基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的兒童免疫性血小板減少癥血漿代謝組學(xué)研究①

徐文鑫,肖慧婷,曾淵君,翁開枝,王爾莉,張春斌

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系,福建 漳州 363000;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院,福建 漳州 363000)

兒童ITP臨床診斷依據(jù)仍然是結(jié)合病史、體格檢查和排除血小板減少癥其他病因的臨床實驗室病理檢查[6]。臨床實驗室輔助診斷指標(biāo)主要有血小板計數(shù)、骨髓巨核細(xì)胞檢查、血小板生存時間及血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)。但這些指標(biāo)在臨床應(yīng)用上都有不足。血小板計數(shù)特異性差;血小板生存時間檢測方法復(fù)雜;骨髓巨核細(xì)胞檢查需患兒承受骨穿痛苦;PAIg與ITP診斷的符合率不高。因此,對于兒童ITP,目前缺乏較好的臨床實驗室生物指標(biāo)。本研究基于液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析技術(shù)(LC-MS)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,揭示ITP患兒血漿樣本中的代謝物變化,希望能尋找到ITP患兒血漿中潛在可作為ITP診斷和鑒別診斷的臨床實驗室生物標(biāo)記物,也為ITP發(fā)病機(jī)制提供進(jìn)一步研究的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2020-01～2021-01從福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院兒科招募了未經(jīng)任何治療的ITP患兒20例和健康兒童19例。ITP患兒平均年齡4.8歲,男10例,女10例;健康兒童平均年齡5.68歲,包括男7例和女12例。兩組在年齡和性別上的分布不存在顯著性差異(P>0.05)。對于ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照中國兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診斷與治療改編指南(2021版)[2]進(jìn)行診斷,診斷標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)至少2次血常規(guī)檢查示血小板計數(shù)減少(<100×109/L),外周血涂片血細(xì)胞形態(tài)無明顯異常;(2)脾臟一般不增大;(3)骨髓檢查示巨核細(xì)胞增多或正常伴成熟障礙;(4)排除其他繼發(fā)性血小板減少癥。

1.2 樣本采集與處理

使用真空采血管(無抗凝劑)采集清晨空腹患兒及健康兒童約5mL靜脈血,避免溶血。血液標(biāo)本2500rpm離心10min,吸取上清液(血漿)至已標(biāo)記的樣品管中,-80℃冰箱保存用于檢測分析前處理。

1.3 儀器與試劑

儀器主要有液相色譜儀(Thermo,UltiMate 3000)、質(zhì)譜儀(Thermo,Q Exactive)、色譜柱(ACQUITY UPLC?HSS T3 1.8μm,2.1×150mm)、真空濃縮儀(eppendorf,5305)、冷凍離心機(jī)(湘儀,H1650-W)、混勻儀(Vortex Mixer,QL-866),試劑包括甲醇和乙腈(色譜純,Thermo)、甲酸(色譜純,TCL)、 2-氯苯丙氨酸(色譜純,Aladdin)、甲酸銨(色譜純,Sigma), 實驗用水為超純水(由Milli-Q 超純水機(jī)制備)。

1.4 樣本制備

從-80℃冰箱取出樣本,在4℃下融解。自每份樣本中吸取100μL放入2mL離心管,再取400μL甲醇加入各支離心管,60s振蕩混勻,離心5min(4℃,12000rpm);離心后將全部上清液移至2mL新離心管,真空濃縮干燥;用2-氯苯丙氨酸(4 ppm)80%甲醇溶液150μL復(fù)溶,上清液經(jīng)0.22μm膜過濾,獲得待檢樣本;每份待檢樣本各取20 μL混合制備成QC樣本,余存待檢樣本用于LC-MS檢測。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件及分析

色譜條件:色譜分離在配備ACQUITY UPLC?HSS T3 (150×2.1mm, 1.8μm, Waters)柱的Thermo Ultimate 3000系統(tǒng)中完成,保持40℃柱溫。流動相采用正離子模式0.1%甲酸水(C)- 0.1%甲酸乙腈(D);負(fù)離子模式 5 mM 甲酸銨水(A)-乙腈(B)。自動進(jìn)樣器溫度設(shè)為8℃,流速設(shè)為0.25mL/min,2μL進(jìn)樣梯度洗脫,洗脫程序:2% B/D,0～1min;2%～50%B/D,1～9 min;50%～98% B/D,9～12min;98% B/D,12～13.5min;98%～2% B/D,13.5～14min;正模式-2% D,14～20min(負(fù)模式-2% B,14～17min)。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)正負(fù)離子電離模式,正離子噴霧電壓3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓2.50 kV;鞘氣30arb,輔助氣10arb;毛細(xì)管溫度設(shè)為325℃,分辨率設(shè)為70 000,m/z 81～1 000范圍內(nèi)全掃描;采用HCD模式以碰撞電壓30eV進(jìn)行二級裂解,并通過動態(tài)排除去除無必要的 MS/MS信息。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Proteowizard軟件將檢測得到原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式,通過R(v3.3.2)XCMS程序分析獲得質(zhì)核比(mass to charge ratio, m/z)、保留時間(retention time,rt)、峰面積(intensity)等信息的數(shù)據(jù)矩陣;并進(jìn)行峰面積的批次歸一化及標(biāo)準(zhǔn)化處理。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類,去除重復(fù)性差的樣本和異常樣本,并得到VIP值。采用秩和檢驗得到P值,根據(jù)P值和VIP值篩選出具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異代謝物。通過人類代謝組數(shù)據(jù)(human metabolome data base HMDB)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定。經(jīng)層次聚類(hierarchical clustering)分析形成熱圖,觀察兩組之間的差異代謝產(chǎn)物分類情況。經(jīng)單變量受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)一步評價并篩選潛在的生物標(biāo)記物。采用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異性代謝物進(jìn)行通路富集分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計分析和繪圖均采用R軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 樣本檢測數(shù)據(jù)分析

使用LC-MS/MS在正負(fù)離子模式下檢測分析血漿樣本,通過Proteowizard軟件將獲取的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式,利用R(v3.3.2)的XCMS程序經(jīng)峰識別、峰過濾、峰對齊及峰面積批次歸一化,獲得正離子模式下5334 個前體分子、9567 個前體分子,導(dǎo)出數(shù)據(jù)至excel進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 主成分分析

通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行自適(UV) 換算處理,對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,分別得到正負(fù)離子模式下PCA得分圖(圖1 A-B),圖中每個點代表一個樣本。其中QC組密集分布,說明方法穩(wěn)定性良好數(shù)據(jù)質(zhì)量良好,得到的數(shù)據(jù)可靠。同時ITP患兒組和健康對照組明顯區(qū)分開,同組樣本聚類,表明ITP患兒和健康兒童樣本之間存在代謝差異。

圖1-A 正離子模式下的得分圖

圖1-B 負(fù)離子模式下的得分圖

2.3 差異代謝物篩選

應(yīng)用秩和檢驗分析ITP患兒組和健康對照組的大量數(shù)據(jù),得到p值。通過OPLS-DA得到正負(fù)離子模式下具有很高模型解釋率的OPLS-DA區(qū)分模型(圖2 A-B),并得到VIP值。為了在兩組間找到差異顯著的代謝物,本研究設(shè)定P<0.05且VIP>1,在ITP患兒組和健康對照組之間,正離子模式下共找到1199個差異代謝物, 在負(fù)離子模式下共找到1453個差異代謝物。

圖2-A 正離子模式OPLS-DA的得分圖

圖2-B 負(fù)離子模式OPLS-DA的得分圖

2.4 重要差異代謝物鑒定及聚類分析

將篩選出的差異性代謝物的MS/MS模式所得碎片信息在HMDB等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行匹配檢索。設(shè)定數(shù)據(jù)庫中的數(shù)值與檢測得到的mz差異小于0.01Da,共鑒定出了90個差異代謝物的結(jié)構(gòu)。對90個差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析,見圖3,從結(jié)果可以看到,90個差異代謝物在ITP患兒組和健康對照組之間存在具有明顯差異。計算90個差異代謝物在ITP患兒組和健康對照組兩組之間的Fold change值,設(shè)定Fold change>6.00或<0.166,從中遴選出20種能很好區(qū)分ITP患兒組和健康對照組的重要差異代謝物,見表1。

圖3 差異代謝物聚類分析樹狀圖 (紅色)ITP患兒組 (藍(lán)色)健康對照組

表1 ITP患兒與健康兒童血樣中的重要差異代謝物鑒定

2.5 關(guān)鍵差異代謝物的發(fā)現(xiàn)

應(yīng)用ROC曲線分析方法,得到20種重要差異代謝物的ROC曲線結(jié)果,見圖4。設(shè)定ROC曲線下面積值(AUC)>0.9,共選出13種潛在的關(guān)鍵差異代謝物,其中鑒定出5個內(nèi)源性代謝物:間甲酚(m-Cresol)、腐胺(Putrescine)、5-羥色胺(Serotonin)、2-氧代精氨酸(2-Oxoarginine)、精氨基琥珀酸(Argininosuccinic acid)。繪制ITP患兒組和健康兒童組樣本中5種內(nèi)源性潛在關(guān)鍵差異代謝物的均值柱形圖,見圖5,發(fā)現(xiàn)5種代謝物在ITP患兒組和健康兒童組差異非常顯著(P<0.001)。其中腐胺、2-氧代精氨酸、 精氨基琥珀酸在ITP患兒組是升高的,而5-羥色胺、間甲酚在ITP患兒組是降低的。結(jié)合上述統(tǒng)計學(xué)分析,最終選定精氨基琥珀酸、腐胺、2-氧代精氨酸、5-羥色胺、間甲酚這5種代謝物為ITP患兒的潛在生物標(biāo)記物。

圖4 20個重要差異代謝物的ROC曲線圖

圖5 5種內(nèi)源性潛在關(guān)鍵差異代謝物在ITP患兒和健康兒童血樣中的均值柱形圖注:藍(lán)色柱代表ITP患兒組,紅色柱代表健康兒童組 (***表示P<0.001)。

經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫對ITP患兒差異性代謝物的代謝通路進(jìn)行分析。結(jié)果表明,ITP患兒差異代謝物富集于10條代謝途徑:精氨酸和蛋氨酸代謝、亞油酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、癌癥中的中樞碳代謝、精氨酸生物合作、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、蛋白質(zhì)消化吸收、泛酸和輔酶A的生物合成等。

3 討論

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種以血小板破壞增加和血小板生成障礙導(dǎo)致的單純血小板減少為特征的獲得性自身免疫性疾病。目前針對ITP尚無明確的診斷方法,仍采用排除性診斷,在排除了血小板減少的其它病因后進(jìn)行診斷[7]。尋找一種可靠的診斷方法將有助于ITP的診斷、鑒別診斷和藥物治療。代謝組學(xué)是通過對生物樣本中代謝組分的定性和定量分析,研究代謝過程,確定具有代謝特征的關(guān)鍵生物標(biāo)志物和揭示代謝機(jī)制的有力工具。如Wei Zhong等[8]應(yīng)用LC-MS技術(shù)尋找急性冠脈綜合征的血漿標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺溶酶16:0與LPC(20:4)聯(lián)合檢測的AUC值達(dá)到0.905,有助于ACS的有效診斷;Fan Yang等[9]通過對多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis MS)的代謝物變化與炎癥因子的相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)MS代謝組的改變可能通過調(diào)節(jié)外周的免疫炎癥反應(yīng)參與了MS的發(fā)病和病程;Liu等[10]用LC-MS技術(shù)方法進(jìn)行梅毒代謝組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)三甲胺N -氧化物、L -精氨酸、溶菌素、甜菜堿和乙酰肉堿5種代謝物具有顯著差異,并通過這些代謝產(chǎn)物的變化提示梅毒螺旋體影響宿主細(xì)胞的正常代謝活動。本研究基于LC-MS技術(shù)對ITP患兒和健康兒童血液樣本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,對檢測的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行濾噪、峰對齊、歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化等預(yù)處理后,采用主成分分析、正交-偏最小二乘判別分析、層次聚類分析等,發(fā)現(xiàn)ITP患兒與健康對照明顯分離。并經(jīng)HMDB, Metlin 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定,獲取90種差異代謝物。然后根據(jù)Fold change值及ROC曲線結(jié)果選取了13種潛在關(guān)鍵差異代謝物,最終確定精氨基琥珀酸、腐胺、2-氧代精氨酸、5-羥色胺、間甲酚等5種內(nèi)源性代謝物作為ITP的潛在生物標(biāo)記物。5種生物標(biāo)記物組成的生物標(biāo)記物組對區(qū)分ITP患兒和健康兒童具有較高的準(zhǔn)確性(ACU>0.9)。

5-羥色胺存在于所有的生物體中,在哺乳類動物中是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),由L-色氨酸合成,主要參與色氨酸代謝。在調(diào)控毛細(xì)血管壁功能方面具有一定作用,也具有強(qiáng)收縮血管和收縮平滑肌的功能[11]。外周血的5-羥色胺大部分貯存在血小板中與,參與血小板止血或血栓形成的功能作用。因此,5-羥色胺含量與血小板的功能密切相關(guān)。5-羥色胺還具有免疫調(diào)節(jié)功能,與ITP 的發(fā)病機(jī)制可能存在共同通路。祁爍等[12]針對 ITP 模型小鼠血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)作用的研究,顯示ITP 模型組的5-羥色胺水平顯著減低,與本研究結(jié)果一致。腐胺是一種最簡單的多胺,由機(jī)體內(nèi)氨基酸脫羧反應(yīng)產(chǎn)生,大劑量即有毒性,被歐洲尿毒癥毒素工作組確定為一種尿毒癥毒素。腐胺已被證明在一些生態(tài)失調(diào)有關(guān)的疾病中起著重要作用。腐胺也存在于外周血血小板中,提示血小板溶解破壞有可能導(dǎo)致腐胺大量釋放到外周血中,引起血中腐胺升高。精氨基琥珀酸是一種堿性氨基酸,在機(jī)體代謝途徑中可作為精氨酸的前體。2-氧代精氨酸是精氨酸分解代謝的胍基化合物代謝物,在機(jī)體內(nèi)大量蓄積可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。本研究中,精氨基琥珀酸、2-氧代精氨酸和精氨酸相對于健康對照都有顯著性升高,提示ITP患兒體內(nèi)精氨酸代謝增強(qiáng),2-氧代精氨酸的生成增多可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在損害。

臨床上的自身免疫性疾病大多數(shù)病因不明,可能與遺傳、免疫、激素和環(huán)境因素有關(guān)。ITP的發(fā)生也可能與藥物和化學(xué)物質(zhì)接觸有關(guān)[13]。目前,研究最廣泛的是由奎寧與血小板膜糖蛋白的特異性殘基相互作用引起的藥物性免疫性血小板減少癥(DIT)[14]。1例病例報告[15]顯示,1例患者被診斷為異煙肼誘導(dǎo)的免疫性血小板減少癥,異煙肼停藥后血小板計數(shù)恢復(fù)正常。本研究中,也篩選出一些具有差異性的外源性代謝物,如魯比前列酮、異惡苯、L-組氨醇等。

本研究存在一些局限性。首先,研究對象數(shù)量相對較少。只有通過研究更多種族人群的更大規(guī)模試驗,才能更好檢驗分析內(nèi)源性或外源性代謝物與ITP之間的關(guān)聯(lián)。其次,研究缺乏更多的臨床相關(guān)指標(biāo),如治療后相關(guān)患者數(shù)據(jù)信息。Zhang等[1]基于GC-MS對98例ITP患者和30例健康對照進(jìn)行檢測分析,識別出6個差異代謝物和5個富集通路,預(yù)測出慢性ITP患者對糖皮質(zhì)激素耐藥,揭示了ITP患者的代謝紊亂。LC-MS方法可能可以鑒定出更多的差異代謝物,從而更有可能鑒定出具有診斷和預(yù)后價值的代謝物,但需要更大的樣本量來獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果,而本研究僅納入20例ITP患者,數(shù)量偏少。

綜上所述,本研究基于LC-MS的代謝組學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)ITP患兒與健康兒童存在較多的差異性代謝物,并篩選出5種內(nèi)源性潛在關(guān)鍵差異代謝物,可能可以作為鑒別ITP患兒和健康兒童的臨床實驗室生物標(biāo)記物。這些結(jié)果也有助于深入理解ITP的病理生理過程,并為ITP提供新的診斷和治療策略。