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    基于脾虛濕阻研究佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型炎性因子、鈉鉀ATP酶及病理組織學(xué)變化

    2023-05-30 10:48:04劉德芳張耀雷劉碧瑩李莞劉濤郭明陽晏姣
    關(guān)鍵詞:炎性因子類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型

    劉德芳 張耀雷 劉碧瑩 李莞 劉濤 郭明陽 晏姣

    【摘 要】目的:建立基于脾虛濕阻環(huán)境下的佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型,觀測其炎性關(guān)節(jié)的炎性因子、脾臟鈉鉀ATP酶(Na+,K+-ATPase)表達(dá)及關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)變化。方法:將30只Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、AA對照組、空白對照組,每組10只。模型組在脾虛濕阻環(huán)境下復(fù)制AA大鼠模型,AA對照組在常溫常濕下復(fù)制AA模型,空白對照組給予常溫常濕環(huán)境喂養(yǎng)。28 d后,觀察大鼠的進(jìn)食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)、關(guān)節(jié)腫脹度、活動(dòng)情況,以及關(guān)節(jié)的病理組織學(xué);檢測血常規(guī),炎性關(guān)節(jié)的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)及脾臟的Na+,K+-ATPase活性。結(jié)果:與對照組比較,模型組大鼠精神萎靡,進(jìn)食量減少,部分大鼠腹瀉,毛發(fā)失去光澤,關(guān)節(jié)腫脹,部分足底部潰爛,活動(dòng)遲緩或跛行;模型組大鼠關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)表現(xiàn)為滑膜組織中大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,滑膜增生呈多層化,纖維血管翳形成。血小板計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率和單核細(xì)胞比率明顯升高(P < 0.05),淋巴細(xì)胞比率明顯降低(P < 0.05),IL-6、TNF-α、VEGF表達(dá)明顯升高(P < 0.05),Na+,K+-ATPase活性減退(P < 0.05)。結(jié)論:模型組大鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)明顯腫脹,足底部潰爛,飲食量減少,大便溏瀉,Na+,K+-ATPase活性減退,類同于中醫(yī)痹病脾虛濕阻的范疇,血細(xì)胞計(jì)數(shù)、比率和IL-6、TNF-α、VEGF等異常表達(dá),以及關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)表現(xiàn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者表現(xiàn)一致。

    【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;佐劑性關(guān)節(jié)炎;動(dòng)物模型;炎性因子;鈉鉀ATP酶;大鼠

    Study on Inflammatory Factors,Na+,K+-ATPase and Histopathological Changes of Adjuvant Arthritis Rat Model Based on Spleen Deficiency and Dampness Obstruction

    LIU De-fang,ZHANG Yao-lei,LIU Bi-ying,LI Wan,LIU Tao,GUO Ming-yang,YAN Jiao

    【ABSTRACT】Objective:To establish rat models of adjuvant arthritis(AA)based on the environment of spleen deficiency and dampness obstruction,and observe the inflammatory factors of its inflammatory joints,the expression of sodium potassium ATPase(Na+,K+-ATPase)in the spleen and the pathological changes of the joints.Methods:Thirty Wistar rats were randomly divided into a model group,an AA control group and a blank control group,with 10 rats in each group.The model group reproduced the AA rat model in the environment of spleen deficiency and dampness construction,the AA control group reproduced the AA model at normal temperature and humidity,and the blank control group was fed at normal temperature and humidity.After 28 days,

    observe the rats' food intake,mental state,hair,joint swelling,activity,and joint histopathology,detect blood routine,IL-6,TNF-α,expression of VEGF and activity of Na+,K+-ATPase in spleen.Results:Compared with the control group,the rats in the model group suffered from mental depression,decreased food intake,diarrhea(some rats),loss of luster in hair,joint swelling,partial foot ulceration,slow movement or lameness;the pathological histology of the joints in the model group showed that a large number of inflammatory cells such as lymphocytes,plasma cells and macrophages infiltrated the synovial tissue,the synovial hyperplasia was stratified,and the fibrous pannus were formed.Platelet count,neutrophil ratio and monocyte ratio increased significantly(P < 0.05),lymphocyte ratio decreased significantly(P < 0.05),the expressions of IL-6,TNF-α and VEGF were significantly increased(P < 0.05),and the activity of Na+,K+-ATPase

    was decreased(P < 0.05).Conclusion:The rats in the model group showed obvious joint swelling,foot ulceration,reduced diet,loose stool,decreased Na+,K+-ATPase activity,similar to the category of bi disease of spleen deficiency and dampness construction in traditional Chinese medicine.The abnormal expressions of blood cell count and ratio,IL-6,TNF-α and VEGF and the histopathological manifestations of joints were consistent with those of patients with rheumatoid arthritis.

    【Keywords】 rheumatoid arthritis;adjuvant arthritis;animal model;inflammatory factors;Na+,K+-ATPase;rats

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)腫痛、晨僵及多系統(tǒng)受累。我國RA患病率為0.34%~0.42%[1],患病人數(shù)達(dá)500萬,而且高濕環(huán)境下居民發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)[2]。RA病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚?!饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰:“正氣存內(nèi),邪不可干;邪之所湊,其氣必虛。”因此,本研究基于脾虛的內(nèi)環(huán)境及高濕的外環(huán)境即脾虛濕阻條件下建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型,觀察其炎性因子、鈉鉀ATP酶(Na+,K+-ATPase)以及關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)變化,現(xiàn)總結(jié)如下。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取Wistar健康雄性大鼠30只,體質(zhì)量150~180 g,均為SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 智能人工氣候箱(RXZ-10000A,寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司);加濕器(YC-D205,亞都);動(dòng)物麻醉機(jī)(R580S,RWD Life Science);臺式低溫高速離心機(jī)(Thermo ST16R,美國熱電公司);超低溫冰箱(MDF-U53V,日本松下公司);血細(xì)胞分析儀(BC 6900,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);酶標(biāo)儀(Multisan,美國熱電公司);Real-time檢測儀(ABI公司);低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠);電動(dòng)勻漿機(jī)(FLUKO);液氮容器(東亞醫(yī)療電子器械公司);正置顯微鏡(德國Leica公司);生物安全臺(BSC-130011A2,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 弗氏完全佐劑(Sigma F5881);異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司);大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠VEGF ELISA試劑盒((ExCell Bio);蘇木素-伊紅染色液(Harris,珠海貝索生物技術(shù)有限公司);超微量ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所);RIPA裂解液(碧云天)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動(dòng)物分組和造模 按照隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠隨機(jī)分為模型組、AA對照組和空白對照組,每組10只。

    模型組大鼠每日灌服油脂1 g·(100 g)-1,并置于高濕環(huán)境中喂養(yǎng)(人工氣候箱,每天刺激8 h),相對濕度(90±4)%,溫度(24±2)℃,持續(xù)2周后,采用體積分?jǐn)?shù)為75 %的乙醇對左、右后足跖進(jìn)行消毒,然后左、右后足跖皮下分別注射0.15 mL·kg-1的弗氏完全佐劑(CFA),21 d后等劑量加強(qiáng)免疫1次。AA對照組同樣給予每只大鼠左、右后足的足跖部各皮下注射0.15 mL·kg-1的CFA,21 d后等劑量加強(qiáng)免疫1次,并置于常溫常濕環(huán)境喂養(yǎng),相對濕度(60±4)%,溫度(24±2)℃??瞻讓φ战M僅給予常溫常濕環(huán)境喂養(yǎng),相對濕度(60±4)%,溫度(24±2)℃。

    2.2 標(biāo)本收集及制備 造模后第28天,將大鼠置于麻醉機(jī)里麻醉,仰臥固定手術(shù)臺,碘伏消毒,用手術(shù)剪沿腹正中線剪開腹腔,消毒棉簽輕輕扒開血管周圍組織,直到清晰看見腹主動(dòng)脈,采血針以30°左右角度進(jìn)針采血。分別用淺紫色頭蓋(血常規(guī)管)和黃色頭蓋真空管(生化管)各采1管,完整取下脾臟、左后肢膝關(guān)節(jié)及其以下部分。淺紫色頭蓋管即送檢血常規(guī)。黃色頭蓋管靜置1 h后離心,吸上清保存-80 ℃冰箱。每組隨機(jī)取2只關(guān)節(jié)用甲醛固定,其余關(guān)節(jié)和脾臟采用錫箔紙包裹保存于-80 ℃冰箱。

    2.3 觀察指標(biāo)

    2.3.1 大鼠一般情況的觀測 觀察大鼠的進(jìn)食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)、關(guān)節(jié)腫脹度及活動(dòng)情況。

    2.3.2 大鼠關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)觀察 按照常規(guī)操作方法進(jìn)行透明及浸蠟→包埋→切片→展片與粘片→烤片→HE染色→封片→光學(xué)顯微鏡下觀察,與空白對照組進(jìn)行對照,觀察模型組、AA對照組大鼠的關(guān)節(jié)組織學(xué)變化。

    2.3.3 血常規(guī)的檢測 采用血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)。

    2.3.4 骨關(guān)節(jié)IL-6、TNF-α、VEGF的檢測

    2.3.4.1 組織勻漿的提取 在無菌操作平臺上,大鼠左后肢關(guān)節(jié)常溫解凍后,首先取下足跖部軟組織,置于-80 ℃冰箱保存,然后去除周圍附著的組織,稱取處理后的骨關(guān)節(jié)10 g,液氮冷凍,組織粉碎機(jī)粉碎,加入裂解液1.5 mL,組織勻漿機(jī)勻漿,離心,吸出上清,再離心,取上清,置于-80 ℃冰箱保存。

    2.3.4.2 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測 按照ELISA法進(jìn)行檢測,具體步驟:①取出試驗(yàn)所需板條。②空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品,其余相應(yīng)孔中加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(每孔100 μL),用封板膠紙封住反應(yīng)孔,37 ℃孵箱孵育90 min。③提前20 min準(zhǔn)備生物素化抗體工作液;洗板5次。④空白孔加生物素化抗體稀釋液,其余孔加入生物素化抗體工作液(每孔100 μL)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔,37 ℃孵箱孵育60 min。⑤提前20 min準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫22~25 ℃放置;洗板5次。⑥空白孔加酶結(jié)合物稀釋液,其余孔加入酶結(jié)合物工作液(每孔100 μL)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔,37 ℃孵箱,避光孵育30 min。⑦打開酶標(biāo)儀電源,預(yù)熱儀器,設(shè)置好檢測程序;洗板5次。⑧加入顯色底物(TMB)每孔100 μL。避光37 ℃孵箱,避光孵育15 min。⑨加入終止液每孔100 μL,混勻后即刻測量OD450值(3 min內(nèi))。

    2.3.5 脾臟組織Na+,K+-ATPase的檢測

    2.3.5.1 樣本的準(zhǔn)備 電子天平稱取2 g脾臟組織加入2 mL裂解液,離心機(jī)以2500 r·min-1離心10 min,離心半徑8 cm。取上清液100 μL,再加入900 μL生理鹽水。即得到1%的組織勻漿液。

    2.3.5.2 試劑的配制與操作 按照檢測說明書,第一步進(jìn)行基質(zhì)液的配制,第二步定磷。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示,組間比較采用成組樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié) 果

    3.1 3組大鼠一般情況比較 與空白對照組比較,AA對照組大鼠表現(xiàn)出精神萎靡,進(jìn)食量減少,部分大鼠腹瀉,毛發(fā)失去光澤,關(guān)節(jié)腫脹,有些出現(xiàn)足底部潰爛,活動(dòng)減緩等;與AA對照組比較,模型組大鼠的精神更加萎靡,進(jìn)食量更少,毛發(fā)光澤度更差。見圖1。

    3.2 3組大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)情況 組織病理學(xué)顯示,空白對照組無炎性細(xì)胞浸潤,無纖維組織增生和組織破壞。AA對照組大量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,但是無血管翳形成。模型組滑膜組織中大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,滑膜增生呈多層化,纖維血管翳形成。見圖2。

    3.3 3組大鼠脾臟組織Na+,K+-ATPase的含量變化情況 Na+,K+-ATPase含量的標(biāo)本數(shù)來源于8只大鼠,另外2只用于病理組織學(xué)檢測。模型組大鼠脾臟組織Na+,K+-ATPase含量較AA對照組和空白對照組均明顯降低(P < 0.05)。見表1。

    3.4 3組大鼠血細(xì)胞水平比較 模型組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)較AA對照組明顯降低(P < 0.05),但皆在正常范圍,與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。模型組血小板、中性粒細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞比率、單核細(xì)胞比率與AA對照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05),血小板、中性粒細(xì)胞比率、單核細(xì)胞比率較空白對照組明顯升高,淋巴細(xì)胞比率較空白對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表2。

    3.5 3組大鼠骨關(guān)節(jié)IL-6、TNF-α、VEGF的變化情況 模型組大鼠骨關(guān)節(jié)組織IL-6、TNF-α、VEGF的表達(dá)水平與AA對照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05),較空白對照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表3。

    4 討 論

    RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,以風(fēng)寒濕三氣雜至為致病的外在條件,但正氣虛衰則是本病的內(nèi)在因素?!端貑枴ぐ俨∈忌氛f:“風(fēng)雨寒熱不得虛,邪不能獨(dú)傷人,卒然逢疾風(fēng)暴雨而不病者,蓋無虛,故邪不能獨(dú)傷人,此必因虛邪之風(fēng),與其身形,兩虛相得,乃客其形?!盧A的外因多責(zé)之于濕邪,《景岳全書·濕證》云:“濕之為病……在經(jīng)絡(luò)則為痹……。”其內(nèi)因離不開肺脾腎等臟腑功能失調(diào),尤其與脾虛水濕不化密切相關(guān)?!吨酗L(fēng)歷節(jié)病脈證并治第五》第7條曰:“盛人脈澀小……歷節(jié)疼不可屈伸,此皆飲酒汗出當(dāng)風(fēng)所致。”[3]基于上述理論,參考孫曉靜等[4-6]文獻(xiàn)首先對大鼠施加內(nèi)濕因素(肥膩飲食)致脾虛,以及“高濕環(huán)境”的外濕因素(人工氣候箱),然后注射弗氏完全佐劑,從而復(fù)制出脾虛濕困下的AA大鼠模型。AA模型大多復(fù)制21 d開始藥物干預(yù)[7],也有復(fù)制較短時(shí)間就開始藥物干預(yù)的[8-9]。本研究按照常規(guī)的21 d復(fù)制出AA模型,模型大鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)明顯腫脹,甚至足底潰爛,精神萎靡、進(jìn)食量減少,毛發(fā)失去光澤,脾組織Na+,K+-ATPase的活力明顯降低。臨床報(bào)道濕阻患者多表現(xiàn)出胸悶脘痞納呆、身重肢倦、舌苔厚膩等[10],研究顯示,濕阻證常出現(xiàn)Na+,K+-ATPase活性減低[11-12]。本研究結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

    RA是一種慢性自身免疫性炎性關(guān)節(jié)疾病,細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,體內(nèi)的促炎和抗炎細(xì)胞因子活性平衡失調(diào)會導(dǎo)致致病性炎癥反應(yīng),促炎細(xì)胞因子的增加和抗炎細(xì)胞因子的減少可能影響RA的發(fā)展[13]。已有研究顯示,促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α是炎癥的生物標(biāo)志物[14]。KAYA等[15]報(bào)道TNF-α可能是RA的主要病理生理因素,是疾病活動(dòng)的標(biāo)志物。本研究團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn),RA濕熱痹阻證患者外周血血清中IL-1、IL-6、TNF-α較健康對照組明顯升高,關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α較外周血顯著升高[16]。RA受累關(guān)節(jié)的滑膜組織中有大量的炎性細(xì)胞浸潤,在疾病早期,炎性細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的表達(dá)已經(jīng)增加[17]。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,可促進(jìn)RA血管內(nèi)物質(zhì)外滲,導(dǎo)致炎性滑膜組織血管新生,加重組織炎癥,形成血管翳,導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直,是炎癥持續(xù)過程起破壞作用的細(xì)胞因子[18]。炎癥細(xì)胞因子之類的免疫相關(guān)分子不僅可加劇RA的炎癥,還會破壞其骨骼[19]。本研究復(fù)制的模型表現(xiàn)出的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、VEGF升高與RA活動(dòng)期表現(xiàn)是一致的。另外,臨床中,RA患者多數(shù)有輕度的正細(xì)胞正色素性貧血,血小板增多癥也很常見,而且與疾病活動(dòng)性密切相關(guān)。少數(shù)病情較重者,全身性炎癥反應(yīng)明顯的患者可表現(xiàn)出白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比率升高。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠的血細(xì)胞變化情況與臨床RA患者的表現(xiàn)基本一致。

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    收稿日期:2022-10-11;修回日期:2022-11-22

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