組蛋白去乙酰化酶抑制劑Chidamide 抑制C2C12骨骼肌細(xì)胞分化及其機(jī)制

張露露，郭洋，王新莉，牛文彥

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300134）

骨骼肌是人體最大的組織，重量約占體重的40%，在調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝、運(yùn)動(dòng)、能量穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。骨骼肌分化，即成肌，是一個(gè)多步驟過(guò)程，包括骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖、分化和多核肌纖維形成[2]。根據(jù)肌球蛋白重鏈（MyHC）的不同，骨骼肌主要分為四型多核肌纖維，即Ⅰ型肌原纖維（MyHC Ⅰ）、Ⅱa 型肌原纖維（MyHCⅡa）、Ⅱb 型肌原纖維（MyHC Ⅱb）和Ⅱx 型肌原纖維（MyHC ⅡIx）[3]。生肌調(diào)節(jié)因子4（MRF4）、生肌因子5（Myf5）、MyoD 和MyoG 是基本螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員，這些因子在胚胎發(fā)生和出生后肌發(fā)生期間調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的決定和分化[4]。MyoD 和MyoG 的激活可促進(jìn)MyHC 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肌分化[5]。此外，MyoG 在調(diào)控肌纖維類(lèi)型和氧化代謝中也發(fā)揮重要作用。

組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）是一類(lèi)蛋白酶，在染色體結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。人類(lèi)基因組有18 種不同的HDACs，分為4 類(lèi)，Ⅰ類(lèi)（HDAC1、2、3、8）、Ⅱ類(lèi)（Ⅱa：HDAC4、5、7、9；Ⅱb：HDAC6、10）、Ⅲ類(lèi)即沉默信息調(diào)節(jié)因子2 和Ⅳ類(lèi)（HDAC11）。又根據(jù)對(duì)活性的要求將其分為鋅依賴(lài)家族和輔因子NAD+依賴(lài)家族。其中Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)和Ⅳ類(lèi)HDACs 為鋅依賴(lài)家族，被廣泛研究[6]。臨床研究顯示小分子HDAC 抑制劑在治療癲癇、躁郁癥、癌癥和許多其他疾病時(shí)會(huì)對(duì)骨細(xì)胞群產(chǎn)生影響。此外，越來(lái)越多的研究證實(shí)HDAC 在骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用[7]。西達(dá)本胺（Chidamide）是一種新型苯甲酰胺類(lèi)HDAC 抑制劑，在淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、軟組織肉瘤[8]、肺癌[9]中顯示出良好的治療效果，但是Chidamide 對(duì)骨骼肌發(fā)育的影響尚不明確，本研究旨在探討Chidamide 在體外對(duì)C2C12 骨骼肌細(xì)胞分化及肌纖維類(lèi)型的影響和其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠骨骼肌細(xì)胞株C2C12（購(gòu)自美國(guó)ATCC），胎牛血清、馬血清（以色列Bioind），DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBO），二甲基亞砜（西格瑪上海有限公司），西達(dá)苯胺（中國(guó)MCE 公司），Trizol 裂解液（美國(guó)Ambion 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR Mix（北京TransGen Biotech），羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，Actinin1 抗體（美國(guó)Sigma），MyHC、MyoG（Santa 公司），Pan-acetyl H3 抗體（Active Motif 公司），Myh7、Myh4、Myh1（Proteintech 公司），Myh2（Affinity 公司），β-actin 抗體（中國(guó)Abclonal），DAPI、熒光二抗（天津博誠(chéng)科技有限公司），耦聯(lián)HRP 的山羊抗鼠抗體和山羊抗兔抗體（美國(guó)Jackson Immuno Research），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)的試劑盒（美國(guó)Millipore），Tannon-5200 顯影儀（北京原平皓生物有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 將C2C12 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，換成DMEM 高糖培養(yǎng)基（含5%馬血清）培養(yǎng)48 h，再分別與含有二甲基亞砜（DMSO）和西達(dá)苯胺（Chidamide）的分化培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到90%融合時(shí)消化細(xì)胞，吸取細(xì)胞進(jìn)行稀釋?zhuān)⒃谟?jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，按照每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞密度，接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度（0、0.5、1、2、4 μmol/L）Chidamide 孵育，48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光 將不同條件處理的C2C12細(xì)胞加入4%多聚甲醛固定，加入含0.1%Trixon 的PBS 打孔。用1%BSA 室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，第2 天，熒光二抗室溫避光孵育30 min。DAPI避光染核，顯微鏡下拍照。

1.2.4 組蛋白提取 將各組細(xì)胞用含丁酸鈉的冰PBS 沖洗兩次，離心，棄上清，收集細(xì)胞。用TEB 溶解細(xì)胞，離心，棄上清。加入0.2 mol/L 的硫酸溶液溶解蛋白，過(guò)夜提取組蛋白，然后用TCA 溶液沉淀組蛋白。將溶液離心，棄上清，用丙酮溶液沖洗沉淀，離心，棄上清。沉淀干燥，加水溶解。

1.2.5 RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集各組細(xì)胞，每孔加入500 μL Trizol 裂解細(xì)胞，然后收集到RNase free 管，加入100 μL 氯仿，混勻后室溫靜置5 min，然后12 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上層透明RNA 到新的RNase free 管。加入異丙醇，混勻，靜置10 min 后，離心，吸取管底的白色膠樣RNA，用75%乙醇（DEPC 水配置）重復(fù)洗兩遍后，加入20 μL 無(wú)酶水，金屬浴助溶，58℃，2 min。然后測(cè)RNA 濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟合成cDNA 并稀釋5 倍。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的說(shuō)明書(shū)配置20 μL 反應(yīng)體系并進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)qPCR 得出的熒光曲線Ct 值，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果。所用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增反應(yīng)所需引物序列Tab 1 Primer sequences for amplification reaction

1.2.6 Western 印跡 收集各組細(xì)胞，用RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞并提取總蛋白。制備10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗（β-actin按1∶5 000 比例，Actinin1 按1∶5 000 比例，MyHC、MyoG 按1∶500 比例，Myh7、Myh4、Myh1 按1∶1 000比例，Myh2 按1∶2 000 比例，用1%BSA 稀釋配置）4℃過(guò)夜孵育，次日，二抗室溫孵育2 h，然后ECL 顯色后曝光，Image J 進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism6 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以表示，兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Chidamide 對(duì)C2C12 細(xì)胞活力和組蛋白乙酰化 水平 的影響 CCK-8 檢測(cè)不同濃度（0、0.5、1、2、4 μmol/L）Chidamide 對(duì)C2C12 細(xì)胞活力的影響（圖1A），結(jié)果顯示，不同濃度的Chidamide 不影響C2C12 細(xì)胞活力（F=0.058，P＞0.05），選用4 μmol/L Chidamide 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。Western 印跡結(jié)果顯示，Chidamide 顯著升高Pan-acetyl H3 蛋白水平 （t=3.22，P＜0.05）（圖1B）。

圖1 Chidamide 對(duì)細(xì)胞活力和Pan-acetyl H3 水平的影響Fig 1 Effects of Chidamide on cell viability and Pan-acetyl H3 levels

2.2 Chidamide 對(duì)C2C12 細(xì)胞分化的影響 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Chidamide 組MyHC 陽(yáng)性的肌纖維明顯減少，肌細(xì)胞融合受損，融合指數(shù)降低，推測(cè)Chidamide 可能抑制C2C12 細(xì)胞的分化（圖2A）。進(jìn)一步檢測(cè)MyHC 的蛋白和mRNA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Chidamide 組MyHC 的mRNA 水平顯著降低（t=26.87，P＜0.01），MyHC 蛋白水平也顯著降低（t=5.71，P＜0.01，圖2B、2C）。

圖2 Chidamide 對(duì)MyHC 表達(dá)的影響Fig 2 Effect of Chidamide on MyHC expression

2.3 Chidamide 對(duì)C2C12 細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，Chidamide 組MyoD 和MyoG 的mRNA 水平顯著降低（t=5.81、4.86，均P＜0.01），蛋白水平也顯著降低（t=6.05、7.37，均P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 Chidamide 對(duì)MyoD 和MyoG 的影響Fig 3 Effect of Chidamide on MyoD and MyoG expression

2.4 Chidamide 對(duì)Ⅰ型肌原纖維的影響 與對(duì)照組相比，Chidamide 組Myh7 的mRNA 水平顯著降低（t=4.85，P＜0.01），其蛋白水平也顯著降低（t=3.93，P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 Chidamide 對(duì)Myh7 的影響Fig 4 Effect of Chidamide on Myh7 expression

2.5 Chidamide 對(duì)Ⅱ型肌原纖維的影響 與對(duì)照組相比，Chidamide 組Myh1 和Myh2 的mRNA 水平顯著降低（t=15.48、16.82，均P＜0.001，圖5A），蛋白水平也顯著降低（t=14.13、5.05，均P＜0.01，圖5B），但Chidamide 不影響Myh4 的mRNA 水平（t=1.50，P＞0.05，圖5C）和蛋白水平（t=2.19，P＞0.05，圖5D）。

圖5 Chidamide 對(duì)Myh1、Myh2 和Myh4 的影響Fig 5 Effect of Chidamide on the expression of Myh1,Myh2 and Myh4

3 討論

在表觀遺傳機(jī)制中，組蛋白去乙?；驯蛔C明影響肌肉再生[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，HDAC1 通過(guò)叉頭盒蛋白3a（FoxO3a）誘導(dǎo)肌肉萎縮[11]；HDAC3 調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝[12]；敲降HDAC4 通過(guò)抑制MyoG 依賴(lài)性萎縮基因激活來(lái)緩解去神經(jīng)誘導(dǎo)的肌肉萎縮[13]。組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275 通過(guò)下調(diào)破骨細(xì)胞生成轉(zhuǎn)錄因子（c-Fos）表達(dá)，防止破骨細(xì)胞生成并抑制小鼠骨質(zhì)流失。組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸通過(guò)抑制癌癥惡病質(zhì)中CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）調(diào)節(jié)的萎縮基因1（Atrogin1）表達(dá)，減輕骨骼肌萎縮[14]。組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹 通過(guò)凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）-絲裂原活化蛋白激酶3/4/6（MKK3/4/6）-c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）途徑在分化的C2C12 肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）[15]。

Chidamide 是Ⅰ類(lèi)（HDAC1、2、3） 和Ⅱb 類(lèi)（HDAC10）HDAC 抑制劑，對(duì)骨骼肌細(xì)胞分化的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)了不同濃度Chidamide 對(duì)細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)Chidamide 不影響細(xì)胞活力并且使組蛋白乙?；缴摺Ｍㄟ^(guò)細(xì)胞免疫熒光MyHC 染色，發(fā)現(xiàn)Chidamide 使MyHC 陽(yáng)性肌纖維的比例降低，使肌細(xì)胞融合受損，推測(cè)Chidamide 可能抑制C2C12 細(xì)胞分化。接下來(lái)筆者進(jìn)一步檢測(cè)了MyHC 的mRNA 和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Chidamide 處理后顯著降低MyHC 的表達(dá)，結(jié)果與其免疫熒光染色結(jié)果一致，說(shuō)明Chidamide 抑制C2C12 細(xì)胞分化。

肌源性分化是骨骼肌發(fā)育的一個(gè)重要過(guò)程，它決定了成肌細(xì)胞命運(yùn)、肌肉形成和再生。肌源性調(diào)節(jié)因子Myf5、MyoD、MyoG、MRF4 調(diào)控骨骼肌細(xì)胞增殖、分化和融合[16]。MyoD 在肌分化早期表達(dá)，結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子中的E-box 序列，從而與肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（Mef2）轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同驅(qū)動(dòng)肌肉相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)肌分化；MyoG 表達(dá)較晚，是骨骼肌分化所必需的因子，通過(guò)促進(jìn)成肌細(xì)胞融合和肌纖維形成來(lái)促進(jìn)分化。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，C2C12 細(xì)胞中MyoG 的轉(zhuǎn)錄激活會(huì)增強(qiáng)肌分化[17]；HDAC11 通過(guò)抑制MyoD 依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制成肌細(xì)胞分化[18]。因此，筆者檢測(cè)了MyoD、MyoG 的mRNA 和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Chidamide 顯著下調(diào)MyoD 和MyoG 的表達(dá)，鑒于MyoD 和MyoG 在C2C12 細(xì)胞分化中發(fā)揮正調(diào)控作用，提示Chidamide 可能通過(guò)下調(diào)MyoD 和MyoG的表達(dá)抑制C2C12 細(xì)胞分化。

根據(jù)收縮特性，哺乳動(dòng)物肌纖維分為慢氧化型（MyHC Ⅰ型）、快氧化型（MyHC Ⅱa 型）、中間型（MyHC Ⅱx 型）和快速糖酵解型（MyHC Ⅱb 型）肌纖維。與糖酵解或中間型肌纖維相比，氧化型肌纖維富含線粒體和毛細(xì)血管，抗疲勞能力更強(qiáng)，更依賴(lài)氧化磷酸化產(chǎn)生能量。骨骼肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化與人體肌肉和代謝性疾病有直接關(guān)系。肌肉廢用，如脊髓損傷，導(dǎo)致Ⅰ型纖維萎縮，纖維類(lèi)型從慢到快轉(zhuǎn)變，而癌癥惡病質(zhì)導(dǎo)致Ⅱ型纖維優(yōu)先萎縮，纖維類(lèi)型從快到慢轉(zhuǎn)變[19]。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)Chidamide 處理C2C12 細(xì)胞后對(duì)肌原纖維的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Chidamide 顯著降低Myh7、Myh1 和Myh2 的表達(dá)，但不影響Myh4 的表達(dá)。表明Chidamide 抑制Ⅰ型、Ⅱx 型、Ⅱa 型肌原纖維，不影響Ⅱb 型肌原纖維，提示Chidamide 對(duì)各型肌纖維類(lèi)型有不同的影響。

綜上所述，本研究證明Chidamide 抑制C2C12骨骼肌細(xì)胞分化，且主要抑制Ⅰ型、Ⅱa 型、Ⅱx 型肌原纖維，但不影響Ⅱb 型肌原纖維，其機(jī)制可能與Chidamide 下調(diào)MyoD 和MyoG 的表達(dá)有關(guān)。