骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療激素性股骨頭壞死的研究進(jìn)展

錢(qián)士達(dá)，于雪峰

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是臨床中使用大劑量類(lèi)固醇激素治療腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病時(shí)常見(jiàn)的并發(fā)癥［1］，是一種退行性骨病，可導(dǎo)致股骨頭塌陷，進(jìn)而損傷髖關(guān)節(jié)，且此過(guò)程難以逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。研究普遍認(rèn)為，骨結(jié)構(gòu)的損傷和宏觀力學(xué)性能的改變是導(dǎo)致股骨頭坍塌的原因，而這源于骨修復(fù)過(guò)程中成骨活動(dòng)和破骨活動(dòng)的不平衡［3］。針對(duì)SONFH 的治療方法，無(wú)論是以全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)（total hip arthroplasty，THA）為代表的關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，還是以髓芯減壓（core decompression，CD）為代表的保髖治療，均不能有效增強(qiáng)骨修復(fù)及防止生物力學(xué)坍塌［4］。若可維持成骨活動(dòng)和破骨活動(dòng)之間的平衡，延遲股骨頭壞死和塌陷，即可修復(fù)SONFH。目前干細(xì)胞移植結(jié)合組織工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。有研究顯示，合理應(yīng)用干細(xì)胞移植技術(shù)可減緩SONFH 進(jìn)展，提高Harris 髖關(guān)節(jié)評(píng)分，甚至逆轉(zhuǎn) 疾 病 分 期［5-6］。 骨 髓 間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化潛能的多功能干細(xì)胞，為成骨細(xì)胞的最主要來(lái)源，在骨組織的修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用［7］。本文主要從BMSCs的性質(zhì)、SONFH的臨床診療進(jìn)展及BMSCs 治療SONFH 的實(shí)驗(yàn)研究3 個(gè)方面對(duì)BMSCs治療SONFH的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BMSCs及其分子機(jī)制

BMSCs 首次在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，是一種梭形、貼壁的非造血干細(xì)胞，占骨髓內(nèi)有核細(xì)胞的0.001%~0.010%［8］。BMSCs具有獲取方便、免疫原性較低等優(yōu)點(diǎn)［9］。BMSCs具有多向分化潛能，可分化成各種中胚層譜系，包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和造血支持基質(zhì)等［10］。在宏觀層面上，BMSCs的分化方向受到運(yùn)動(dòng)［11］、年齡［12］和類(lèi)固醇激素使用［13］等多種因素的影響，且隨著年齡增加或類(lèi)固醇激素長(zhǎng)期應(yīng)用，BMSCs傾向于成脂分化而非成骨分化。在微觀層面上，BMSCs的分化方向亦受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Wnt、Notch 等多種信號(hào)通路及相關(guān)生物因子的影響［8，14］。

（1）TGF-β/BMP 通路。TGF-β可抑制包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞在內(nèi)的多種類(lèi)型細(xì)胞的增殖。BMP是TGF-β配體家族最大的分支，在調(diào)節(jié)BMSCs的成脂和成骨分化中具有雙重作用［15］。BMP2 單獨(dú)使用可以促進(jìn)BMSCs 的增殖和成骨分化，與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）聯(lián)用時(shí)，則可促進(jìn)BMSCs的成脂分化［16］。（2）Wnt通路。Wnt蛋白是一個(gè)富含半胱氨酸的分泌型脂糖蛋白家族，包括至少19種不同的分泌蛋白，在多種病理生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。從根本上來(lái)說(shuō)，Wnt是生長(zhǎng)刺激因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，即可促進(jìn)BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化［17］。（3）Notch 通路。在人體發(fā)育過(guò)程中，Notch 通路介導(dǎo)大多數(shù)生物體內(nèi)保守的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，尤其是在內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)血管生成。也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch 通路可以降低BMSCs 的增殖活性，促進(jìn)其成骨分化［14，18］。Smad 蛋白和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cellderived factor 1 alpha，SDF-1α）等細(xì)胞因子也可通過(guò)上述信號(hào)通路參與BMSCs的分化調(diào)節(jié)［8，19］。

BMSCs的增殖能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，但是其成骨能力在傳代過(guò)程中相對(duì)保守，且可以通過(guò)低溫維持其增殖能力［20］。BMSCs 不僅能通過(guò)自身增殖分化直接替代骨組織，還能夠通過(guò)旁分泌促進(jìn)組織的修復(fù)。Lu 等［7］選用C57BL/6J 小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，治療組使用負(fù)載miR-29a 的BMSCs外泌體，對(duì)照組則使用無(wú)負(fù)載miR-29a的BMSCs外泌體，均通過(guò)尾靜脈注射；2個(gè)月后，收集股骨，通過(guò)免疫染色和Micro-CT 分析骨生成，結(jié)果顯示，治療組小鼠股骨表面骨鈣蛋白陽(yáng)性的成骨細(xì)胞數(shù)量及骨小梁厚度均高于對(duì)照組。

2 SONFH的臨床診療進(jìn)展

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）可分為國(guó)際骨循環(huán)研究協(xié)會(huì)（Association Research Circulation Osseous，ARCO）Ⅰ—Ⅳ期，其中Ⅰ期和Ⅱ期ONFH 還未出現(xiàn)軟骨下骨折或股骨頭塌陷，可以采用保守治療；Ⅲ期和Ⅳ期時(shí)已出現(xiàn)股骨頭塌陷和關(guān)節(jié)破壞。一旦出現(xiàn)股骨頭塌陷，THA 是目前唯一可以恢復(fù)關(guān)節(jié)功能的治療方式［21］。但是置換的關(guān)節(jié)存在時(shí)間限制，不能作為年輕患者的最佳選擇［22］；且感染、脫位、再次手術(shù)等相關(guān)并發(fā)癥均會(huì)影響THA 的治療效果；ONFH 亦是THA 手術(shù)失敗的危險(xiǎn)因素［23］。截骨術(shù)（Osteotomy，OT）和CD 是治療早期ONFH 常用的方法，其中OT 主要有經(jīng)轉(zhuǎn)子內(nèi)翻截骨術(shù)（Transtrochanteric curved varus osteotomy，TCVO）和經(jīng)轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)截骨術(shù)（transtrochanteric rotational osteotomy，TRO）兩種術(shù)式，目的是將壞死區(qū)域從股骨頭的負(fù)重面移開(kāi)；但在以往的報(bào)告中兩種術(shù)式的成功率為17%~100%，參差不齊，僅在亞洲少數(shù)國(guó)家使用［24］；而CD 則是通過(guò)去除壞死部分以降低骨內(nèi)壓，同時(shí)改善靜脈回流和血液循環(huán)，從而加強(qiáng)骨組織再生，減輕髖關(guān)節(jié)疼痛［6］。在CD后會(huì)形成空腔，自體骨、骨髓濃縮物、成骨細(xì)胞、BMSCs 等多種生物活性物質(zhì)可應(yīng)用于CD 后的空腔植入，并取得了一定的效 果［6，25-26］。在CD 空 腔 中 植 入 干 細(xì) 胞 也 是 干 細(xì) 胞 治 療SONFH最主要的途徑。

在CD 空腔中植入干細(xì)胞治療SONFH 的方法在1993 年由Hernigou 和Beaujean 首次提出，但并未大范圍應(yīng)用于臨床，多數(shù)患者仍選擇手術(shù)治療［27］。近年來(lái)，隨著研究的深入，BMSCs 不僅應(yīng)用于臨床治療SONFH，更成為克羅恩病、乳腺癌等疾病的治療方案［28-29］。BMSCs 的獲取主要有以下幾個(gè)步驟：（1）術(shù)前數(shù)天使用粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，GCSF）誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞，而后從脛骨或股骨中抽吸骨髓液，離心獲得細(xì)胞懸液。（2）在添加胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's modi fi ed Eagle's medium，DMEM）中混合培養(yǎng)3 h，隨后除去非貼壁細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)基。（3）當(dāng)原代BMSCs 達(dá)到90%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化2 min，培養(yǎng)3周后獲得純化的紡錘形BMSCs［30-31］。獲得的BMSCs 可直接以細(xì)胞懸液的狀態(tài)注射進(jìn)骨髓腔，或是將浸潤(rùn)BMSCs的異體骨植入［25，32］。

3 BMSCs治療SONFH的研究現(xiàn)狀

近年來(lái)，有研究報(bào)告單純CD 與CD 聯(lián)合BMSCs 治療SONFH 的臨床結(jié)局無(wú)明顯差異，在SONFH 患者中植入BMSCs 的治療效果仍存在爭(zhēng)議［33-34］。Kang 等［25］采用配對(duì)設(shè)計(jì)的病例對(duì)照研究比較了100 例股骨頭壞死患者使用自體BMSCs 移植聯(lián)合髓芯減壓（50例）與單純髓芯減壓（50例）的療效，患者術(shù)后均進(jìn)行1 年的隨訪，期間使用MRI 評(píng)價(jià)其分期，結(jié)果顯示，在股骨頭壞死早期進(jìn)行自體BMSCs 移植并不能減緩其ARCO 分期的進(jìn)展，這可能與SONFH 患者自體的BMSCs 成骨活性較低有關(guān)；若要提高BMSCs 治療SONFH 的效果，就需要保證BMSCs 在壞死區(qū)的存活和穩(wěn)定成骨分化。Zhang 等［35］使用成年新西蘭白兔建立SONFH 模型，從4~6周齡幼年新西蘭白兔股骨中分離BMSCs 傳代培養(yǎng)。在建模8周后，通過(guò)組織工程化骨移植術(shù)在股骨頭植入去抗原松質(zhì)骨及BMSCs，對(duì)照組僅植入去抗原松質(zhì)骨。術(shù)后12周發(fā)現(xiàn)2組股骨頭缺損修復(fù)效果無(wú)明顯差異。因此，單純BMSCs移植聯(lián)合CD技術(shù)治療SONFH的效果并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。

因單純應(yīng)用干細(xì)胞移植的治療效果不佳，許多學(xué)者嘗試在干細(xì)胞移植前對(duì)其進(jìn)行修飾。Kong 等［19］將miR-137-3p沉默的BMSCs 移植至大鼠SONFH 模型中，發(fā)現(xiàn)其可以抑制SONFH 進(jìn)展；此外，miR-137-3p 沉 默的BMSCs 通過(guò)增加SDF-1α的分泌，可增強(qiáng)SONFH 模型大鼠的血管形成和再生能力，而天然的BMSCs 并不具備這種能力。Yang 等［36］則用攜帶SDF-1α 的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs 以過(guò)表達(dá)SDF-1α，經(jīng)過(guò)處理的BMSCs 的成骨能力顯著增強(qiáng)，后將其注射至SONFH 模型大鼠脛骨內(nèi)，對(duì)照組注射未轉(zhuǎn)染慢病毒的BMSCs，3周后，micro-CT顯示治療組股骨頭壞死區(qū)面積明顯小于對(duì)照組。Zhang 等［37］在SONFH 大鼠飼料中添加氯化鋰（Wnt通路的天然激活劑），對(duì)照組喂食普通飼料，3周后氯化鋰組大鼠BMSCs的增殖和成骨能力均優(yōu)于對(duì)照組。以上研究表明，對(duì)BMSCs進(jìn)行移植前修飾，可以提高BMSCs在股骨頭壞死區(qū)的存活率及其成骨能力，從而提升其對(duì)SONFH的療效。

4 小結(jié)與展望

基于BMSCs的多向分化潛能，研究者們創(chuàng)建了大量的動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行臨床應(yīng)用。但諸多結(jié)果表明自體BMSCs移植治療SONFH效果并不顯著。通過(guò)移植前修飾可以增強(qiáng)BMSCs的增殖活性及成骨能力，從而在股骨頭壞死區(qū)發(fā)揮治療作用。但仍需對(duì)比研究不同的移植前修飾治療SONFH的效果及安全性，評(píng)估篩選出療效較優(yōu)的修飾靶點(diǎn)及劑量，以期能應(yīng)用于SONFH的臨床治療。