二甲雙胍對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠妊娠結(jié)局、內(nèi)分泌及VEGF/MAPK信號(hào)通路的影響

周知，黎業(yè)娟，陳琳，王安國(guó)，阮海玲，馬寧，周璟，盧偉英

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent sponiaeous abortion，RSA）是育齡期女性的常見(jiàn)疾?。?］。正常妊娠女性自然流產(chǎn)發(fā)生率約10%，而RSA占5%左右［2］。RSA發(fā)病率較高且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是臨床治療的難點(diǎn)。其與母體內(nèi)分泌失調(diào)、胎盤血管網(wǎng)絡(luò)異常、生殖道異常、免疫功能異常、染色體異常等有關(guān)，RSA患者連續(xù)流產(chǎn)后再次妊娠時(shí)發(fā)生胚胎停止發(fā)育及死胎的概率會(huì)大大增加［3］。卵巢功能正常、母胎界面血管生成正常、子宮內(nèi)膜完整性、母體正常的孕激素水平及相關(guān)激素受體的正常表達(dá)在受精卵的著床、妊娠的維持過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均有可能導(dǎo)致流產(chǎn)［4］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可調(diào)節(jié)血管生成，與母胎界面血管的生成關(guān)系密切，VEGF 的正常表達(dá)對(duì)于維持孕期母體子宮及胎盤系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要意義。VEGF 與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）結(jié)合后可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），進(jìn)而增加新生血管的生成，因此VEGF可能參與RSA過(guò)程［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，在孕早期使用二甲雙胍（metformin，Met）可增強(qiáng)血管內(nèi)皮功能、降低流產(chǎn)率、改善卵巢能量代謝等［7］，但關(guān)于其對(duì)RSA 的治療效果尚不清晰。本研究通過(guò)建立大鼠RSA 模型，觀察Met 對(duì)RSA 大鼠的輔助治療作用，以期為臨床治療RSA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性SD 大鼠100 只、雄性SD 大鼠50只，4 月齡左右，體質(zhì)量（230±30）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：省科委2000A027。所購(gòu)大鼠飼養(yǎng)于海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物房中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于后續(xù)研究。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 主要試劑 Met購(gòu)自廣州阿達(dá)拉生物科技有限公司；黃體酮購(gòu)自浙江仙琚制藥有限公司；羥基脲、米非司酮購(gòu)自德國(guó)默克公司；卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成激素（leuteinizing hormone，LH）、垂體泌乳素（prolactin，PRL）、雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）放射免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所；VEGF、VEGFR-2兔抗鼠單抗購(gòu)自Absin公司；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）兔抗鼠單抗、GAPDH 兔抗鼠單抗、羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；HE 染色試劑盒購(gòu)自上海生工公司。

1.3 研究方法

1.3.1 RSA 動(dòng)物模型制備 RSA 大鼠模型通過(guò)改進(jìn)參考文獻(xiàn)［8］方法進(jìn)行制備：選取雌性大鼠100只、雄性大鼠50只合籠交配，于次日早晨在雌性大鼠的陰道涂片中觀察到較多精子數(shù)量及陰栓者記為受孕第1 天。選取其中受孕成功的60只雌性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（10 只）及造模組（50 只）。造模組均持續(xù)灌胃羥基脲（450 mg/kg）10 d，第11 天灌胃米非司酮（3.75 mg/kg），羥基脲加米非司酮可成功模擬臨床流產(chǎn)的狀態(tài)。模型大鼠出現(xiàn)陰道流血、活動(dòng)緩慢、精神萎靡、食欲下降等現(xiàn)象，解剖后大鼠子宮有竹節(jié)樣改變、子宮顏色暗紅、著床點(diǎn)有淤血出現(xiàn)等現(xiàn)象時(shí)即為模型構(gòu)建成功，所有大鼠均造模成功。對(duì)照組灌胃等量生理鹽水，灌胃時(shí)間為每天上午7:00—8:00。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥 將造模成功的50只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為RSA組、黃體酮組（156 mg/kg）和Met低、中、高劑量組（250、1 000、2 000 mg/kg），每組10只，Met的給藥劑量依據(jù)參考文獻(xiàn)［9］和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。受孕第1天開(kāi)始灌胃給藥，對(duì)照組及RSA 組灌胃等量蒸餾水，灌胃時(shí)間為每天上午8:00—9:00，持續(xù)15 d。

1.3.3 大鼠胚胎丟失率觀察 末次給藥結(jié)束后24 h，即大鼠受孕第16天，將各組大鼠麻醉后處死，解剖大鼠子宮觀察胚胎丟失情況。胚胎丟失率=［流產(chǎn)胚胎數(shù)/（存活胚胎數(shù)+流產(chǎn)胚胎數(shù)）］×100%［8］。

1.3.4 大鼠血清激素水平檢測(cè) 末次給藥結(jié)束后24 h，在處死大鼠前取各組大鼠腹主動(dòng)脈血3 mL，3 500 r/min離心5 min后分離血清，-20 ℃?zhèn)溆茫凑照f(shuō)明書(shū)，放射免疫法檢測(cè)各組大鼠血清中FSH、LH、PRL、E2、P水平。

1.3.5 大鼠蛻膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察 各組麻醉處死后分離大鼠子宮，用組織鉗鈍性分離子宮壁，將胚盤與胚胎剝離著床位置，無(wú)菌環(huán)境下分離大鼠子宮蛻膜組織，使用4%多聚甲醛溶液固定后，按照HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，檢測(cè)子宮蛻膜組織病理變化。

1.3.6 Western blot 法檢測(cè)子宮蛻膜組織VEGF/MAPK 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平 提取大鼠子宮蛻膜組織中的總蛋白，并測(cè)定其濃度，電泳后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上，封閉2 h后，添加VEGF、VEGFR-2、ERK、p-ERK及GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃過(guò)夜后TBST洗滌，加二抗（1∶5 000），孵育曝光顯色。采用蛋白成像凝膠儀分析VEGF、VEGFR-2、ERK、p-ERK 蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胚胎丟失率比較 對(duì)照組大鼠胚胎呈淡紅色串珠狀，存活胚胎數(shù)大于死亡胚胎數(shù)，且死亡胚胎數(shù)極少；RSA組大鼠胚胎多為褐色，胚胎部分或全部消失，子宮內(nèi)出現(xiàn)血痕，死亡胚胎數(shù)明顯增加，存活胚胎數(shù)減少，兩者數(shù)量相當(dāng)；Met各劑量組和黃體酮組與RSA 組相比，褐色胚胎減少，子宮的血痕減輕，死亡胚胎數(shù)隨著Met劑量的增加而減少，存活胚胎數(shù)隨著Met劑量的增加而增多，黃體酮組與Met高劑量組的死亡胚胎數(shù)、存活胚胎數(shù)基本一致，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，RSA組大鼠胚胎丟失率升高（P＜0.05）；與RSA組比較，黃體酮組胚胎丟失率下降，Met低、中及高劑量組胚胎丟失率依次下降（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Fig.1 Embryo morphology of rats in each group圖1 各組大鼠胚胎形態(tài)圖

Tab.1 Comparison of embryo loss rate of rats between the six groups表1 各組大鼠胚胎丟失率比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of embryo loss rate of rats between the six groups表1 各組大鼠胚胎丟失率比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組組比較，b與RSA組比較，c與Met低劑量組比較，d與Met中劑量組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F存活胚胎數(shù)（只）56 25 31 42 49 50死亡胚胎數(shù)（只）5 30 26 19 7 10胚胎丟失率（%）8.19±1.70 54.54±8.29a 45.61±7.44b 31.14±7.30bc 12.50±2.52bcd 16.66±3.36bcd 108.271＊＊

2.2 各組血清激素水平比較 結(jié)果見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，RSA 組大鼠血清FSH、LH、PRL、E2及P 表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與RSA組比較，Met各劑量組和黃體酮組大鼠血清FSH、LH、PRL、E2及P 表達(dá)量均升高（P＜0.05），Met 高劑量對(duì)FSH、LH、PRL、E2及P表達(dá)量的作用效果更好，但Met 高劑量組和黃體酮組各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組子宮蛻膜組織形態(tài)學(xué)比較 與對(duì)照組比較，RSA組大鼠子宮蛻膜組織上皮不完整、細(xì)胞排列不規(guī)則且出現(xiàn)萎縮變性、淤血情況明顯；與RSA組比較，Met 各劑量組大鼠的子宮蛻膜組織形態(tài)呈現(xiàn)不同程度的緩解，Met 高劑量組與黃體酮組的子宮蛻膜組織形態(tài)相似，見(jiàn)圖2。

Tab.2 Comparison of serum hormone levels of rats between the six groups表2 各組大鼠血清中激素水平比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of serum hormone levels of rats between the six groups表2 各組大鼠血清中激素水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組組比較，b與RSA組比較，c與Met低劑量組比較，d與Met中劑量組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F PRL（mIU/L）102.61±5.40 70.06±2.08a 78.19±3.01b 86.37±3.71bc 96.37±4.26bcd 95.13±4.31bcd 97.383＊＊E2（ng/L）24.20±0.20 17.11±0.45a 18.71±0.12b 19.94±0.42bc 22.46±0.81bcd 21.97±0.87bcd 223.454＊＊P（μg/L）2.40±0.21 1.14±0.10a 1.57±0.14b 1.90±0.17bc 2.28±0.20bcd 2.19±0.19bcd 78.160＊＊組別對(duì)照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F FSH（IU/L）7.01±0.27 5.07±0.11a 5.71±0.13b 6.20±0.17bc 6.84±0.25bcd 6.72±0.24bcd 135.481＊＊LH（IU/L）6.03±0.75 3.09±0.39a 3.92±0.49b 4.86±0.60bc 5.83±0.72bcd 5.61±0.70bcd 35.556＊＊

Fig.2 Morphological changes of rat decidua tissue observed by HE staining(×400)圖2 HE染色觀察各組大鼠子宮蛻膜組織形態(tài)學(xué)變化（×400）

2.4 各組子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，RSA 組大鼠子宮蛻膜組織中VEGFR-2、VEGF、p-ERK 蛋白表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與RSA組比較，Met各劑量組和黃體酮組大鼠子宮蛻膜組織中VEGFR-2、VEGF、p-ERK蛋白表達(dá)量均升高（P＜0.05），Met 高劑量對(duì)VEGFR-2、VEGF、p-ERK 蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用更好，但Met 高劑量組和黃體酮組各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3、表3。

Fig.3 The expression of VEGF/MAPK pathway related proteins in uterine decidua tissue of rats in each group圖3 各組大鼠子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Tab.3 Comparison of the expression of VEGF/MAPK pathway related proteins in uterine decidua of rats between the six groups表3 各組大鼠子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of the expression of VEGF/MAPK pathway related proteins in uterine decidua of rats between the six groups表3 各組大鼠子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與RSA 組比較，c與Met 低劑量組比較，d與Met中劑量組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F VEGFR-2/GAPDH 1.16±0.23 0.21±0.08a 0.43±0.11b 0.71±0.14bc 0.94±0.18bcd 0.91±0.17bcd 49.019＊＊VEGF/GAPDH 1.14±0.22 0.15±0.08a 0.45±0.10b 0.74±0.15bc 0.96±0.19bcd 0.93±0.16bcd 54.434＊＊p-ERK/ERK 1.18±0.04 0.40±0.02a 0.58±0.04b 0.71±0.07bc 1.05±0.09bcd 0.97±0.13bcd 161.534＊＊

3 討論

RSA 是育齡女性常見(jiàn)病，隨著生育人群數(shù)量增多，復(fù)發(fā)流產(chǎn)、自然流產(chǎn)率呈升高趨勢(shì)［10］。建立穩(wěn)定的RSA大鼠模型對(duì)于探究流產(chǎn)的機(jī)制及相應(yīng)治療方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。陳陽(yáng)等［11］用羥基脲和米非司酮建立流產(chǎn)動(dòng)物模型，其中RSA 組大鼠流產(chǎn)率升高，血清中P 含量下降，大鼠卵巢功能受損，模型構(gòu)建較為穩(wěn)定。本結(jié)果亦顯示，RSA 組大鼠出現(xiàn)陰道流血、活動(dòng)緩慢、精神萎靡、食欲下降等現(xiàn)象，胚胎丟失率較對(duì)照組升高，提示大鼠RSA 模型構(gòu)建成功。研究顯示，Met可被小腸上皮細(xì)胞吸收，通過(guò)小腸上皮細(xì)胞膜表面的單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體及陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液、肝臟、胎盤等，可增加多囊卵巢綜合征患者的妊娠率，降低流產(chǎn)率等［12-13］，故推測(cè)其對(duì)RSA可能具有一定的治療價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，與RSA組比較，Met各劑量組大鼠胚胎丟失率降低，高劑量組與陽(yáng)性藥物黃體酮效果相當(dāng)，表明Met 尤其是高劑量具有降低RSA 大鼠胚胎丟失的作用，提示Met可改善RSA 臨床癥狀，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚不明確。

女性生殖功能的內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)，女性正常的激素水平對(duì)于維持妊娠具有重要意義［14］。FSH 是由垂體分泌的一種糖蛋白，具有促進(jìn)卵巢生長(zhǎng)及卵泡顆粒層細(xì)胞增殖分化的作用；LH 是一種促性腺激素，促進(jìn)機(jī)體排卵及生成黃體；PRL水平過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響卵泡的成熟；E2是由卵巢分泌的一種性激素，血清E2的水平能反映胎兒的生長(zhǎng)狀況及胎盤的狀態(tài)，低水平的E2不利于胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育，可能預(yù)示著不良妊娠結(jié)局；P 是由卵巢黃體分泌的一種孕激素，對(duì)于維持妊娠具有重要作用［15-16］。本研究結(jié)果顯示，與RSA 組比較，Met 各劑量組大鼠血清FSH、LH、PRL、E2及P 表達(dá)量均升高，高劑量Met與黃體酮調(diào)節(jié)RS大鼠內(nèi)分泌作用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Met 尤其高劑量組具有調(diào)節(jié)RSA 大鼠內(nèi)分泌的作用，考慮Met 緩解RSA大鼠胚胎丟失情況可能與改善大鼠內(nèi)分泌功能有關(guān)。

妊娠過(guò)程中豐富的營(yíng)養(yǎng)及血液供應(yīng)是維持胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵因素，子宮蛻膜組織健康的血管網(wǎng)絡(luò)及血液循環(huán)發(fā)揮著重要作用。VEGF 具有改善血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、誘導(dǎo)血管形成等作用，通過(guò)與其受體VEGFR-2 結(jié)合發(fā)揮作用，對(duì)母胎界面的血管網(wǎng)絡(luò)及血管生成起到積極作用，低表達(dá)的VEGF 可導(dǎo)致絨毛血管網(wǎng)絡(luò)生成不足、血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂異常等，進(jìn)而引發(fā)流產(chǎn)［17］。ERK 是MAPK的家族成員，是MAPK主要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，VEGF 與其受體VEGFR-2 結(jié)合后可促進(jìn)ERK 的激活，ERK激活后可將信息轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞的分化及胚胎的發(fā)育具有一定的調(diào)控作用，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對(duì)母胎界面的血管生成具有促進(jìn)作用［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎丟失率高、蛻膜組織血管新生均與VEGF/MAPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)異常有關(guān)［20-21］。本研究結(jié)果顯示，與RSA 組比較，Met 各劑量組大鼠子宮蛻膜組織血管損傷得到一定的緩解，子宮蛻膜組織中VEGFR-2、VEGF、p-ERK 蛋白表達(dá)量均升高，且高劑量Met 的效果更佳，表明Met對(duì)RSA大鼠的子宮蛻膜組織血管具有一定的保護(hù)作用，可提高VEGF/MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述，Met 具有降低RSA 大鼠的胚胎丟失率、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用，可能與Met 具有促進(jìn)VEGF/MAPK 通路激活作用有關(guān)。然而，本研究只是初步探究Met 對(duì)RSA 大鼠內(nèi)分泌及VEGF/MAPK 通路的影響，未進(jìn)行相關(guān)通路抑制劑及激活劑的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，后續(xù)仍需深入研究。