鮮地黃提取物UPLC 特征圖譜與化學(xué)模式識(shí)別方法研究

魯 云，黃夢(mèng)婷，徐 杰，謝明晏，彭邦貴，程學(xué)仁，孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

鮮地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮塊根，味甘、苦，性寒，具有清熱生津、涼血、止血的功效[1]。鮮地黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，以其與鮮石解（防己）、鮮沙參（或鮮大青葉、鮮薄荷、鮮青蒿）組方，用于治療高熱急證和血熱妄行、吐血衄血[2]。現(xiàn)代研究表明，鮮地黃在消炎抗菌、止血和免疫作用等方面療效顯著[3]。然而，由于傳統(tǒng)的“前店后廠”的供藥模式已不適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)的需求，臨床上常用干品（生地黃）取代鮮地黃，這不僅與中醫(yī)傳統(tǒng)用藥理論不符，同時(shí)也不能發(fā)揮鮮地黃特殊的藥效作用[4]。

如果利用現(xiàn)代技術(shù)將鮮地黃制備成現(xiàn)代化的鮮地黃制劑，就可以解決鮮地黃保鮮貯藏困難、臨床調(diào)劑不便等問(wèn)題，使傳統(tǒng)以鮮地黃治病的寶貴經(jīng)驗(yàn)得以繼承?！督饏T要略》以百合與鮮地黃汁組方，治百合病不經(jīng)吐下發(fā)汗，病形如初者[5]；《肘后備急方》以鮮地黃加水煎服，治傷寒及時(shí)氣溫病及頭痛，壯熱脈大[6]。說(shuō)明鮮地黃的傳統(tǒng)用法有榨汁和水煎兩種，但兩者化學(xué)成分的差異鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。為了使鮮地黃現(xiàn)代制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)與傳統(tǒng)的鮮地黃汁或鮮地黃湯劑保持一致，本研究以鮮地黃為原料，采用水提和榨汁兩種工藝制備鮮地黃提取物。同時(shí)建立基于多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、OPLS-DA、PCA、CA 等化學(xué)模式識(shí)別的鮮地黃提取物的UPLC 特征圖譜檢測(cè)方法，以期為鮮地黃現(xiàn)代制劑的制備以及臨床使用提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY 型超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司）；ME204E 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-DШ 型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；DLSB-5/20 型低溫冷卻液循環(huán)水泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；TRL-0.5 型真空冷凍干燥機(jī)（大連雙瑞科技有限公司）。

1.2 材料

梓醇對(duì)照品（批號(hào)：110808-201711，純度：99.60%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；地黃苷D 對(duì)照品（批號(hào)：ST11190120，純度：98.0%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；益母草苷對(duì)照品（批號(hào)：17122601，純度：99.62%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。11 批鮮地黃藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮塊根，來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 11 批鮮地黃藥材來(lái)源信息表Tab.1 Source information of 11 batches of fresh R. glutinosa

2 方法與結(jié)果

2.1 鮮地黃提取物的制備

2.1.1 水提提取物的制備 取鮮地黃藥材，除去蘆頭、須根及泥沙，切片，得鮮地黃飲片。取鮮地黃飲片100 g，置圓底燒瓶中，加水提取兩次，第一次加9倍量水，回流提取30 min，濾過(guò)；第二次加7 倍量水，回流提取30 min，濾過(guò)，合并兩次濾液，低溫減壓濃縮，噴霧干燥，即得鮮地黃水提提取物，編號(hào)為P1 ～ P11。

2.1.2 榨汁提取物的制備 取鮮地黃藥材，除去蘆頭、須根及泥沙，切片，得鮮地黃飲片。取鮮地黃飲片100 g，置于榨汁機(jī)中，加1 倍量水進(jìn)行榨汁，濾過(guò)；藥渣置于壓濾器中，壓濾，合并兩次濾液，噴霧干燥，即得鮮地黃榨汁提取物，編號(hào)為Z1 ～ Z11。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備 取鮮地黃提取物約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：45 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干，殘?jiān)?.1%磷酸-水溶液溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加0.1%磷酸-水溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梓醇、地黃苷D、益母草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加0.1%磷酸-水溶解并定容，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件 采用Waters ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 mm）色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0 ～ 5 min，0 A；5 ～ 7 min，0→ 5%A；7 ～ 10 min，5%A；10 ～ 16 min，5% → 11%A；16 ～ 18 min，11% → 16%A；18 ～ 35 min，16% → 30%A）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2.4 方法學(xué)考察 取鮮地黃提取物供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以地黃苷D 參照物峰相應(yīng)的峰為S 峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 范圍為0 ～ 0.90%，相對(duì)峰面積RSD 范圍為1.55% ～ 3.05%，表明儀器的精密度良好。取鮮地黃提取物供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在樣品制備后的0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各特征峰與S 峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 范圍為0 ～ 0.46%，相對(duì)峰面積RSD 范圍為0.94% ～ 2.95%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取鮮地黃提取物適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各特征峰與S 峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍為0 ～ 0.95%，相對(duì)峰面積RSD 范圍為1.27% ～3.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 特征圖譜的建立及共有峰的確定 取11 批鮮地黃水提提取物和11 批鮮地黃榨汁提取物，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各特征峰“峰面積/稱樣量”值，結(jié)果見(jiàn)表2；利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件對(duì)各批次樣品特征圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立鮮地黃提取物特征圖譜。共標(biāo)定了10 個(gè)共有特征峰，并通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了其中3 個(gè)特征峰，分別為峰3（梓醇）、峰4（地黃苷D）、峰6（益母草苷），結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 11 批鮮地黃水提與榨汁提取物UPLC 特征圖譜Fig.1 UPLC characteristic atlas of 11 batches of the fresh R. glutinosa extract powders prepared by decocting and juicing

圖2 鮮地黃對(duì)照特征圖譜Fig.2 Characteristic atlas of fresh R. glutinosa

表2 各批次樣品共有峰“峰面積/稱樣量”值Tab.2 ＂Peak area/sample weight＂ value of characteristic peak of each batch of samples

2.3 鮮地黃水提與榨汁提取物的差異

2.3.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析 利用SPSS 20.0 軟件對(duì)鮮地黃水提提取物與鮮地黃榨汁提取物特征峰的峰面積/稱樣量值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，鮮地黃水提提取物特征圖譜中峰1、峰5、峰7、峰9、峰10 的峰面積大于鮮地黃榨汁提取物（P＜0.05），峰2 的峰面積小于鮮地黃榨汁提取物（P＜0.05），其它共有峰的峰面積間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 鮮地黃水提與榨汁提取物“峰面積/稱樣量”差異分析（±s，n = 11）Tab.3 Difference analysis of ＂peak area/sample weight＂ between the fresh R. glutinosa extract powders prepared by decocting and juicing（±s，n = 11）

表3 鮮地黃水提與榨汁提取物“峰面積/稱樣量”差異分析（±s，n = 11）Tab.3 Difference analysis of ＂peak area/sample weight＂ between the fresh R. glutinosa extract powders prepared by decocting and juicing（±s，n = 11）

峰號(hào) 水提提取物 榨汁提取物 t P 1 1 013 485±236 573* 287 919±61 672 9.843 0.000 2 439 659±220 169* 799 138±211 969 3.901 0.001 3 8 002 072±1 337 995 8 245 547±1 074 606 0.471 0.643 4 539 828±104 406 529 357±98 439 0.242 0.811 5 137 924±25 436* 101 870±31 485 2.954 0.008 6 491 146±126 624 416 106±106 788 1.502 0.149 7 327 518±88 887* 263 665±70 911 1.863 0.077 8 143 660±42 740 124 865±26 147 1.244 0.228 9 352 833±245 161* 134 779±98 936 2.736 0.013 10 232 066±142 336* 87 743±58 424 3.111 0.006

2.3.2 偏最小二乘法分析（OPLS-DA）將各批次鮮地黃提取物10 個(gè)共有峰的“峰面積/稱樣量”值作為變量，采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)鮮地黃提取物進(jìn)行偏最小二乘法分析，得分圖見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，鮮地黃水提（GT）與榨汁（ZZ）提取物在OPLS-DA 模型中呈現(xiàn)明顯的分類聚集現(xiàn)象。分析OPLS-DA 模型中的變量投影重要度（VIP），結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)鮮地黃提取物各特征峰的VIP 值大小進(jìn)行排列，選擇VIP值大于1 的指標(biāo)作為區(qū)分鮮地黃水提與榨汁提取物的主要差異性成分。結(jié)果顯示，峰1（VIP 值1.577 0）、峰5（VIP 值1.229 0）、峰2（VIP 值1.225 1）、峰10（VIP 值1.196 6）、峰9（VIP 值1.161 9）、峰7（VIP值1.029 4）均大于1，說(shuō)明峰1、峰2、峰5、峰7、峰9、峰10 對(duì)鮮地黃水提和榨汁提取物的質(zhì)量差異影響顯著，與統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析的結(jié)果一致。

圖3 OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.3 OPLS-DA score plot

圖4 OPLS-DA VIP 值圖Fig.4 VIP plot of OPLS-DA

2.3.3 主成分分析（PCA）將各批次鮮地黃提取物10 個(gè)共有峰的“峰面積/稱樣量”值作為變量，采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)鮮地黃提取物進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1 為判斷標(biāo)準(zhǔn)，共提取4 個(gè)主成分，特征根值及方差貢獻(xiàn)率結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，前4 個(gè)主成分可反映鮮地黃水提和榨汁提取物特征圖譜整體81%以上的信息。提取方差貢獻(xiàn)率最高的主成分PC1、PC2 繪制鮮地黃提取物的二維得分散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，鮮地黃水提提取物與榨汁提取物有明顯的分類聚集現(xiàn)象，鮮地黃水提提取物（P1 ～P11）聚為一類，鮮地黃榨汁提取物（Z1 ～ Z11）聚為一類。表明水提與榨汁制備的鮮地黃提取物差異明顯。

圖5 PCA-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.5 PCA-DA score plot

表4 主成分因子特征根值與方差貢獻(xiàn)率Tab.4 The principal component value and variance contribution rate

2.3.4 聚類分析（CA）將各批次鮮地黃提取物10個(gè)共有峰的“峰面積/稱樣量”值作為變量，采用SPSS 20.0 軟件對(duì)鮮地黃對(duì)鮮地黃水提與榨汁提取物進(jìn)行聚類分析，聚類方法選擇Ward 法，測(cè)量區(qū)間選擇平方Euclidean 距離，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，當(dāng)距離大于15 時(shí)，鮮地黃提取物明顯聚為兩類，鮮地黃水提提取物（P1 ～ P11）聚為一類，鮮地黃榨汁提取物（Z1 ～ Z11）聚為一類。結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，說(shuō)明水提與榨汁制備的鮮地黃提取物有明顯差異。

圖6 聚類分析樹(shù)狀圖Fig.6 Dendrogram of cluster analysis

3 討論

本研究分別考察了不同提取溶劑、提取方式以及提取時(shí)間對(duì)鮮地黃提取物特征圖譜的影響，結(jié)果表明，加入60%甲醇超聲提取60 min，提取效率高、效果好。研究還考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)、不同波長(zhǎng)對(duì)鮮地黃提取物特征圖譜的影響，結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，在203 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行采集，色譜峰峰形好，且主要色譜峰吸收強(qiáng)度高。

通過(guò)對(duì)中醫(yī)古籍的檢索發(fā)現(xiàn)，針對(duì)不同的病癥，鮮地黃的用法不同，傳統(tǒng)最為常見(jiàn)的內(nèi)服用法包括榨汁服和水煎服兩種。本研究模擬榨汁服和水煎服兩種用法，采用水提和榨汁兩種工藝制備鮮地黃提取物，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析和化學(xué)模式識(shí)別方法，對(duì)鮮地黃水提和榨汁提取物UPLC 特征圖譜進(jìn)行差異分析。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，10 個(gè)共有峰中，鮮地黃水提提取物中有5 個(gè)共有峰峰面積值大于榨汁提取物，1個(gè)共有峰峰面積值小于榨汁提取物，其它4 個(gè)共有峰峰面積值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)水提提取物峰1、峰5、峰7、峰9、峰10 所表征的化學(xué)成分提取更為充分，而峰2 所表征的化學(xué)成分可能存在一定熱敏性，其在榨汁提取物中的含量更高；OPLS-DA 結(jié)果表明，峰1、峰2、峰5、峰7、峰9、峰10 的峰面積是導(dǎo)致鮮地黃水提和榨汁提取物質(zhì)量差異最主要的因素；PCA 和CA 均能將鮮地黃水提和榨汁提取物單獨(dú)聚為兩類。因此，采用水提和榨汁工藝制備的鮮地黃提取物的整體化學(xué)物質(zhì)存在本質(zhì)區(qū)別。相比于榨汁，采用水提的方式可有效保持藥材與溶媒間的濃度差，且加熱可加劇體系中的分子運(yùn)動(dòng)，使鮮地黃中的物質(zhì)成分提取更為充分，這可能是水提提取物峰1、峰5、峰7、峰9、峰10 所表征的化學(xué)成分的含量高于榨汁提取物的原因。此外，研究表明，鮮地黃在受熱后，其主要的環(huán)烯醚萜苷類成分易降解脫去糖基，生成非苷類環(huán)烯醚萜化合物，且降解程度與連接糖基的數(shù)目有關(guān)[7]。推測(cè)峰2 所表征的化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜單糖苷，受熱易降解，故而榨汁提取物中峰2 的峰面積值大于水提提取物。

4 結(jié)論

本研究建立了鮮地黃提取物UPLC 特征圖譜，方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。通過(guò)比較特征圖譜中10 個(gè)共有峰的峰面積值，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證實(shí)了鮮地黃水提和榨汁提取物存在明顯差異，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)臨床適應(yīng)癥制定對(duì)應(yīng)的制備工藝，保證與傳統(tǒng)用法一致，發(fā)揮鮮地黃應(yīng)對(duì)不同病癥的特殊療效。本研究可為鮮地黃現(xiàn)代制劑的制備工藝、質(zhì)量控制以及臨床使用提供參考。