應(yīng)用ARFI 技術(shù)探討肝豆湯治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型Wilson 病肝纖維化的臨床研究

韓 卉，汪美霞，陶 莊，張艷云，張 宇，蔣真真，王 飛，孫 闊

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038）

肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson ?。╓ilson's disease，WD）是一種因常染色體上的ATP7B 基因突變，導(dǎo)致機(jī)體銅代謝異常，進(jìn)而損害全身臟器的隱性遺傳性疾病，臨床常見肝、腦、腎等人體器官損害［1-3］。肝纖維化是WD 患者肝損傷的重要表現(xiàn)。前期研究顯示［4］，肝纖維化經(jīng)有效治療可以逆轉(zhuǎn)。肝穿刺診斷肝纖維化屬有創(chuàng)性檢查，難以重復(fù)進(jìn)行，所以無創(chuàng)性肝纖維化診斷技術(shù)近年較引人注目。聲輻射力脈沖彈性成像（acoustic radiation force impulse，ARFI）先進(jìn)行肝臟常規(guī)超聲檢測(cè)，通過檢測(cè)選擇待評(píng)價(jià)區(qū)域，可避免解剖學(xué)障礙（如血管等），是一種簡(jiǎn)便、具有可重復(fù)性的無創(chuàng)評(píng)價(jià)肝纖維化的方法，對(duì)肝纖維化、肝硬化有較好的診斷價(jià)值，因而ARFI技術(shù)的應(yīng)用具有重要的臨床意義［5，6］。

研究表明［7，8］，ARFI 所得肝臟剪切波速度（Shear wave velocity，SWV）聯(lián)合APRI 評(píng)分（Aspartate Aminotransferase to Platelet Ratio Index）、FIB-4 指數(shù)（Fibrosis-4 index）及聯(lián)合肝纖四項(xiàng)Ⅳ型膠原（type Ⅳ collagen，CⅣ）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前膠原N 端肽（type Ⅲ procollagen peptide，PⅢNP）、層黏連蛋白（laminin，LN）共同診斷可顯著提高肝纖維化的診斷率。

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科作為國(guó)家中醫(yī)重點(diǎn)專病肝豆?fàn)詈俗冃栽\療中心，采用中醫(yī)藥治療Wilson 病臨床療效顯著。既往研究均表明［9，10］，GDT 具有清熱解毒、通腑利濕的功效。故本研究在前期研究基礎(chǔ)上，選取濕熱內(nèi)蘊(yùn)型Wilson 病肝纖維化患者，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)SWV 水平，探討SWV 與肝纖維化血清學(xué)指標(biāo) HA、C Ⅳ、LN、P ⅢNP 及APRI 評(píng)分、FIB-4 指數(shù)的相關(guān)性，進(jìn)而反映肝纖維化程度的變化，為GDT 治療WD 肝纖維化提供臨床療效參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集80 例2021 年8 月～2022 年8 月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科住院濕熱內(nèi)蘊(yùn)型WD患者，根據(jù)治療方法分為治療組和對(duì)照組，每組40例。治療組男性22 例，女性18 例，年齡（15～57）歲，平均（32.2±10.24）歲，平均病程（8.32±6.72）年；對(duì)照組男性20 例，女性20 例，年齡（16～55）歲，平均（31.63±9.18）歲；平均病程（8.50±5.32）年。各組一般資料之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 WD 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2008 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《肝豆?fàn)詈俗冃缘脑\斷與治療指南》［11］制定。

1.2.2 WD 濕熱內(nèi)蘊(yùn)證診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照楊文明教授《肝豆?fàn)詈俗冃栽\療方案》［12］，WD 濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：手足震顫，言語(yǔ)含糊，行走困難，肢僵攣縮，口苦口臭，口涎不止，鼻衄齒衄，黃疸水臌，腹脹痞滿，尿赤，大便秘結(jié)，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈弦滑數(shù)。

1.2.3 WD 肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn) 目前臨床上診斷肝纖維化可進(jìn)行肝活檢，當(dāng)肝組織病理檢查纖維化程度在F2 以上，即可確診為肝纖維化。因肝活檢屬于有創(chuàng)性檢查，患者也可行ARFI 技術(shù)檢測(cè)，ARFI達(dá)到肝臟纖維化硬度值，可確診為肝纖維化［13］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合 WD 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)證候分型特征；（2）同時(shí)符合肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）所有患者均為初診或半年內(nèi)未經(jīng)規(guī)范排銅治療；（4）研究對(duì)象了解研究目的，自愿參加研究并簽署知情同意書（未成年患者需監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書）。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）妊娠期及哺乳期患者；（2）合并自身免疫性肝病者；（3）合并感染類疾病、免疫性疾病者；（4）合并嚴(yán)重精神障礙及其他嚴(yán)重心、腎功能損害者；（5）無癥狀的WD 患者；（6）臨床資料不完整者；（7）依從性不佳者。

1.5 治療方法

1.5.1 對(duì)照組 予以二巰丙磺鈉（DMPS，上海禾豐制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31021514）靜滴。將二巰丙磺鈉20 mg/kg 溶于250 mL 5%葡萄糖溶液靜脈滴注，連續(xù)6 d，間歇期為2 d，間歇期每日靜脈滴注20 mL 的10%葡萄糖酸鈣，此8 d 為1 個(gè)療程，共治療6 個(gè)療程。

1.5.2 治療組 在對(duì)照組基礎(chǔ)上予以肝豆湯（組方：半枝蓮、黃芩、穿心蓮、生大黃、黃連、萆薢），所有飲片均來自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，并由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制成水煎劑，每日一劑（約200 mL），早晚分服，8 d 為1個(gè)療程，共治療6 個(gè)療程。

1.6 觀察指標(biāo)及療效判斷

（1）肝臟剪切波速度（SWV）：采用4C1 凸陣探頭的彩色多普勒超聲診斷儀（SIEMENS Acuson S2000），配置 ARFI 成像系統(tǒng)，其頻率區(qū)間為 1.5～4.0 MHz。首先，囑患者平臥位，在空腹?fàn)顟B(tài)下行肝臟常規(guī)超聲掃查及彩色血流顯像，然后，囑患者左側(cè)臥位，并抬高右上肢，將肝區(qū)充分暴露，將探頭置于右側(cè)腋前線至腋中線第7～9 肋間進(jìn)行掃查，注意避開肝內(nèi)大血管、膽管結(jié)構(gòu)（如門靜脈、肝動(dòng)靜脈及膽道系統(tǒng)），囑患者屏氣，啟動(dòng) ARFI 成像系統(tǒng)，測(cè)量肝臟的剪切波速度（SWV），重復(fù)5 次，取5 次測(cè)量值的平均值。

（2）實(shí)驗(yàn)室檢查：分別采取治療前、后兩組的外周靜脈血。采用放射免疫法測(cè)定肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)：HA、LN、PC Ⅲ、C-Ⅳ（批號(hào)：20190409，20190412，20190427，20190407，鄭州安圖生物工程股份有限公司）。采用乳酸脫氫法檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），ALT，AST 試劑盒來自貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（蘇州）有限公司，批號(hào)分別為AUZ9248，AUZ8788；采用固相凝固法檢測(cè)血小板（PLT）（批號(hào)：A1042，希森美康株式會(huì)社）。各指標(biāo)測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的操作步驟進(jìn)行。

（3）無創(chuàng)性血清指標(biāo)評(píng)分：APRI 計(jì)算公式：（AST/正常值上限）×100/PLT［14］；FIB-4 指數(shù)計(jì)算公式：（年齡×AST）/（PLT×）［15］

（4）不良反應(yīng)及安全性評(píng)價(jià)：監(jiān)測(cè)治療中有無引起肝功能繼發(fā)損害（如ALT、AST），腎功能損害（如肌酐Cr、尿素氮BUN），有無皮膚瘙癢等過敏癥狀等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間治療前后對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組內(nèi)治療前后對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

兩組治療前HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平，具有可比性（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與本組治療前比較，治療組與對(duì)照組 HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平均顯著下降（P＜0.05）；相較于對(duì)照組，治療組療后HA、LN、PⅢNP 下降更為顯著（P＜0.05），CⅣ水平無明顯特異性變化（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組治療前后肝纖四項(xiàng)指標(biāo)情況比較（n=40，±s）Tab 1 Comparison of four indexes of liver fiber between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

表1 兩組治療前后肝纖四項(xiàng)指標(biāo)情況比較（n=40，±s）Tab 1 Comparison of four indexes of liver fiber between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

注：與本組治療前比較*P＜0.05，**P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較 #P＜0.05。

LN（μg/mL）154.72±51.79 115.80±32.55**154.68±56.06 98.31±26.38**#組別對(duì)照組治療組時(shí)間治療前治療后治療前治療后HA（μg/mL）164.31±98.71 116.20±69.45*166.80±62.09 90.72±37.10**#PIIINP（μg/mL）27.99±16.36 17.60±10.59**28.50±18.83 12.91±6.03**#CIV（μg/mL）107.37±68.69 75.30±54.44**106.89±74.26 64.64±44.87*

2.2 兩組治療前后SWV、APRI 及 FIB-4 評(píng)分的變化

治療前，兩組患者的SWV、APRI 及 FIB-4 評(píng)分，具有可比性（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后，兩組SWV、APRI 及 FIB-4 評(píng)分均顯著性降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相較于對(duì)照組，治療組FIB-4 評(píng)分明顯下降（P＜0.05），SWV 及APRI 下降更為顯著（P＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 兩組患者治療前后SWV 數(shù)值及無創(chuàng)血清模型（APRI 評(píng)分、FIB-4 指數(shù)）比較（n=40，±s）Tab 2 Comparison of SWV value and non-invasive serum model （APRI score and FIB-4 index）between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

表2 兩組患者治療前后SWV 數(shù)值及無創(chuàng)血清模型（APRI 評(píng)分、FIB-4 指數(shù)）比較（n=40，±s）Tab 2 Comparison of SWV value and non-invasive serum model （APRI score and FIB-4 index）between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

注：與本組治療前比較 **)P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較 #）P＜0.05, ##）P＜0.01。

FIB-4 2.38±0.48 1.75±0.53**2.39±0.89 1.20±0.35**#組別對(duì)照組治療組時(shí)間治療前治療后治療前治療后SWV 1.77±1.50 1.48±1.62**1.79±1.87 1.29±0.98**##APRI 1.76±0.48 0.99±0.29**1.71±0.69 0.59±0.20**##

2.3 SWV 與血清 HA、CⅣ、LN、PⅢNP 及 APRI、FIB-4 的相關(guān)性研究

Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析，SWV 與 FIB-4（r=0.83）、APRI（r=0.82）、HA（r=0.87）、C Ⅳ（r=0.71）、LN（r=0.85）、PⅢNP（r=0.77）呈正相關(guān)（表3）。其中SWV 與HA、LN、APRI 、FIB-4 成高度相關(guān)，SWV 與CIV、PⅢNP 成中度相關(guān)。見圖1、2。

圖1 SWV 與 HA、CⅣ、LN、PⅢNP 的相關(guān)性分析Fig 1 Correlation analysis of SWV with HA，CIV，LN and PIIINP

圖2 SWV 與 APRI、FIB-4 的相關(guān)性分析Fig 2 Correlation analysis of SWV，APRI and FIB-4

表3 SWV 與血清HA、CⅣ、LN、PⅢNP 及無創(chuàng)血清模型APRI、FIB-4 的相關(guān)性Tab 3 Correlation between SWV and serum HA，CIV，LN，PⅢNP and non-invasive serum model APRI，F(xiàn)IB-4

2.4 安全性指標(biāo)

兩組患者治療前ALT、AST、BUN、Cr 水平具有可比性（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與本組治療前比較，治療組與對(duì)照組ALT、AST 水平均顯著下降（P＜0.01）；相較于對(duì)照組，治療組療后ALT、AST 下降更為顯著（P＜0.05），而BUN、Cr 水平無明顯特異性變化（P＞0.05）。見表5。

表5 兩組患者治療前后ALT、AST、BUN、Cr 數(shù)值比較（n=40，±s）Tab 5 Comparison of ALT，AST，BUN and Cr values between the two groups before and after treatment （n=40，±s）

表5 兩組患者治療前后ALT、AST、BUN、Cr 數(shù)值比較（n=40，±s）Tab 5 Comparison of ALT，AST，BUN and Cr values between the two groups before and after treatment （n=40，±s）

注：與本組治療前比較*P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較#P＜0.01。

Cr(μmol/L)71.02±11.21 71.20±13.27 75.37±12.44 71.84±11.21組別對(duì)照組治療組時(shí)間治療前治療后治療前治療后ALT(U/L)79.52±13.22 48.63±10.60*77.45±15.91 36.53±8.60*#AST(U/L)69.18±17.05 48.90±13.19*70.02±14.87 37.31±7.36*#BUN(mmol/L)5.22±1.26 4.86±1.12 5.04±1.30 5.05±0.98

2.5 藥物安全性評(píng)價(jià)

所有入組并服用GDT 患者治療后未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，未出現(xiàn)肝腎功能加重或新發(fā)損傷表現(xiàn)，1例患者出現(xiàn)輕微皮膚瘙癢，未予特殊處理后自行緩解。

3 討論

肝豆?fàn)詈俗冃栽谥嗅t(yī)古籍中并沒有明確的記載，根據(jù)其相關(guān)臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“肝風(fēng)”、“顫病”等范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“諸逆沖上，皆屬于火”，“諸痙項(xiàng)強(qiáng)，皆屬于濕”。本病主要由于先天稟賦不足，銅毒內(nèi)生，釀生濕熱，濕熱銅毒蘊(yùn)積于體內(nèi)，瘀滯經(jīng)脈所致［16］。

GDT 是我院腦病中心治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型WD 患者多年臨床觀察與總結(jié)所得的經(jīng)驗(yàn)方，以清熱解毒、通腑利濕為組方原則創(chuàng)方，組成為黃芩、大黃、黃連、半枝蓮、穿心蓮、萆薢。王浩澤等［17-19］研究表明，大黃素可抑制MAPK 通路及EMT，也可調(diào)控ERK/Nur77 促進(jìn)Gls1 啟動(dòng)子甲基化，上調(diào) Smad7、下調(diào) α-SMA 蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。劉世杰等［20-22］研究表明，黃芩苷可通過抑制大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 的表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化作用，亦可通過抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，而起到抗肝纖維化的作用。劉國(guó)芳等［23］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以下調(diào)肝纖維化大鼠SOCS1 水平，抑制HSC-T6 細(xì)胞增殖，從而減輕肝纖維化。歐意桃等［24］實(shí)驗(yàn)研究表明，黃連素抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用可有效抗肝纖維化。半枝蓮中的黃酮類、二萜類等活性成分具有清熱、抗炎、保肝及抗氧化等多種藥理作用［25］。謝婧等［26，27］指出脫水穿心蓮內(nèi)酯可以下調(diào)氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)，減少肝星狀細(xì)胞活化，從而發(fā)揮抗纖維化作用。另有研究表明［28，29］，肝豆湯可通過調(diào)控引起細(xì)胞程序性死亡（PCD）的ERK 通路和 MAPK 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而降低WD 肝纖維化的病理?yè)p害過程，從而促進(jìn)細(xì)胞排銅，也可激活肝臟Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，促進(jìn)損傷的肝組織代償性自愈，減輕銅對(duì)肝臟的損傷。

肝臟是WD 最早、最主要的受累器官［30］，而肝纖維化是銅代謝障礙引起的最基本的肝臟病理變化［31］。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積銅離子時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死，肝臟受到不同程度的損害，肝臟的硬度逐漸發(fā)生變化，由肝纖維化逐漸進(jìn)展為肝硬化、肝癌。肝纖維化為可逆階段，通過治療可以使肝纖維化逆轉(zhuǎn)，但肝硬化多難以逆轉(zhuǎn)。因此，及早采取有效診斷及治療對(duì)于逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有重要意義［32］。對(duì)于肝纖維化診斷，相比于以往有創(chuàng)性、易感染的肝穿刺活檢，近些年來無創(chuàng)肝纖維化診斷方法，因其無創(chuàng)、不易感染、準(zhǔn)確度高和可重復(fù)等優(yōu)勢(shì)，已成為臨床診斷的首選［31］。ARFI 的工作原理是利用超聲波束在肝組織內(nèi)產(chǎn)生聲剪切波信號(hào)，使其局部產(chǎn)生微小變形，并監(jiān)測(cè)低頻剪切波的傳播速度，得到肝組織彈性分布［33］。既往研究［34］表明在肝纖維化的診斷中，ARFI 作為診斷肝纖維化程度的可靠手段，失敗率更低，并可用于有肥胖及腹水的患者，可有效避開肝內(nèi)血管和肋骨，并能夠定量分析肝臟脂肪變性程度。臨床治療時(shí)，在治療各時(shí)期采用ARFI 技術(shù)觀察和定量分析WD 患者肝臟維化程度，可有效監(jiān)測(cè)WD 患者病情、臨床療效、并對(duì)預(yù)后進(jìn)行判斷。此外，APRI 和 FIB-4 對(duì)于肝纖維化程度的評(píng)估也具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值［35，36］，且與肝纖四項(xiàng)及ARFI 合用，可提高肝纖維化、肝硬化的診斷率［7，8］。張潔媛等［37］分析102 例膽道閉鎖患兒SWV 值與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BA 患兒的SWV 值與HA、CⅣ、LN 均呈顯著的正相關(guān)性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。說明SWV 可與肝纖維化血清指標(biāo)共同反應(yīng)肝纖維化程度，且剪切波速度值越高，說明肝臟纖維化程度越重。本研究結(jié)果中，治療組SWV 值及HA、LN、PⅢNP 明顯低于對(duì)照組，說明肝豆湯可以顯著改善肝纖維化，提高患者生活質(zhì)量。

綜上，肝豆湯聯(lián)合DMPS 綜合驅(qū)銅保肝治療，可顯著改善WD 患者肝纖維化程度，且肝豆湯為中藥湯劑，具有不良反應(yīng)小，安全性高及價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，作為臨床治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型WD 肝纖維化患者的診療方案值得推廣。本研究的不足之處在于，樣本資料較少，容量較局限，且研究時(shí)間相對(duì)較短，在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，可能存在統(tǒng)計(jì)誤差，故后期將進(jìn)行大樣本、隨機(jī)、長(zhǎng)期的研究，以減小統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，提供更多數(shù)據(jù)支撐。本文重在肝臟方面研究，但WD可累及腎臟、心臟等，后期本課題組將進(jìn)一步進(jìn)行腎臟、心臟等方面相關(guān)研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

汪美霞：設(shè)計(jì)研究思路、基金支持及論文審校；韓卉：方案實(shí)施及論文撰寫；陶莊、張艷云：論文修改、文獻(xiàn)檢索；張宇：數(shù)據(jù)審校；蔣真真：數(shù)據(jù)收集；王飛、孫闊：統(tǒng)計(jì)分析。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。