合成步驟：在250mL圓底燒瓶，依次加入3.6g（0.03mol）2-乙?；拎ぃ倭繜o水乙醇，以及2.8gKOH水溶液，常溫?cái)嚢?5min，逐滴加入30mL氨水，回流3h，冷卻后抽濾得到2.0g的黃色固體粉末，產(chǎn)率84%。ESI-MS：calculated： for [M+H]+;564.24，found：564.24

FA-Fe-FA合成路線如下：

配合物FA-Fe-FA的合成：將配體FA（0.563g，0.001mol）加入100mL圓底燒瓶中，再向圓底燒瓶中加入適量的無水乙腈（懸浮液）在80℃條件下逐滴滴加二氯化鐵（0.08g，0.0005mol）的無水乙腈（10mL）溶液，充分反應(yīng)2小時(shí)后，向其中加入過量的六氟磷酸鉀，冷卻至室溫，過濾，干燥、得紫色固體0.48g，產(chǎn)率：82%。ESI-MS M/2： 591.42 calcd for： M/2： 591.42，found： 591.42 FT-IR（KBr，cm-1）： 3906（m），3857（m），3762（m），3654（m），3565（m），3050（m），2371（m），1660（m），1564（m），1392（s），1164（m），1075（m），1017（m），846（s），751（s），707（s），548（m）。

由于金屬鐵具有磁性，無法得出配合物完整的13C和1H譜。對(duì)于含磁性金屬中心的配合物，通常采用質(zhì)譜，紅外來確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。例如質(zhì)譜：通過ChemDraw模擬可得FA-Fe-FA的分子量為591.42 （M/2），ESI-MS的結(jié)果為591.42（M/2）與ChemDraw結(jié)果一致。

2 配合物的光物理性質(zhì)研究

2.1 紫外-可見吸收光譜

如圖3紫外-可見吸光光譜所示，配合物FA-Fe-FA具有兩個(gè)比較明顯的特征吸收峰，在300nm左右存在一個(gè)強(qiáng)吸收峰，在580nm存在一個(gè)弱吸收峰，300nm處的中等強(qiáng)度吸收峰為配體（FA）的π-π*躍遷。配合物FA-Fe-FA在580nm處的吸收峰歸則因于LMCT[π*（FA）-dπ（Fe）]特征吸收峰。

2.2 配合物的雙光子吸收性質(zhì)

經(jīng)過前面的教學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)學(xué)生對(duì)“配合物的應(yīng)用”章節(jié)極為感興趣，故在實(shí)驗(yàn)教學(xué)最后，增加了配合物多光子吸收性質(zhì)研究，通過引導(dǎo)學(xué)生查閱文獻(xiàn)，以翻轉(zhuǎn)課堂形式進(jìn)行配合物實(shí)際應(yīng)用趣味教學(xué)，調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性參與到教學(xué)過程中。什么是雙光子吸收？雙光子吸收是指材料分子在強(qiáng)脈沖激光激發(fā)下同時(shí)吸收兩個(gè)以上光子達(dá)到虛擬中間態(tài)（virtue state）的過程[9，10]。與單光子吸收相比，雙光子吸收（2PA）激發(fā)光的波長(zhǎng)近似等于單光子激發(fā)的兩倍。而這種近紅外波段的長(zhǎng)波激發(fā)光具有穿透深度深、光穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)[11-14]。

在進(jìn)行配合物的雙光子吸收性質(zhì)教學(xué)時(shí)，需要介紹進(jìn)行雙光子吸收性質(zhì)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)方法，包括熒光對(duì)比法和Z-掃描法。熒光對(duì)比法通常針對(duì)具有熒光的分子，而不具有熒光性質(zhì)的分子使用Z掃描方法來測(cè)試其雙光子吸收性質(zhì)[15-17]。

由圖4及公式計(jì)算可知，配合物FA-Fe-FA在900nm激發(fā)波長(zhǎng)下具有良好的雙光子吸收信號(hào)，雙光子吸收系數(shù)β為0.3496cm/GM；雙光子吸收截面為4774.5GM，表明這一配合物具有優(yōu)良的雙光子吸收活性，可進(jìn)一步應(yīng)用于生物探索。

3 生物應(yīng)用探索

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練突出創(chuàng)新和創(chuàng)業(yè)兩大目標(biāo)，為了研究該實(shí)驗(yàn)所獲得產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)業(yè)目標(biāo)，我們將FA-Fe-FA應(yīng)用于生物體系，研究配合物ROS能力，評(píng)估其是否存在進(jìn)行腫瘤診療的潛力。在腫瘤細(xì)胞中，過氧化氫（H2O2）的濃度較高，而在鐵配合物中的二價(jià)鐵可與H2O2進(jìn)行芬頓反應(yīng)，生成羥基自由基（·OH），由此提高細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量[18-20]。最終導(dǎo)致Ferroptosis（鐵死亡），誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

通過羥基自由基指示劑（對(duì)苯二甲酸）對(duì)羥基自由基（·OH）進(jìn)行測(cè)定，向2mL（10-4mol/L）FA-Fe-FA溶液中加入20μL H2O2的溶液，經(jīng)過5min的孵育，然后將1mL（10-3mol/L）對(duì)苯二甲酸添加到該溶液中，對(duì)425nm處的熒光發(fā)射峰（對(duì)苯二甲酸的特征發(fā)射峰）進(jìn)行檢測(cè)，如圖5a所示，對(duì)苯二甲酸的特征發(fā)射峰熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間不斷增強(qiáng)。如圖5b，緊接著檢測(cè)不同的量的H2O2的溶液中對(duì)苯二甲酸的熒光，可以看出H2O2的量越高，其熒光強(qiáng)度也越高。

以上測(cè)試結(jié)果表明FA-Fe-FA中的Fe2+與H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)生成羥基自由基（·OH），增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平。

在體外測(cè)試的結(jié)果支持下，進(jìn)行了細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究鐵死亡的性能。如圖6所示，利用FA-Fe-FA對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)10分鐘的孵育，在細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)FITC的熒光信號(hào)和PI信號(hào)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在孵育10min左右時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡。孵育時(shí)間越長(zhǎng)，羥基自由基產(chǎn)生的量越多，使細(xì)胞膜的完整性被損害。PI信號(hào)明顯。孵育期為30min時(shí)，通過兩種商染染色及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析，HeLa細(xì)胞的凋亡率接近百分之百。綜上而言，F(xiàn)A-Fe-FA有產(chǎn)生羥基自由基的能力，提升細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量，最后引起鐵死亡，在腫瘤診斷和治療方面都有很大的潛力。

4 結(jié)論

結(jié)合最新學(xué)術(shù)進(jìn)展，為國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃設(shè)計(jì)了一個(gè)綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)，以四苯乙烯三聯(lián)吡啶為主配體，設(shè)計(jì)合成配合物FA-Fe-FA，發(fā)現(xiàn)FA-Fe-FA具有較大的雙光子吸收截面。研究了鐵配合物產(chǎn)生·OH能力，配合物中Fe2+可與H2O2進(jìn)行芬頓反應(yīng)，生成羥基自由基（·OH），提高細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果。本實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)了對(duì)無機(jī)化學(xué)及分析化學(xué)中涉及d區(qū)元素部分基礎(chǔ)知識(shí)與實(shí)驗(yàn)操作的綜合性要求，圍繞創(chuàng)新與創(chuàng)業(yè)兩大目標(biāo)，實(shí)驗(yàn)步驟設(shè)計(jì)合理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確，理論與實(shí)踐相結(jié)合，使學(xué)生產(chǎn)生濃厚的學(xué)習(xí)興趣，實(shí)驗(yàn)包含有大型儀器操作和數(shù)據(jù)分析等，提高了學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)分析實(shí)際問題的能力，同時(shí)也為本科畢業(yè)設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

——————————

參考文獻(xiàn)：

〔1〕陶貴德，王昭昀.“自助式”綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式實(shí)踐與探索[J].巢湖學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，13（06）：160-163.

〔2〕單樹楠，李嫻，張雷，等.基于學(xué)科交叉的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)設(shè)計(jì)[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2021， 40（11）：145-149.

〔3〕桑雅麗，劉艷華，包瑩瑩，等.高中化學(xué)與大學(xué)無機(jī)化學(xué)教材知識(shí)點(diǎn)的銜接研究[J].化學(xué)教育（中英文），2021，42（14）：17-24.

〔4〕常慧，姚雙全，韓文佳，等.三聯(lián)吡啶化合物的溶劑致熒光變色及丁醇異構(gòu)體鑒別[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2021，42（03）：902-909.

〔5〕農(nóng)勝英.三聯(lián)吡啶鋅、鈀配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)和熒光性質(zhì)的研究[D].廣西：廣西大學(xué)，2018.

〔6〕MUGHAL E U， MIRZAEI M， SADIQ A. Terpyridine-metal complexes： effects of different substituents on their physico-chemical properties and density functional theory studies[J]. Royal Society open science，2020，7（11）：201208.

〔7〕ERYAZICI I， MOOREFIELD C N， NEWKOME G R. Square-planar Pd（II）， Pt（II），and Au（Ⅲ） terpyridine complexes： their syntheses，physical properties， supramolecular constructs， and biomedical activities[J]. Chemical Reviews， 2008，108（06）：1834-1895.

〔8〕王震.四苯乙烯衍生物的合成、結(jié)構(gòu)、組裝及其應(yīng)用[D].武漢：華中科技大學(xué)，2015.

〔9〕謝嘉恩，羅雨珩，張黔玲，等.金屬配合物在雙光子熒光探針中的應(yīng)用研究[J].化學(xué)進(jìn)展，2021，33（01）：111-123.

〔10〕徐歡天.熒光染料的非簡(jiǎn)并雙光子吸收特性研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2018.

〔11〕ZIPFEL W R， WILLIAMS R M， WEBB W W.? Nonlinear magic： multiphoton microscopy in the biosciences[J].Nature Biotechnology，2003， （21）：1369-1376.

〔12〕KAWATA S， KAWATA Y. Three-dimensional optical data storage using photochromic materials[J]. Chemical Reviews，2000，（100）：1777-1788.

〔13〕HELMCHEN F， DENK W. Deeptissue two-photon microscopy[J]. Nature Methods，2005，（02）：932-940.

〔14〕HWAN M K， BONG R C， Small-molecule two-photon probes for bioimaging applications[J]. Chemical Reviews，2015，（115）：5014-5055.

〔15〕王敏，王冬梅，顧泉，等.功能性咔唑二羧酸配體的合成、表征和光學(xué)性質(zhì)研究[J].巢湖學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，11（03）：86-88.

〔16〕安辛友，吳衛(wèi)東，任維義，等.Z掃描技術(shù)及其在非線性光學(xué)材料科學(xué)中的應(yīng)用與進(jìn)展[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，31（04）：429-434.

〔17〕鄒林兒，張澤，傅繼武.激光Z掃描技術(shù)測(cè)量光學(xué)非線性實(shí)驗(yàn)[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2019，36（02）：62-65.

〔18〕徐文慧，李滄海，廷良.鐵死亡通路與中藥干預(yù)機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志2018，43（20）：4019-4026.

〔19〕劉現(xiàn)闖，徐克.腫瘤細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)型納米材料的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，50（04）：362-365.

〔20〕張正陽，王昕，王康，等.腫瘤鐵死亡調(diào)控機(jī)制的新進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2020，30（02）：121-124+143.

收稿日期：2022-10-07

通訊作者：李勝利（1968-），男，漢族，安徽巢湖人，博士，教授。研究方向：非線性光學(xué)材料。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（21871003）；安徽省自然科學(xué)基金（2008085QB52）；安徽大學(xué)質(zhì)量工程（2022）項(xiàng)目