納米銀敷料治療糖尿病足潰瘍的療效與安全的研究進(jìn)展

王徐紅，柳國斌，徐 磊

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院外七科，上海 201203）

糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一［1］。它是由血管病變和（或）神經(jīng)病變、感染等因素引起足部組織破壞所致。超過15%的糖尿病患者最終會(huì)發(fā)生足部潰瘍，其中超過50%會(huì)出現(xiàn)潰瘍創(chuàng)面感染，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致截肢［1］。最新研究［2］顯示，DFU 合并感染者的截肢率是未合并感染者的50～150 倍。因此，控制感染對于保肢具有重要意義?？股貙τ诳刂瓢橛邪l(fā)熱的全身感染療效顯著，但DFU 患者往往伴有下肢動(dòng)脈病變，使局部病灶的藥物濃度較低，加之耐藥菌株的出現(xiàn)，這些都為創(chuàng)面感染的控制增加了困難。隨著新技術(shù)、新材料日新月異的發(fā)展，越來越多的抗菌敷料走進(jìn)人們的視野。其中，納米銀（通常指直徑在10～100 nm）敷料以其獨(dú)特的抗菌性能引起了人們的關(guān)注。當(dāng)下，國內(nèi)外開展納米銀敷料治療DFU 的研究越來越多［3，4］。本文就其促進(jìn)DFU 創(chuàng)面愈合的原理、療效及安全性作一綜述。

1 納米銀敷料促進(jìn)DFU 創(chuàng)面愈合的原理

1.1 銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）的制備途徑

納米銀敷料采用納米技術(shù)使AgNPs 均勻牢固地附著在敷料上，使其與創(chuàng)面接觸后可持續(xù)不斷地釋放出銀離子，從而達(dá)到持久的抗菌效果。AgNPs可以通過物理、化學(xué)和生物途徑制備［5］。表1 列出了這3 種途徑的常用方法和各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 AgNPs 的制備途徑Tab 1 Preparation route of AgNPs

1.2 AgNPs 的抗菌機(jī)制

AgNPs 因?qū)Ω鞣N病原體包括細(xì)菌、真菌和病毒的顯著抗菌特性而聞名。然而，AgNPs 殺菌作用的機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為，AgNPs 的殺傷作用與其納米顆粒直接接觸細(xì)菌細(xì)胞壁，然后穿透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)有關(guān)［5］。在細(xì)菌細(xì)胞壁上直接接觸大比表面積的AgNPs 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6-9］，特別是直徑＜10 nm 的Ag-NPs 對細(xì)菌的毒性更強(qiáng)［8］。穿透細(xì)胞質(zhì)的AgNPs可能與生物分子，如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和DNA 相互作用。在某些情況下，AgNPs 可以與呼吸酶系統(tǒng)相互作用，從而產(chǎn)生活性氧（ROS），如過氧化氫（H2O2）、羥基（-OH）和超氧自由基（O2-），誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和損傷蛋白質(zhì)和核酸［10］。

相反，AgNPs 對細(xì)菌的細(xì)胞毒作用也可能是AgNPs 氧化溶解的Ag+所致。AgNPs 暴露于氣-水溶液中可被氧化生成Ag+［11］。Xiu 等［12］證明了Ag-NPs 在有氧條件下釋放的銀離子對抗菌活性起著完全的作用［12］。在有氧條件下，較小的AgNPs（約5 nm）比較大的AgNPs（11 nm）能釋放更多的Ag+。而在厭氧環(huán)境中，很少有Ag+被釋放，所以他認(rèn)為，AgNPs 本身對細(xì)菌無毒。Ag+的抗菌作用和其與巰基（-SH）的相互作用密切相關(guān)［13］。因此，Ag+可以與細(xì)胞壁結(jié)合酶和蛋白質(zhì)的-SH 基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和干擾細(xì)菌的呼吸鏈。此外，AgNPs 釋放的Ag+可以穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而降解染色體DNA［14］，或與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)硫醇基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致DNA 失去復(fù)制能力和ATP 生成所必需的蛋白質(zhì)也失去活性。一般來說，較小的銀顆粒比較大的銀顆粒更容易進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［15］。AgNPs 進(jìn)入細(xì)胞后也能釋放Ag+，從而產(chǎn)生自由基和氧化應(yīng)激。

Bondarenko 等［16］報(bào)道了以上兩種抗菌活性機(jī)制之間存在協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞與納米顆粒直接接觸可促進(jìn)Ag+從AgNPs 中釋放，從而提高細(xì)胞對顆粒相關(guān)的Ag+的攝取量。Ivask 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs釋放的正電荷離子往往會(huì)干擾大腸桿菌電子傳遞鏈的正常功能，從而促進(jìn)活性氧（ROS）的形成。而ROS 的產(chǎn)生是細(xì)菌死亡的主要原因，因?yàn)樗龠M(jìn)脂質(zhì)過氧化，抑制ATP 的生成和DNA 的復(fù)制［18］。所以，這些機(jī)制效應(yīng)可以總結(jié)為：AgNPs 或Ag+最初附著在細(xì)菌細(xì)胞壁上，隨后穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后導(dǎo)致ROS 和自由基的產(chǎn)生、DNA 損傷和蛋白質(zhì)變性。

1.3 AgNPs 抗菌效果的影響因素

AgNPs 的抗菌效果與病原菌種類有關(guān)。由于細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同——革蘭氏陽性菌（G+）的細(xì)胞壁非常厚，包含許多肽聚糖層，而革蘭氏陰性菌（G-）只有單一的肽聚糖層，因此G-菌通常比G+菌更容易受到Ag+的侵襲。

再者，AgNPs 的殺菌效果也取決于納米粒子的特性，包括尺寸、形狀、表面電荷、劑量和粒子分散狀態(tài)［19-21］。一般來說，在生理溶液中分散良好的Ag-NPs 比聚集的AgNPs 具有更強(qiáng)的殺菌效果。Ag-NPs 對G-菌和G+菌的殺滅效果隨粒徑減小而增大。如Agnihotri 等［19］合成了5、7、10、15、20、30、50、63、85 和100 nm 大小的AgNPs，并發(fā)現(xiàn)10 nm 以下的AgNPs 比較大的納米顆粒對大腸桿菌的抗菌活性最好。

另外，AgNPs 具有形狀依賴性的殺菌活性。Pal 等從紙片擴(kuò)散試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AgNPs 對107CFU/mL 大腸桿菌的殺菌效果依次為：截?cái)嗳切危厩蛐危景魻睿?2］。最近，Kidd 等［23］研究了球形和棒狀A(yù)gNPs 對肺炎克雷伯菌的效果，結(jié)果表明，球形Ag-NPs 比桿狀的對克雷伯氏菌的殺滅效果更好，且二者的殺菌活性與劑量和時(shí)間有關(guān)。

從文獻(xiàn)來看，Ag+的正電荷對其殺菌活性也是至關(guān)重要的。它通過與帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電吸引進(jìn)行殺菌［24］。與G+菌細(xì)胞壁的厚肽聚糖層相關(guān)的羧基、磷酸基、羥基和胺基使它們帶負(fù)電荷。同樣，外膜中與脂多糖相關(guān)的官能團(tuán)給G-菌細(xì)胞壁帶來整體負(fù)電荷［25］。此外，AgNPs 的殺菌效果也受其表面電荷的影響。如Abbaszadegan等［26］研究AgNPs 表面電荷對G+菌（金黃色葡萄球菌、突變鏈球菌和化膿性鏈球菌）和G-菌（大腸桿菌和尋常變形桿菌）抗菌活性的影響后指出，帶正電荷的AgNPs 對所有菌株都表現(xiàn)出最高的殺菌活性，而帶負(fù)電荷的抗菌活性最低，中性的抗菌活性中等。

2 納米銀敷料促進(jìn)DFU 創(chuàng)面愈合的療效與應(yīng)用

由于AgNPs 獨(dú)特的理化特性，特別是其比表面積，可能更具有優(yōu)勢。事實(shí)上，從直徑＜20 nm 的AgNPs 中釋放的Ag+比從直徑更大的釋放的Ag+要高出100 倍以上［27］。因?yàn)殂y可以產(chǎn)生抗菌［28］和抗炎［29］的特性，所以AgNPs 作為一種內(nèi)在的治療劑，可以促進(jìn)慢性傷口的愈合。又因其抗菌譜廣泛，因此其有望在促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合方面能發(fā)揮極好的潛力［30-32］。如Appapalam 等［33］報(bào)道，AgNPs可對DFU 主要的多重耐藥細(xì)菌的分離株，如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有殺菌抑制作用，并能促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Gohar 等從40 名DFU 患者中分離出65 株細(xì)菌，其中金黃色葡萄球菌（37%）和銅綠假單胞菌（18.5%）是潰瘍樣本中的主要分離株。他們研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖AgNPs與阿米卡星混合時(shí)顯示出最大的抗耐藥細(xì)菌活性。同時(shí)，AgNPs 可使阿米卡星最低抑菌濃度值降低95%［34］。這些研究均提示，AgNPs 對多重耐藥細(xì)菌有突出療效。

其次，納米銀敷料在促進(jìn)DFU 創(chuàng)面愈合方面，較之于傳統(tǒng)敷料有著顯著優(yōu)勢。在Essa 等［35］開展的一項(xiàng)前瞻性、雙盲、隨機(jī)、對照研究中，80 名非缺血性DFU 患者被分為兩組。A 組采用AgNPs 凝膠敷料治療，B 組采用常規(guī)敷料（含或不含聚維酮碘的濕敷料）治療，療程為12 周。結(jié)果顯示A 組的每周治愈率均明顯高于常規(guī)組。另外，該敷料還有減少換藥次數(shù)，減輕創(chuàng)面疼痛等優(yōu)勢。

此外，新的成分也可以被加入到AgNPs 中，組成了新型的復(fù)合材料，從而賦予其更加全面的治療效果。如El-Batal 等［36］用伽馬射線照射構(gòu)建的雙金屬銀-金納米粒子（Ag-Au NPs），與對照組相比，對從DFU 患者中分離的抗枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和熱帶念珠菌等菌株都表現(xiàn)出最高的抗菌性能，并能抑制其生物膜的形成。Lee 等［37］合成的新型銀和納米顆粒包裹的生長因子共載殼聚糖復(fù)合水凝膠具有持續(xù)的抗微生物特性，并能促進(jìn)糖尿病傷口愈合。

3 納米銀敷料用于創(chuàng)面安全性評價(jià)

3.1 AgNPs 的細(xì)胞毒性

許多體外模型被用以研究AgNPs 可能導(dǎo)致的潛在細(xì)胞毒性效應(yīng)。Ag+對真核細(xì)胞的毒性反映了它們殺死微生物的方式——主要通過損害蛋白質(zhì)硫醇（-SH）和產(chǎn)生ROS。真核生物產(chǎn)生ROS 的凈效應(yīng)是廣泛和多樣的，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA 的氧化損傷，其凈效應(yīng)是細(xì)胞凋亡［38］。

細(xì)胞主要通過胞飲、內(nèi)吞作用，少部分經(jīng)過細(xì)胞膜擴(kuò)散使AgNPs 進(jìn)入細(xì)胞。一旦在細(xì)胞質(zhì)中游離，AgNPs 就有可能通過多種途徑引發(fā)氧化損傷。如從納米顆粒表面溶解的Ag+可通過與H2O2的相互作用，導(dǎo)致羥基自由基（·OH）的產(chǎn)生；AgNPs 也可以直接與NAPDH 氧化酶或線粒體呼吸鏈的相互作用，從而產(chǎn)生ROS［39］。

另外，AgNPs 已被證明以線粒體為靶點(diǎn)，通過破壞呼吸鏈影響ATP 的產(chǎn)生，導(dǎo)致ROS 的進(jìn)一步產(chǎn)生和釋放［40］。研究表明，線粒體損傷后釋放Ca2+和細(xì)胞色素c（凋亡途徑的中間產(chǎn)物）。后者釋放到細(xì)胞質(zhì)室可導(dǎo)致“caspase 級聯(lián)”的啟動(dòng)，其凈效應(yīng)是細(xì)胞凋亡［41］。再者，細(xì)胞內(nèi)鈣水平的升高也可能影響Ca2+/鈣調(diào)素依賴的酶，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

有研究表明將人肺成纖維細(xì)胞和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞暴露在濃度高達(dá)400 μg/mL 的AgNPs 下，觀察到ROS 的產(chǎn)生增加，ATP 的生成減少［42］。他們還注意到AgNPs 在細(xì)胞質(zhì)、核內(nèi)體、線粒體和細(xì)胞核均有分布，并確定AgNPs 導(dǎo)致的DNA 損傷具有濃度依賴的遺傳毒性，而ROS 也可間接導(dǎo)致遺傳毒性。

3.2 銀在體內(nèi)的分布

由于倫理和檢測技術(shù)等原因，目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道創(chuàng)面局部外用納米銀敷料后銀離子在人體內(nèi)的分布、代謝等情況。陳丹丹等［43］開展的一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)或許可以為我們提供這方面的認(rèn)識(shí)。作者按體重將0.33 g/kg 納米銀或微米銀植入大鼠背部皮下組織，12 周后測定了大鼠不同臟器中的銀含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀在脾、腎、肝、腦、睪丸中蓄積的濃度較高，且納米銀在各臟器中的蓄積濃度遠(yuǎn)高于微米銀，最多可達(dá)到61.9 倍［43］。

此外，Walker 等［44］分析了使用含銀的傷口敷料后，銀離子在人體的可能分布：（1）釋放的銀離子被創(chuàng)面局部、周圍的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或可溶性蛋白迅速結(jié)合；（2）結(jié)合可溶性蛋白的銀可能被系統(tǒng)吸收，并通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到遠(yuǎn)處的器官；（3）被結(jié)合的銀可能被進(jìn)一步代謝：通過皮膚的正常組織更替、糞便或尿液排出體外，或礦化并以惰性、不溶性硒化物和硫化物的形式留在體內(nèi)。但作者強(qiáng)調(diào)，正常使用含銀敷料對局部和系統(tǒng)造成的短期和長期毒性的風(fēng)險(xiǎn)是很低的，可以忽略不計(jì)。

3.3 劑量問題

目前，絕大多數(shù)致力于AgNPs 效果的研究都是在體外進(jìn)行的，而試驗(yàn)選擇的劑量都普遍較高。事實(shí)上，納米銀的許多潛在的生物學(xué)效應(yīng)很可能只有在高濃度時(shí)才會(huì)發(fā)生，而傷口敷料的含銀濃度往往較低。因此，在許多情況下，毒性研究的結(jié)果與現(xiàn)實(shí)創(chuàng)面暴露的相關(guān)性并不明確［38］。其次，在任何體外研究中，引入模型系統(tǒng)的劑量與細(xì)胞可用的劑量之間也可能存在差異。當(dāng)試圖用體外系統(tǒng)的結(jié)果來推斷其在體內(nèi)系統(tǒng)的作用時(shí)，考慮到生理和代謝對整個(gè)生物體的影響，這就更加復(fù)雜了［38］。

或許，Cha 等［45］研究所使用的AgNPs 濃度能更好地反應(yīng)其對體內(nèi)細(xì)胞毒性的影響。研究者將人肝癌細(xì)胞置于濃度為2.4 μg/mL、直徑為15 nm 的AgNPs 中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中還原型谷胱甘肽（GSH）的水平和線粒體的功能未受干擾，但確實(shí)觀察到了DNA損傷。

可能與AgNPs 皮膚暴露最相關(guān)的研究是Arora等［46］的工作，他們研究了7～20 nm AgNPs 對小鼠原發(fā)成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞的影響，并觀察到GSH 的降低和超氧化物歧化酶（SOD）水平的升高。因此，作者推測，在較低濃度的銀（纖維母細(xì)胞為25 μg/mL，肝細(xì)胞為100 μg/mL）時(shí)，細(xì)胞的抗氧化保護(hù)機(jī)制增強(qiáng)。值得注意的是，無毒的濃度范圍與納米銀敷料局部應(yīng)用的濃度范圍相當(dāng)，這為該敷料的安全性提供了證據(jù)［46］.

此外，當(dāng)比較AgNPs 毒性和作用模式時(shí)，還需要考慮不同批次顆粒的特性。Ahamed 等［47］比較了多糖包被和未包被銀納米顆粒的作用，得出的結(jié)論是包被的AgNPs 比未包被的對DNA 的損傷程度更大，兩種類型的AgNPs 可能經(jīng)歷不同的胞內(nèi)分布模式。

4 總結(jié)和展望

DFU 伴感染是創(chuàng)面經(jīng)久難愈，甚至截肢的重要原因之一。而隨著抗菌藥物耐藥問題的日益嚴(yán)重，尋求替代抗菌藥物的壓力也越來越大。AgNPs 因其獨(dú)特的理化性質(zhì)和抗菌特性，已被證明在DFU 治療中非常有效［3］。銀用于抗感染已有悠久的歷史，但至今仍未見大規(guī)模的耐藥，這與抗生素廣泛性耐藥形成鮮明對比。因此，該敷料值得在治療DFU 方面推廣應(yīng)用。

關(guān)于AgNPs 在人體吸收、分布、代謝和排泄等具體過程，我們尚不清楚。如：細(xì)胞從受傷皮膚中攝取AgNPs 的機(jī)制和程度的問題？AgNPs 能否被轉(zhuǎn)移到全身部位，進(jìn)入大腦或穿過胎盤，它們?nèi)绾螐捏w內(nèi)清除？在細(xì)胞內(nèi)是否會(huì)侵害DNA 并造成遺傳損傷的能力？與潛在毒性相關(guān)的AgNPs 表面特征是什么？等等。然而，這些問題并不意味著在DFU 治療中使用此類敷料可能存在安全問題。但這或許是研究者未來探索的方向。目前，能做的可能是摸索治療各類慢性潰瘍，包括DFU 能夠取得最佳療效和安全性的合適劑量。

AgNPs 在殺傷抑制感染創(chuàng)面微生物的同時(shí)，對人體的正常細(xì)胞也會(huì)有一定的細(xì)胞毒性作用，可引起正常細(xì)胞的凋亡。但臨床尚未見其明顯毒性反應(yīng)。因此，筆者認(rèn)為其收益/風(fēng)險(xiǎn)比是有利的，特別是對于出現(xiàn)耐藥菌株的DFU 創(chuàng)面。盡管如此，筆者還是建議使用此類敷料的時(shí)間不應(yīng)超過2 周，如White 等［48］所述。對于特大面積的創(chuàng)面，尤應(yīng)關(guān)注其對局部和全身的不良反應(yīng)。另外，納米顆粒比傳統(tǒng)配方提供了更高的銀含量，因此我們在臨床應(yīng)用時(shí)需要進(jìn)一步研究不同配方的敷料之間的收益/風(fēng)險(xiǎn)比。

作者貢獻(xiàn)度說明：

王徐紅：文獻(xiàn)檢索與收集，論文撰寫：徐磊：文獻(xiàn)檢索與收集；柳國斌：論文撰寫的指導(dǎo)與修正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。