溫腎醒脾化濁方對慢性腎功能衰竭模型腎損傷干預機制的研究*

顧茜蘭，吳敏曼，朱 丹，祁 燕，司怡然，徐 瑩，萬春平

（云南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650021）

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是由多種慢性腎臟疾病發(fā)展至晚期引起的腎小球濾過率下降（GFR<90 mL/min）以及腎臟其他功能損害，導致體內(nèi)代謝產(chǎn)物潴留、酸堿平衡失調(diào)和水電解質(zhì)代謝紊亂等臨床癥狀組成的綜合征[1]。該病復雜多變，已成為醫(yī)學領域面臨的重大挑戰(zhàn)。中醫(yī)治療作為延緩慢性腎衰竭進程的非透析療法逐漸引起人們的重視[2-3]。

中醫(yī)學認為慢性腎功能衰竭屬久病入絡，多因腎病日久，脾運失調(diào)，濁毒不化所致，治療原則通常以補腎健脾、通絡降濁為法[4-5]。溫腎醒脾化濁方由大黃、炒草果仁、黃芪等16 味中藥組成，該方具有溫腎健脾、補腎固精、扶正祛邪、解毒化濁等功效，臨床廣泛應用于慢性腎功能衰竭的治療。臨床觀察顯示，血肌酐在300 mmol/L 以內(nèi)的慢性腎衰患者治療有效率達80%。然而，目前尚未明確溫腎醒脾化濁方治療CRF的作用機制，因此有必要進一步研究。

腎纖維化（renal fibrosis） 是所有慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)展至終末期的共同途徑[6]，其病變主要以腎小球硬化與腎小管萎縮為主要病理表現(xiàn)，炎性細胞浸潤、上皮細胞轉(zhuǎn)化成纖維細胞、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度積累共同參與了腎纖維化的發(fā)病機制[7]?；诖耍狙芯繑M通過建立慢性腎衰竭大鼠模型，以腎纖維化為切入點，旨在揭示溫腎醒脾化濁方防治和延緩慢性腎衰竭作用的效應機制，為溫腎醒脾化濁方臨床應用于治療慢性腎功能衰竭提供科學基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF 級SD 正常大鼠41 只，雌性，7～8 周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0010；動物飼養(yǎng)在SPF 級動物房，實驗動物最少飼養(yǎng)1 周后使用。溫度（22±1）℃，濕度55%±5%，12 h 光暗循環(huán)。飼料、水均在消毒后由動物自由攝取。所有實驗均嚴格按照實驗動物相關條例進行。

1.2 主要藥物與試劑 注射用鹽酸多柔比星即鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準字H44024359，批號：2101E1）；尿酸檢測試劑盒、尿素氮檢測試劑盒和肌酐檢測試劑盒（羅氏診斷公司，批號分別為：53538501、53860001、53423001）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ染料（大連Takara，批號：RR820A）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連Takara，批號：RR036A）；Trizol 裂解液（天根生化（北京）科技有限公司，批號：RK145）。

1.3 主要儀器 酶標儀購自美國Molecular Devices公司；離心機購自德國賀利氏儀器公司；PCR 基因擴增儀購自美國ABI 公司；全自動生化儀購自美國羅氏公司；熒光定量PCR 儀購自美國Aglient 公司；NANODROP 2 000 核酸蛋白檢測儀購自美國Thermo公司。

2 方法及評價

2.1 受試藥物浸膏的制備 溫腎醒脾化濁方由大黃、炒草果仁、黃芪等16 味中藥組成，由云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，稱取配方中藥材1 940.4 g，粉碎、浸泡30 min 及以上，加入生藥體積10 倍、8 倍和6 倍的飲用水，各煎煮3 次，過濾，合并濾液，濃縮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏，浸膏938.3 g，折合成浸膏，1 g 浸膏中相當于含2.1 g 生藥，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.2 腎功能衰竭大鼠模型的建立、分組及給藥 選取41 只SPF 級健康成年雌性SD 大鼠，隨機分成5組，即正常組、模型組、溫腎醒脾化濁方低劑量組（1.49 g/kg）、中劑量組（2.98 g/kg）和高劑量組（5.95 g/kg）。采用1 次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素構建腎功能衰竭大鼠模型，具體方法如下：造模大鼠按照6 mg/kg 劑量經(jīng)尾靜脈1 次性注射鹽酸阿霉素，正常組大鼠經(jīng)尾靜脈1 次性注射等體積生理鹽水。于造模當天開始給藥，溫腎醒脾化濁方低、中、高劑量組分別灌胃給予溫腎醒脾化濁方1.49g/kg、2.98g/kg 和5.95 g/kg，1 次/d，連續(xù)灌胃27 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 CRF 大鼠24 h 尿蛋白檢測 觀察點時，大鼠禁食但不禁水，采用代謝籠收集24 h 尿液，記錄尿量后取1 mL，離心去除沉淀，參照考馬斯亮藍G-250法測定尿蛋白，檢測方法如下：標準品和離心后尿液加入96 孔板中后再加入200 μL 稀釋考馬斯亮藍工作液，室溫放置5 min，酶標儀595 nm 測定OD 值，計算各組大鼠24 h 尿蛋白含量。

24 h 尿蛋白含量=檢測值×尿量

2.3.2 CRF 大鼠血清腎功能生化指標檢測 末次給藥后，按5 mg/100 g 體質(zhì)量，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min，離心15 min，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）和尿酸（UA）水平。

2.3.3 H＆E 染色檢測腎臟的病理損傷程度 處死后，用生理鹽水主動脈灌注后，右腎臟橫切一半，放于10%福爾馬林固定，用于病理組織切片檢測。H＆E 染色如下：將固定好的腎組織通過75%、85%、95%、100%濃度梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm 薄片，蘇木素-伊紅（H＆E）染色，封片，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理損傷程度。

2.3.4 Real-time PCR 檢測腎纖維化相關基因mRNA 表達水平 分析天平稱取50 mg 腎組織，加入1 mL Trizol 裂解液，用勻漿器冰上勻漿，采用Trizol 試劑盒抽提總RNA，然后將總RNA 定量為1 000 ng。RT-PCR 法逆轉(zhuǎn)成cDNA，取同1 個cDNA 為模板，按實時定量PCR 試劑盒說明書，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進 行TGF-β1、MMP-9、Col4a2R、Fn1、TIMP-1 mRNA 表達檢測，結果以Ct 值顯示。目的基因表達的相對差異量用2-△△Ct法進行統(tǒng)計分析。特異基因引物序列如下：

2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0 軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，若方差齊，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計，若方差不齊，采用LSD 法分析，統(tǒng)計結果P<0.05、P<0.01、P<0.001 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況觀察 與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)行動遲緩，精神狀態(tài)較萎靡等狀況，并出現(xiàn)死亡情況，取腎臟并進行觀察，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組大鼠腎臟體積明顯增大，腎臟包膜泛白，皮質(zhì)變薄；與模型組比較，溫腎醒脾化濁方干預組行動、精神狀態(tài)均有所改善，未出現(xiàn)死亡情況，腎臟體積減少。

3.2 溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠24 h 尿蛋白含量和腎體質(zhì)量的影響 與正常組比較，病理模型組大鼠24 h 尿蛋白、尿體積、腎體質(zhì)量、腎臟指數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義，提示腎功能衰竭大鼠模型制備成功。與模型組比較，溫腎醒脾化濁方低、中和高劑量組24 h 尿蛋白、尿液含量劑量依耐性地減少，其中，中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義。溫腎醒脾化濁方藥物干預顯著抑制CRF 大鼠腎體質(zhì)量、腎臟指數(shù)；提示溫腎醒脾化濁方對CRF 具有較好的療效。見表1。

表1 溫腎醒脾化濁方對腎功能衰竭大鼠24 h 尿蛋白含量和腎體質(zhì)量的影響（±s）

表1 溫腎醒脾化濁方對腎功能衰竭大鼠24 h 尿蛋白含量和腎體質(zhì)量的影響（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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3.3 溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠腎功能的影響 腎功能檢測結果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清肌酐、尿素氮和尿酸水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，溫腎醒脾化濁方低、中、高劑量組肌酐劑量依耐性地減少，其中，中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義；溫腎醒脾化濁方各劑量干預后，顯著減少尿素氮的產(chǎn)生，其中，低、高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義；溫腎醒脾化濁方各給藥組血清尿酸水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義；提示溫腎醒脾化濁方對慢性腎功能衰竭具有顯著的腎功能保護效應。見表2。

表2 溫腎醒脾化濁方對腎功能衰竭大鼠腎功能指標的影響（±s）

表2 溫腎醒脾化濁方對腎功能衰竭大鼠腎功能指標的影響（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

尿酸/（mmol·L-1）正常組 6 - 28.17±2.56* 4.88±0.50* 39.80±5.74**模型組 9 - 39.63±10.77 6.69±1.74 75.65±12.25低劑量組 8 1.49 32.88±3.64 4.99±0.82* 62.48±10.06*中劑量組 9 2.98 30.13±3.04* 5.31±0.77 59.50±9.72*高劑量組 9 5.95 29.86±2.41* 4.99±0.84* 58.01±11.26*組別 n給藥劑量/（g·kg-1）肌酐/（μmol·L-1）尿素氮/（mmol·L-1）

3.4 溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠腎臟組織病理損傷的影響 H＆E 染色結果可見，正常組大鼠腎小球和腎小管排列整齊、形態(tài)完整，間質(zhì)無明顯的炎性細胞浸潤與纖維病變；腎功能衰竭大鼠腎小管排列無規(guī)則、出現(xiàn)不同程度的擴張，伴有大量棕褐色代謝產(chǎn)物沉積，腎小球變形萎縮，數(shù)量減少，腎間質(zhì)大量炎性浸潤，伴纖維化增生。溫腎醒脾化濁方各劑量組干預后，CRF 大鼠腎組織的炎性浸潤、纖維化增生以及腎小球變形萎縮等病變均有所改善。見圖1。

圖1 溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠腎臟組織病理變化的影響

3.5 溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠腎組織纖維化信號通路相關基因轉(zhuǎn)錄表達的影響 為進一步揭示溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠腎纖維化通路的影響，我們以最有效劑量溫腎醒脾化濁方高劑量與模型組進行比較，采用熒光定量PCR 技術檢測腎纖維化信號通路相關基因mRNA 表達情況。結果顯示，與病理模型組比較，溫腎醒脾化濁方高劑量組腎組織TGFβ1、Fn1、TIMP-1、Col4a2R mRNA 顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義，而MMP-9 mRNA 表達明顯上調(diào)，MMP-9/TIMP-1 比值顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 溫腎醒脾化濁方對CRF 大鼠腎組織腎纖維化信號通路相關基因轉(zhuǎn)錄表達的影響

4 討論

阿霉素腎病大鼠是一種經(jīng)典的慢性腎臟病模型，主要早期表現(xiàn)為腎小球微小病變，而后期表現(xiàn)為腎小球局灶階段性硬化為主，最終導致腎間質(zhì)纖維化和慢性腎功能衰竭，伴有尿蛋白、肌酐和尿素氮明顯異常[8]。其發(fā)病臨床表現(xiàn)和病理特征與臨床慢性腎病的病理特征極為相似，具有模型方法簡便、病變穩(wěn)定、發(fā)病率高、觀察指標改變明顯等優(yōu)點。因此是研究慢性腎病理想的疾病動物模型。利用此模型，本研究采用一次尾靜脈注射阿霉素誘導建立慢性腎衰竭大鼠模型，研究溫腎醒脾化濁方對慢腎衰大鼠24 h 尿蛋白和腎功能的影響。H＆E 染色檢測腎臟的病理變化明確其防治慢性腎功的藥效。結果顯示，溫腎醒脾化濁干預顯著減少24 h 蛋白尿和腎體質(zhì)量的異常增加，降低腎功尿素氮和肌酐的水平，改善腎組織的炎性細胞浸潤、纖維化增生以及腎小球變形萎縮等病變，表現(xiàn)出對慢性腎臟功能較好的保護作用，值得臨床進一步推廣應用。

腎纖維化是所有慢性腎病發(fā)展至終末期的共同途徑[6]，因此如何保護腎功能并延緩腎臟纖維化的進展速度是慢性腎病治療的關鍵。腎纖維化的形成涉及系膜細胞的增殖、單核細胞的浸潤、成纖維細胞異常增殖、ECM 降解減少或積聚過多等病變[7]。MMP-9 是MMPs 超基因家族成員之一，主要降解IV、V、VII、XI型膠原、彈性蛋白和蛋白聚糖等，其主要生物學作用是在一定的條件作用下（如鋅離子和PH 值），參與細胞外基質(zhì)（ECM）降解與重建。而TIMP- 1 作為MMPs的主要抑制物之一，抑制絕大多數(shù)的MMPs，因此在細胞外基質(zhì)（ECM）積聚與降解動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[9-10]。最新研究表明，在腎臟基質(zhì)合成階段，MMP-9/TIMP-1 失衡與膠原降解受抑、ECM 聚集密切相關，最終會誘導腎臟纖維化快速進入硬化階段，使腎臟失去功能[11]。熒光定量PCR 檢測結果顯示，與病理模型組比較，溫腎醒脾化濁方組大鼠腎組織TIMP-1 mRNA 表達增加、MMP-9 mRNA 表達減少，MMP-9/TIMP-1 比值增加，提示溫腎醒脾化濁方可能通過提高MMP-9/TIMP-1 比值，提高對細胞外基質(zhì)（ECM）降解作用，維持ECM 積聚和降解的生理平衡，從而達到抗腎纖維化的作用。我們進一步檢測膠原酶Col4a2R mRNA 表達，發(fā)現(xiàn)溫腎醒脾化濁方組模型大鼠腎組織Col4a2R 轉(zhuǎn)錄表達顯著下降，進一步佐證我們的推測：溫腎醒脾化濁方可能通過提高MMP-9/TIMP-1 比值，增加對膠原酶的降解，從而延緩了腎纖維化進展。

細胞外基質(zhì)的增多和聚集是導致腎組織進行性纖維化的主要病理基礎。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）屬于生長因子超家族的一部分，它通過與細胞表面TGF-β 受體結合，以Smads 和非Smads 信號通路，對炎癥反應、細胞增殖、分化、凋亡及細胞外基質(zhì)的合成等起關鍵性調(diào)節(jié)作用，其不僅是目前發(fā)現(xiàn)的一種促纖維化的信號轉(zhuǎn)導分子，還是腎纖維化進程中重要的調(diào)節(jié)因子，其表達水平與腎纖維化呈顯著正相關性[12]。而纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）則是重要的細胞外基質(zhì)蛋白非膠原糖蛋白，介導腎纖維化的病理過程。實時熒光PCR 檢測結果表明，溫腎醒脾化濁方干預可顯著下調(diào)TGFβ1 及Fn1 mRNA 的表達，提示下調(diào)TGF-β1 表達和Fn1 mRNA 表達，減少細胞外基質(zhì)的合成可能是其延緩腎纖維化機制之一。本研究證實溫腎醒脾化濁方可能通過調(diào)控MMP-9/TIMP-1 失衡，下調(diào)TGF-β1 及Fn1 的表達，減少ECM 積聚，進而延緩腎纖維化形成和保護腎功能，該研究初步解析溫腎醒脾化濁法治療慢性腎功能衰竭的現(xiàn)代生物學特征，并為臨床溫腎醒脾化濁方治療慢性腎功能衰竭提供一定的實驗基礎。