羅氟司特對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的作用及其機(jī)制研究

石昆林，李晨希，宗建春

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是40歲以下人群致死、致殘的常見(jiàn)原因。截至2017 年底，我國(guó)TBI 患者的絕對(duì)人數(shù)已超過(guò)了世界上大多數(shù)國(guó)家，造成了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)［1］。有研究表明，創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)在TBI 的病理過(guò)程中有著重要的作用［2］。羅氟司特（Roflumilast，RF）是一種選擇性磷酸二酯酶4 抑制劑，可提高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平。Keskin 等［3］在腦缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，RF具有抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦細(xì)胞損傷的作用，且可能與NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）有關(guān)，但其能否減輕TBI仍未可知。本研究建立TBI 大鼠模型后，腹腔注射RF 溶液，通過(guò)觀察TBI 后傷側(cè)大腦皮層內(nèi)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、NLRP3、神經(jīng)元病理特點(diǎn)和大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的變化，探究RF 對(duì)大鼠TBI的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性Sprague-Dawley 大鼠36只，8周齡，體質(zhì)量220~250 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2022-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)大鼠的模型操作及取材過(guò)程取得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.1.2 主要試劑與儀器 RF粉劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）高清恒染試劑盒、兔源抗NLRP3 一抗、山羊抗兔二抗（IgG）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；顯微鏡購(gòu)自日本NIKON公司。

1.2 方法

1.2.1 TBI模型的建立及分組 36只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：假手術(shù)（Sham）組、TBI 組、TBI+RF 組，每組12 只。Sham 組大鼠無(wú)撞擊過(guò)程，其余過(guò)程與其他2 組相同。TBI+RF組和TBI組大鼠均采用改良Feeney自由落體法［4］建立TBI模型。具體步驟：（1）用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射將大鼠麻醉，并固定于立體定位架，去除耳后與雙眼之間的毛發(fā)，保證術(shù)區(qū)視野清潔。（2）做頂部正中線右側(cè)切口，逐層分離組織，充分暴露顱骨，在矢狀縫右側(cè)和冠狀縫后方約3 mm 處鉆直徑約5 mm骨窗，確保硬腦膜完整。（3）將骨窗與自由落體打擊裝置連接妥當(dāng)，10 g 重錘從20 cm 高處沿管道自由下落沖擊撞桿，造成大腦頂葉挫裂傷。（4）止血、消毒后縫合頭皮。

1.2.2 干預(yù)方法及樣本采集 TBI+RF 組大鼠建模后即刻、1 d、2 d 腹腔注射RF（1 mg/kg）溶液，TBI 組和Sham 組注射等量溶劑（5%DMSO 和95%生理鹽水溶液）。建模后3 d 時(shí)，按隨機(jī)數(shù)字表法抽取各組大鼠：4 只大鼠用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，取出全腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片，用于HE染色和NLRP3免疫組化染色；4只大鼠處死后，立即取出全腦，置于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于ELISA檢測(cè)。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 在建模后1、2、3、7 和14 d時(shí)，采用改良神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）量表評(píng)估大鼠神經(jīng)功能［5］。該量表包括運(yùn)動(dòng)（肌肉狀態(tài)和異常運(yùn)動(dòng)）、感覺(jué)（視覺(jué)、觸覺(jué)和本體感受）、反射反應(yīng)和平衡測(cè)試。若小鼠無(wú)法進(jìn)行測(cè)試或缺乏預(yù)期的反應(yīng)，則獲得1分。1~6分為輕度功能缺損，7~12分為中度功能缺損，13~18分為重度功能缺損。

1.2.4 HE染色觀察病灶周?chē)哟笫笊窠?jīng)元病理變化 取1.2.2 制作的石蠟切片，烤片、脫蠟、水化后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)HE 染色，中性樹(shù)脂封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。每只大鼠選擇3張切片，每張切片在病灶周?chē)x取5個(gè)不同視野，由對(duì)實(shí)驗(yàn)分組不知情的研究人員使用Image J 分析死亡神經(jīng)元數(shù)量，結(jié)果以死亡神經(jīng)元的百分比表示［6］。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量 處死大鼠后立即取出腦組織，在冰面上分離傷側(cè)頂葉皮層組織，制成組織勻漿，離心（5 000 r/min，10 min，4 ℃）后取上清液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6 NLRP3 免疫組化染色分析 取1.2.2 制作的石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，PBS洗滌3次，每次5 min；用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 洗滌3 次，每次5 min。滴加3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加3%牛血清白蛋白室溫孵育30 min，進(jìn)行血清封閉。切片滴加NLRP3 一抗（稀釋度1∶200）置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS 洗滌3 次，每次5 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度1∶200）室溫下孵育50 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，PBS 洗滌3 次，每次5 min，用蘇木素復(fù)染約3 min 后封片，置于顯微鏡下觀察、拍照。每只大鼠選擇3張切片，每張切片在病灶周?chē)x取5個(gè)不同視野，由對(duì)實(shí)驗(yàn)分組不知情的研究人員使用Image J 軟件分析NLRP3 含量，結(jié)果以平均光密度（AOD）值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mNSS比較 各組大鼠在建模后1、2、3、7、14 d 的mNSS 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Sham 組比較，TBI 組與TBI+RF 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)mNSS 均升高（均P＜0.05）；建模后1、2、3 d內(nèi)，TBI 組與TBI+RF 組大鼠mNSS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，建模后7、14 d時(shí)，TBI+RF組大鼠mNSS較TBI組降低（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of mNSS at different time points after modeling between the three groups表1 各組大鼠建模后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS比較（n=4，分，±s）

Tab.1 Comparison of mNSS at different time points after modeling between the three groups表1 各組大鼠建模后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS比較（n=4，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05。

組別Sham組TBI組TBI+RF組F建模后時(shí)間（d）1 1.50±0.58 13.75±0.96a 14.00±0.82a 319.696＊＊2 1.00±0.82 13.50±1.00a 13.75±0.50a 332.739＊＊3 1.25±0.50 12.75±1.50a 12.50±0.58a 182.735＊＊7 1.00±0.82 11.50±0.58a 10.00±0.82ab 232.200＊＊14 1.00±0.82 9.25±0.96a 7.25±0.96ab 88.900＊＊

2.2 各組大鼠損傷側(cè)皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較 ELISA結(jié)果顯示，與Sham組比較，TBI組和TBI+RF組大鼠損傷側(cè)皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高（P＜0.05）；與TBI 組比較，TBI+RF 組大鼠損傷側(cè)皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the injured cortex of rats between the three groups表2 各組大鼠損傷側(cè)皮層IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（n=4，ng/g，±s）

Tab.2 Comparison of contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the injured cortex of rats between the three groups表2 各組大鼠損傷側(cè)皮層IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（n=4，ng/g，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05。

組別Sham組TBI組TBI+RF組F IL-1β 0.138±0.006 0.174±0.013a 0.158±0.004ab 19.081＊＊IL-6 0.329±0.031 0.506±0.037a 0.443±0.024ab 33.698＊＊TNF-α 1.008±0.031 1.444±0.127a 1.286±0.044ab 30.813＊＊

2.3 各組大鼠病灶周?chē)由窠?jīng)元病理變化及死亡神經(jīng)元數(shù)量比較 Sham組神經(jīng)元排列規(guī)則，大多形態(tài)正常，細(xì)胞核大而圓，呈空泡狀，核仁明顯，周?chē)X組織細(xì)胞間質(zhì)無(wú)明顯水腫。TBI 組和TBI+RF 組病灶周?chē)X組織結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯，見(jiàn)較多死亡神經(jīng)元，胞體縮小、變形，細(xì)胞核固縮、裂解，胞漿呈淡紅色，見(jiàn)圖1。與Sham組比較，TBI組大鼠病灶周?chē)又兴劳錾窠?jīng)元比例升高（P＜0.05）；與TBI 組比較，TBI+RF 組大鼠病灶周?chē)又兴劳錾窠?jīng)元百分比降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠病灶周?chē)鶱LRP3含量比較 3組大鼠腦組織病灶周?chē)梢?jiàn)不同數(shù)量的NLRP3 陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖2。與Sham 組比較，TBI 組大鼠病灶周?chē)鶱LRP3 含量升高（P＜0.05）；與TBI 組比較，TBI+RF組大鼠病灶周?chē)鶱LRP3 含 量 降 低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Fig.1 Comparison of pathological changes of neurons in perifocal cortex of rats between the three groups(HE staining)圖1 各組大鼠病灶周?chē)窠?jīng)元病理變化比較（HE染色）

Tab.3 Comparison of the number of dead neurons and NLRP3 content in the perifocal cortex of rats between the three groups表3 各組大鼠病灶周?chē)又兴劳錾窠?jīng)元數(shù)量和NLRP3含量的比較 （n=4，±s）

Tab.3 Comparison of the number of dead neurons and NLRP3 content in the perifocal cortex of rats between the three groups表3 各組大鼠病灶周?chē)又兴劳錾窠?jīng)元數(shù)量和NLRP3含量的比較 （n=4，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05。

組別Sham組TBI組TBI+RF組F死亡神經(jīng)元（%）23.430±0.933 51.213±1.590a 37.198±1.528b 403.925＊＊NLRP3陽(yáng)性表達(dá)AOD值0.035±0.002 0.055±0.002a 0.039±0.04b 57.907＊＊

Fig.2 Comparison of NLRP3 content around lesion between the three groups(Immunohistochemical staining)圖2 各組大鼠病灶周?chē)鶱LRP3含量比較（免疫組化染色）

3 討論

TBI 是在外力作用下對(duì)大腦造成的一種獲得性損害。目前仍缺乏針對(duì)TBI 的有效藥物療法，臨床多以對(duì)癥治療和長(zhǎng)期康復(fù)訓(xùn)練為主，以此來(lái)促進(jìn)傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)［7-8］。RF 吸收入血后，在體內(nèi)迅速代謝為RF氮氧化物，可以很容易地穿過(guò)血腦屏障滲透到大腦［9］，間接提高腦組織內(nèi)cAMP 含量，已被證明對(duì)海馬神經(jīng)元損傷和腦缺血模型動(dòng)物具有神經(jīng)保護(hù)作用［3，10-11］。另外，Blokland 等［12］發(fā)現(xiàn)RF 可以改善健康老年人的言語(yǔ)記憶成績(jī)。本研究探討了RF 對(duì)大鼠TBI 的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)RF 治療后7 d、14 d mNSS 低于TBI 組；同時(shí)，其病灶周?chē)竽X皮層細(xì)胞間質(zhì)水腫減輕，死亡神經(jīng)元減少，提示RF 治療可以減輕大鼠TBI，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍未完全明確。

神經(jīng)炎癥貫穿于TBI 急性和慢性階段，可修復(fù)受損的組織，但過(guò)度產(chǎn)生的促炎癥介質(zhì)卻成為T(mén)BI病理進(jìn)展的重要推動(dòng)力。TBI 后早期神經(jīng)炎癥包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）激活和腦內(nèi)大量炎癥介質(zhì)釋放，如NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β等［13］。NLRP3是第一個(gè)在大腦中被研究的炎癥小體，主要位于小膠質(zhì)細(xì)胞中，其激活可以誘導(dǎo)趨化因子和IL-1β、IL-18、胱天蛋白酶-1 等炎癥介質(zhì)的釋放［14］，是TBI 后神經(jīng)炎癥和神經(jīng)行為障礙的主要驅(qū)動(dòng)因素之一。有研究表明，通過(guò)抑制NLRP3可以減輕腦水腫，縮小病灶體積，改善長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能，從而改變TBI模型小鼠預(yù)后［15］。Wang等［16］也發(fā)現(xiàn)抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性因子可以緩解TBI后神經(jīng)炎癥損傷。在本研究中，與Sham組比較，TBI 組大鼠病灶周?chē)又蠭L-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3 含量均升高，表明TBI 后早期神經(jīng)炎癥已激活，而經(jīng)RF治療后，上述炎癥介質(zhì)含量均明顯降低，提示RF對(duì)大鼠TBI的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和NLRP3等促炎介質(zhì)相關(guān)。

cAMP 是TBI 的一個(gè)關(guān)鍵因素，在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮信號(hào)級(jí)聯(lián)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠TBI 早期，腦組織內(nèi)cAMP 含量即出現(xiàn)明顯下降［17］，這種下降持續(xù)到傷后14 d 仍可被檢測(cè)到［18］，而提高cAMP含量可以提高TBI模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)［19］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，抑制磷酸二酯酶10A 可以縮短大鼠在TBI 后尋找平臺(tái)的時(shí)間，減輕TBI所致的神經(jīng)元損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用，這與cAMP/蛋白激酶A（PKA）信號(hào)通路的激活密切相關(guān)［20］。cAMP/PKA 信 號(hào) 通 路 被 激 活 后，可 導(dǎo) 致NLRP3 表達(dá)下調(diào)，而應(yīng)用PKA 抑制劑，則可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。此外，cAMP/PKA 信號(hào)通路激活也下調(diào)了TBI 后腦組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β 等促炎因子水平。本研究應(yīng)用RF間接提高TBI后腦組織內(nèi)cAMP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β 含量降低，與上述研究結(jié)果一致，提示RF 抑制TBI 后早期神經(jīng)炎癥可能與激活cAMP/PKA 信號(hào)通路有一定關(guān)系。

綜上所述，RF 通過(guò)降低TBI 早期炎癥介質(zhì)水平，減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用，與激活cAMP/PKA信號(hào)通路有一定關(guān)系。但本研究中未檢測(cè)cAMP 和PKA 相關(guān)蛋白含量，未來(lái)仍需更多的研究探討RF 調(diào)控cAMP/PKA 信號(hào)通路的作用機(jī)制。