• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    HDVRNA檢測(cè)的研究現(xiàn)狀

    2023-04-29 00:44:03高耀任鋒段鐘平
    臨床肝膽病雜志 2023年4期
    關(guān)鍵詞:診斷

    高耀 任鋒 段鐘平

    摘要:HDV感染導(dǎo)致的丁型肝炎是最嚴(yán)重的肝炎類型。由于缺乏精準(zhǔn)HDV RNA檢測(cè)方法,HDV的流行率被嚴(yán)重低估。HDV RNA是診斷HDV感染的金標(biāo)準(zhǔn),在HDV的診斷、篩查和指導(dǎo)治療方面具有重要意義。但因HDV基因型多、二級(jí)結(jié)構(gòu)牢固,導(dǎo)致HDV RNA檢測(cè)困難。本文就HDV RNA診斷方法的進(jìn)展進(jìn)行綜述,闡述了HDV RNA檢測(cè)方法從定性到定量檢測(cè)的進(jìn)展,為了解HDV RNA檢測(cè)重要意義以及促進(jìn)HDV RNA檢測(cè)新方法的研發(fā)提供新思路。

    關(guān)鍵詞:δ肝炎病毒; RNA; 診斷

    基金項(xiàng)目:

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81770611, 82002243); 北京自然科學(xué)基金和北京市教委聯(lián)合資助重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ202010025035); 首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(首發(fā)2020-1-1151); 北京市屬醫(yī)學(xué)科研院所公益發(fā)展改革試點(diǎn)項(xiàng)目(京醫(yī)研2021-10); 北京市衛(wèi)健委高層次公共衛(wèi)生技術(shù)人才建設(shè)項(xiàng)目“學(xué)科帶頭人”專項(xiàng)資助(SL-02-13); 北京市醫(yī)院管理中心“登峰人才”專項(xiàng)資助(DFL20221503); 首都醫(yī)科大學(xué)科研培育基金資助項(xiàng)目(PYZ22130)

    Current research status of hepatitis D virus RNA detection

    GAO Yao1,2, REN Feng1,2, DUAN Zhongping1. (1. Beijing Municipal Key Laboratory of Liver Failure and Artificial Liver Treatment Research, Beijing YouAn Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2. Beijing Institute of Hepatology, Beijing 100069, China)

    Corresponding author:

    DUAN Zhongping, duan2517@163.com (ORCID:0000-0002-8455-0426)

    Abstract:

    Hepatitis D caused by hepatitis D virus (HDV) infection is the most serious type of viral hepatitis. The prevalence rate of HDV has been seriously underestimated due to the lack of accurate HDV RNA detection methods. HDV RNA is the gold standard for the diagnosis of HDV infection and is of great significance in the diagnosis, screening, and treatment guidance of HDV. However, the multiple genotypes and strong secondary structure of HDV have led to great difficulties in HDV RNA detection. This article reviews the advances in HDV RNA detection methods and elaborates on the development from qualitative to quantitative detection methods, in order to provide new ideas for understanding the significance of HDV RNA detection and promoting the research and development of new HDV RNA detection methods.

    Key words:

    Hepatitis Delta Virus; RNA; Diagnosis

    Research funding:

    National Natural Science Foundation of China (81770611, 82002243); Key Projects of the Beijing Municipal Education Commissions Science and Technology Plan (KZ202010025035); Special Key Research Project of Capital Health Development Scientific Research (SF2020-1-1151); Pilot Project of Public Welfare Development and Reform of Beijing Municipal Medical Research Institutes (Beijing Medical Research No. 2021-10); High-level Public Health Technical Personnel Construction Project (Subject leaders-02-13); Talent Cultivation plan of “Climbing the peak” of Beijing Municipal Hospital Administration (DFL20221503); Research and Cultivation Foundation of Capital Medical University (PYZ22130)

    HDV是一種血源性傳播病原體,也是目前已知能夠感染人類的最小病毒[1]。HDV最初于1977年被Rizzetto等[2]首先在HBV感染相關(guān)重癥肝炎患者中發(fā)現(xiàn)。HDV是一種衛(wèi)星病毒,其感染和傳播均需要依賴HBV。因HDV感染而引起的丁型肝炎是最嚴(yán)重類型的病毒性肝炎。近年隨著HDV檢測(cè)準(zhǔn)確性的不斷提高,人們意識(shí)到HDV的流行率被嚴(yán)重低估,既往認(rèn)為丁型肝炎發(fā)病率低的看法被徹底顛覆,HDV的精準(zhǔn)檢測(cè)也逐漸成為研究熱點(diǎn)。

    1 HDV的流行率及其危害

    根據(jù)2020年的一項(xiàng)研究[1]估計(jì),全球約有1 200萬(wàn)人感染HDV。然而由于存在地區(qū)差異、人群差異、診斷方式差異,HDV的感染率被嚴(yán)重低估,后續(xù)有研究不斷更新了HDV的感染率,2021—2023年發(fā)表的薈萃分析[3-4]報(bào)道了HDV的感染人數(shù)高達(dá)5 000萬(wàn)~7 200萬(wàn)。

    目前已知感染HDV的高危因素包括靜脈吸毒(IVDU)、高危性行為(HRSB)、HIV感染、HCV感染、高發(fā)地區(qū)人口遷徙等。因此HDV的流行率存在較大的地域及人群差異。Miao等[4]通過(guò)對(duì)1980—2019年發(fā)表的研究進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn),HDV在普通人群中的流行率約為0.80%,在HBsAg陽(yáng)性人群可高達(dá)13.02%,在靜脈吸毒人群中的流行率為37.57%,在高危性行為人群中為17.01%。2022年Chen等[3]對(duì)1990—2021年發(fā)表的研究進(jìn)行薈萃分析,發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi),HDV/HBV/HIV三重感染者占HIV感染者的7.4%,在亞洲地區(qū)HDV有更高的流行率,尤其是在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū),HDV/HBV/HIV三重感染率甚至高達(dá)21.4%。

    HDV的流行率遠(yuǎn)超預(yù)期,HDV篩查尤其是對(duì)特殊人群的HDV檢測(cè)更加應(yīng)該引起重視。2017年歐洲肝病學(xué)會(huì)[5]和2016年亞太肝病學(xué)會(huì)[6]均建議對(duì)所有HBsAg陽(yáng)性人群進(jìn)行至少一次HDV檢測(cè)。2018年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)[7]則建議HDV的篩查不僅應(yīng)在HBsAg陽(yáng)性人群中進(jìn)行,更應(yīng)該在HDV高危人群中規(guī)律進(jìn)行。目前大多數(shù)國(guó)家及地區(qū)采用HDV血清學(xué)檢測(cè)(即HDV抗體)為主要檢測(cè)方式。2015年世界衛(wèi)生組織(WHO)慢性乙型肝炎指南[8]建議HDV活動(dòng)期應(yīng)根據(jù)HDV抗體滴度診斷,再通過(guò)HDV RNA檢測(cè)進(jìn)行最終確診。然而根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),目前全球只有64.9%的HDV抗體陽(yáng)性患者接受HDV RNA檢測(cè),而非洲地區(qū)檢測(cè)率更是遠(yuǎn)低于其他地區(qū),僅有41.3%的HDV抗體陽(yáng)性患者進(jìn)行了RNA檢測(cè)[1]。造成HDV檢測(cè)率低及各地區(qū)檢測(cè)率不同的原因,除了不同國(guó)家醫(yī)療水平存在差異,患者及醫(yī)療工作者對(duì)HDV的認(rèn)識(shí)不同以外,更要?dú)w因于HDV檢測(cè)方式及檢測(cè)精準(zhǔn)度存在巨大差異。

    2 HDV特征及其對(duì)RNA檢測(cè)的影響

    HDV顆粒直徑為36 nm,基因組長(zhǎng)度約1.7 kb,可編碼兩種形式的丁型肝炎抗原(HDAg),即小HDAg(S-HDAg)和大HDAg(L-HDAg)。S-HDAg是啟動(dòng)和維持HDV RNA復(fù)制所必需;L-HDAg可抑制HDV復(fù)制,對(duì)于病毒顆粒的組裝至關(guān)重要[9]。HDV僅在肝細(xì)胞核中復(fù)制,其病毒顆粒存在缺陷,故HDV的復(fù)制依賴于HBV。作為一種包膜蛋白,HBsAg允許HDV進(jìn)入肝細(xì)胞。HDV和HBV首先與肝細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)合,通過(guò)?;悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)進(jìn)入宿主細(xì)胞[10]。在發(fā)生細(xì)胞膜融合后,核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物被釋放并進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核,在細(xì)胞核內(nèi)S-HDAg的mRNA被轉(zhuǎn)錄和翻譯。進(jìn)入細(xì)胞核的RNA基因組(HDV-G)作為第一次滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增的模板參與復(fù)制,所產(chǎn)生的反式基因組RNA(HDV-AG)聚合物被核酶切割并連接成環(huán)狀單體。使用HDV-AG作為模板,合成HDV基因組RNA聚合物,并進(jìn)一步裂解形成單體。細(xì)胞腺苷脫氨酶1通過(guò)調(diào)節(jié)HDV-AG來(lái)調(diào)控L-HDAg的轉(zhuǎn)錄和翻譯[9]。S-HDAg和L-HDAg被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核,進(jìn)一步調(diào)節(jié)病毒復(fù)制或與HDV RNA結(jié)合形成RNP。含有HDV基因組RNA的RNP可以通過(guò)L-HDAg和HBsAg相互作用,輸出到細(xì)胞質(zhì)并包裹在HBV包膜中。HDV顆粒通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑釋放。除了依賴HBV包膜的感染方式,HDV還可以在有絲分裂期間直接在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移可復(fù)制的HDV RNA[11]。HDV有8種基因型,同一基因型分離株之間的差異小于16%,而不同基因型分離株差異可高達(dá)40%[12]。HDV的這一特征也是導(dǎo)致HDV RNA檢測(cè)困難的主要原因之一。

    3 HDV RNA檢測(cè)的臨床意義

    HDV感染形式有2種。(1)合并感染:HDV和HBV同時(shí)感染宿主引起急性病毒性肝炎;(2)雙重感染:HBsAg攜帶者或慢性HBV感染者重復(fù)感染HDV導(dǎo)致慢性病毒性肝炎[13]。與慢性乙型肝炎相比,重疊感染HDV的患者發(fā)生肝硬化、肝功能失代償以及肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加2倍,在慢性乙型肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌人群中,HDV的流行率分別高達(dá)26.75%、25.77%和19.80%[14]。

    HDV有獨(dú)特的肝內(nèi)傳播方式。其需要HBV編碼的包膜蛋白進(jìn)行傳播和重新進(jìn)入肝細(xì)胞,HDV也可以通過(guò)細(xì)胞分裂傳播。進(jìn)入肝細(xì)胞后,HDV RNA的復(fù)制中間體被模式識(shí)別受體MDA5感知,誘導(dǎo)IFNβ/λ分泌。IFN的分泌強(qiáng)烈抑制了HDV基因組細(xì)胞分裂介導(dǎo)的肝內(nèi)病毒傳播。然而IFN不能影響靜止期肝細(xì)胞中的HDV RNA復(fù)制。因此在HDV的臨床治療中,IFNα/λ單藥治療有效,但很少能清除HDV。HDV感染途徑及肝內(nèi)復(fù)制方式的廣泛研究,明確了治療HDV的關(guān)鍵在于降低HDV滴度和HBsAg水平。既往HDV感染者的治療方式以PEG-IFNα治療為主,但是PEG-IFNα治療效果差,只有約20%的患者出現(xiàn)治療應(yīng)答,且?guī)?lái)的諸多副作用也增加了治療難度[15]。近年來(lái),3類新型抗HDV藥物先后進(jìn)行了臨床試驗(yàn),分別為進(jìn)入肝細(xì)胞抑制劑Bulevirtide(BLV)、戊烯化抑制劑(LNF)和HBsAg分泌抑制劑(核酸多聚體REP2139)。其中BLV已于2020年在歐洲作為治療HDV的藥物獲批上市。BLV可模仿L-HBsAg的NTCP受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,抑制HBV/HDV進(jìn)入肝細(xì)胞。研究[16]表明,BLV單獨(dú)用藥或與IFN等聯(lián)合使用均可明顯降低血清中HDV的病毒載量。皮下注射BLV 24周以上,68%~72%的患者出現(xiàn)HDV RNA載量降低(≥2 log10 IU/mL),但BLV不能降低HBsAg的水平。新型藥物單獨(dú)或與IFN的聯(lián)合使用或許能為HDV患者帶來(lái)治愈的曙光。

    盡管HDV感染的潛在機(jī)制尚不完全清楚,但HDV負(fù)荷量可以在一定程度上影響肝臟疾病的進(jìn)程。此外,目前尚無(wú)有效的HDV治療方法。因此,亟需開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、靈敏且特異性強(qiáng)的HDV RNA檢測(cè)方法,以監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展和評(píng)價(jià)治療效果。

    4 HDV血清學(xué)檢測(cè)方法及其不足

    從傳統(tǒng)意義上來(lái)說(shuō),病毒性疾病的診斷依賴于直接通過(guò)檢測(cè)完整病毒或其成分(蛋白質(zhì)或核酸)或通過(guò)間接血清學(xué)檢查以檢測(cè)病毒抗原或抗體。在HDV被發(fā)現(xiàn)后不久,相應(yīng)的抗原/抗體檢測(cè)方式被迅速研發(fā)。目前,抗體檢測(cè)常被用作HDV感染的初步篩查,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)或放射免疫測(cè)定檢測(cè)HDAg抗體,通常檢測(cè)抗-HD IgM和抗-HD IgG。在出現(xiàn)癥狀后的2~3周可檢測(cè)到抗-HD IgM,在急性HDV感染2個(gè)月后消失[17]。然而,在慢性HDV感染者急性發(fā)作期間,患者的抗-HD IgM也會(huì)升高,因此檢測(cè)抗-HD IgM不能明確區(qū)分急性和慢性HDV感染。急性HDV感染者的緩解期和慢性HDV感染者均出現(xiàn)抗-HD IgG,在病毒清除后抗體可持續(xù)存在較長(zhǎng)時(shí)間,因此難以區(qū)分HDV的現(xiàn)癥感染和既往感染。因此目前認(rèn)為HDV RNA檢測(cè)陽(yáng)性是確診HDV的金標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)HDV RNA的方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)。除了具有極高的診斷價(jià)值,HDV RNA的病毒載量檢測(cè)對(duì)于鑒別HDV基因型、確定治療方案、追蹤治療效果等方面亦具有較高的指導(dǎo)意義。因此WHO推薦所有HDV抗體陽(yáng)性的患者均應(yīng)進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)。

    5 HDV RNA檢測(cè)的方法及局限性

    5.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) PCR技術(shù)是分子生物學(xué)最偉大的成就之一,由Kary B. Mullis在1983年發(fā)明,并因此獲得了1993年的諾貝爾獎(jiǎng)。RT-PCR原理是在體外模擬遺傳物質(zhì)的天然復(fù)制,以微量的核酸模板擴(kuò)增得到大量的特定DNA片段。1985年,Randall K. Saiki等研究者首次將PCR技術(shù)用于臨床疾病診斷,其使用PCR技術(shù)檢測(cè)鐮狀細(xì)胞性貧血和β-地中海貧血。此后,PCR也被用于HDV檢測(cè)。1990年,法國(guó)學(xué)者Zignego等[18]發(fā)表相關(guān)研究,確定了應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)、克隆和測(cè)序的可行性,證明了PCR在診斷HDV感染、快速合成HDV探針和分析病毒遺傳變異方面具有重要價(jià)值。同一年,西班牙學(xué)者M(jìn)adejón等[19]驗(yàn)證了RT-PCR檢測(cè)HDV RNA在臨床中的可行性。該研究通過(guò)檢測(cè)梯度稀釋的HDV RNA,用RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern印記雜交,證明RT-PCR檢測(cè)比狹縫雜交技術(shù)(slot-blot hybridization)靈敏10 000倍。該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)將RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床,進(jìn)行了更大數(shù)量的臨床標(biāo)本驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)慢性HDV感染過(guò)程中不同HDV復(fù)制水平以及低水平的HDV復(fù)制與ALT之間存在相關(guān)性,表明PCR技術(shù)在檢測(cè)HDV復(fù)制中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[20]。越來(lái)越多的研究者將PCR應(yīng)用于HDV的研究,HDV RNA檢測(cè)的靈敏度和特異度不斷提升,操作步驟也被逐漸優(yōu)化。

    5.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR) 為進(jìn)一步提高PCR的精準(zhǔn)度及實(shí)現(xiàn)核酸定量,研發(fā)了RT-qPCR技術(shù)。RT-qPCR是指在PCR反應(yīng)中加入熒光物質(zhì),通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)判斷核酸擴(kuò)增情況,而后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板RNA進(jìn)行定量分析,以達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的目的。根據(jù)熒光信號(hào)來(lái)源的不同,可分為熒光染料法(SYBR Green)和探針?lè)ǎ═aqman)。染料法成本較低,應(yīng)用廣泛;探針?lè)`敏性和特異性更強(qiáng),但成本相對(duì)較高。迄今為止,RT-qPCR實(shí)驗(yàn)方法成熟,在核酸檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,也有公司在該方法的基礎(chǔ)上生產(chǎn)商品化試劑盒。盡管RT-qPCR在多種核酸檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的特異性和靈敏性,但是由于HDV基因型多(8種),各基因型間的序列差異較大、二級(jí)結(jié)構(gòu)牢固、GC含量和互補(bǔ)性高以及HDV存在高度遺傳變異性,設(shè)計(jì)涵蓋所有基因型的引物和探針具有極大的挑戰(zhàn)性,因此HDV RNA檢測(cè)的進(jìn)展緩慢。

    2004年日本學(xué)者Yamashiro等[21]首次使用RT-qPCR檢測(cè)了48例HBsAg和丁型肝炎抗體陽(yáng)性患者血清中的HDV RNA,不僅證明了RT-qPCR(染料法)在臨床檢測(cè)中應(yīng)用的可能,還發(fā)現(xiàn)慢性肝炎和肝硬化患者血清中HDV RNA水平明顯高于無(wú)癥狀患者,提示血清HDV RNA的病毒載量與肝病不同進(jìn)程存在相關(guān)性。然而該研究設(shè)計(jì)的引物僅能檢測(cè)HDV-2型和HDV-4型,且所用的臨床樣本量少。2005年,法國(guó)學(xué)者Le Gal等[22]進(jìn)一步改進(jìn)了反應(yīng)體系,建立了Taqman探針?lè)z測(cè)HDV RNA,可對(duì)所有基因型進(jìn)行檢測(cè),且靈敏度高,可達(dá)到100拷貝/mL,并納入了更多血清樣本(共160例,其中包括IFN治療前后不同時(shí)間點(diǎn)的76例血清標(biāo)本)進(jìn)行驗(yàn)證,研究結(jié)果顯示HDV RNA的檢測(cè)有助于幫助明確丁型肝炎患者治療前、治療中和治療后的病毒學(xué)特征,可用于慢性感染者治療方案管理以及HDV感染史的研究。此外RT-qPCR還可以用于大規(guī)模的前瞻性研究,以確定治療指南和評(píng)估新藥的治療效果。在后續(xù)的數(shù)十年內(nèi),RT-qPCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于HDV檢測(cè),相關(guān)研究大量涌現(xiàn),主要集中于以下5個(gè)方面。(1)用于HBV感染人群中HDV的篩查。各國(guó)家的研究者分別對(duì)韓國(guó)[23]、埃及[24]、巴基斯坦[25]、巴西[26]、澳大利亞[27]等國(guó)家及地區(qū)的HDV流行率進(jìn)行評(píng)估,使人們逐漸意識(shí)到HDV的流行率被嚴(yán)重低估。(2)用于HDV基因型的檢測(cè)。確定了不同HDV基因型的流行區(qū)域[28],并發(fā)現(xiàn)HDV-3型與肝病的不良結(jié)局存在相關(guān)性[29]。通過(guò)研究大量血清或肝組織樣本,證明了HDV RNA病毒載量與暴發(fā)性肝炎、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[14]。(3)用于監(jiān)測(cè)IFN治療效果及新藥治療效果的臨床驗(yàn)證。證明了足療程、足量使用IFN或與其他藥物聯(lián)用可以降低HDV病毒載量[30-31],也證明了新型抗HDV藥物BLV、LNF和核酸多聚體REP213均具有良好的治療效果[16]。(4)用于HDV病毒譜的分析[32]和HDV全基因組測(cè)序[33],為理解HDV重組和明確HDV感染機(jī)制提供了幫助。(5)各研究者或公司用于研發(fā)商業(yè)檢測(cè)試劑盒??蓪?shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的一步實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄,從臨床樣本中快速、精準(zhǔn)、定量檢測(cè)HDV[34]。

    RT-qPCR檢測(cè)是一種成熟的檢測(cè)病毒核酸的方法,但在HDV的檢測(cè)中存在一些缺陷。RT-qPCR檢測(cè)進(jìn)行RNA定量需要標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線。多數(shù)已發(fā)表的研究使用的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品是HDV質(zhì)粒,但這并不能評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄的步驟。也有研究者[35]使用體外合成的RNA作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,雖然該方法可以評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄的步驟,但合成的RNA沒(méi)有牢固的二級(jí)結(jié)構(gòu),HDV基因組的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響HDV病毒載量的定量檢測(cè)。雖然WHO已經(jīng)提出了HDV RNA檢測(cè)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),但檢測(cè)方法仍需要進(jìn)行內(nèi)部?jī)?yōu)化,需與待測(cè)核酸進(jìn)行共純化、共擴(kuò)增。有研究者[36]使用管家基因如β-actin和18S rRNA作為內(nèi)部對(duì)照,然而,這些RNA的濃度在不同臨床樣本中存在較大差異。此外,質(zhì)控產(chǎn)品的選擇也會(huì)影響HDV RNA定量的準(zhǔn)確性。理想的核酸質(zhì)控產(chǎn)品不僅可以用于核酸檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制,也是評(píng)價(jià)檢測(cè)程序和對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的重要基礎(chǔ)。目前,RNA病毒的質(zhì)控產(chǎn)品多為裸露的RNA片段或完整的病毒顆粒。裸露的RNA片段很容易被環(huán)境中的RNase降解,而完整的病毒顆粒作為質(zhì)控樣品存在安全隱患。滅活藥物雖然可以降低傳染性,但病毒滅活試劑(如甲醛)會(huì)破壞病毒核酸,影響核酸的提?。?7]。理想的RNA質(zhì)控產(chǎn)品應(yīng)可以長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存RNA。裝甲R(shí)NA技術(shù)可以克服RNA的不穩(wěn)定性,已廣泛應(yīng)用于RNA病毒核酸質(zhì)控產(chǎn)品的研究。2016年,國(guó)際上首次對(duì)血漿HDV RNA定量進(jìn)行了外部質(zhì)量評(píng)估。對(duì)來(lái)自全球17個(gè)國(guó)家的28個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行綜合分析,結(jié)果表明,由于檢測(cè)技術(shù)和程序的差異以及設(shè)計(jì)的引物/探針目標(biāo)區(qū)域的不同,結(jié)果具有高度異質(zhì)性[38]。因此,有必要建立一個(gè)國(guó)際通用的HDV RNA定量檢測(cè)體系。

    5.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP) LAMP是1998年由日本Eiken Chemical公司研發(fā),該技術(shù)改善了PCR的部分不足。與PCR相比,LAMP具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)反應(yīng)快速、靈敏性高??梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)(<1 h)將DNA的擴(kuò)增數(shù)量增加到10億,而PCR只能擴(kuò)增到100萬(wàn)。(2)不依賴大型儀器或設(shè)備。LAMP可以不依賴大型儀器設(shè)備,僅需要干式加熱器或水浴鍋進(jìn)行加熱即可進(jìn)行反應(yīng)。(3)特異性高。LAMP的優(yōu)點(diǎn)在于其高特異性,這是由于LAMP需要使用4~6種引物,可以識(shí)別DNA模板上8個(gè)以上的特定位點(diǎn),相比之下,PCR只能識(shí)別2個(gè)位點(diǎn)。(4)結(jié)果判讀方便。LAMP的產(chǎn)物可以在反應(yīng)結(jié)束后立即用肉眼觀察,甚至在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)也可以觀察到(如產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的白色沉淀),而不需要任何額外的步驟。盡管LAMP已經(jīng)用于多種病毒和基因檢測(cè),但其在HDV RNA檢測(cè)方面仍屬新方法,這與HDV RNA基因型多、引物設(shè)計(jì)困難有關(guān)。Wang等[39]建立了RT-LAMP檢測(cè)方法,特異性檢測(cè)HDV-1型,該方法反應(yīng)體系僅需在65 ℃下反應(yīng)50? min,檢測(cè)下限為75 fg/μL,與常規(guī)的定性或定量PCR相比,RT-LAMP檢測(cè)靈敏度提高了1? 000倍,且方法特異性高,與HIV、HAV、HBV、HCV、HEV等病毒無(wú)交叉反應(yīng)。雖然與PCR相比,該方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但其只針對(duì)了HDV-1型,且依賴加熱設(shè)備維持反應(yīng)溫度,因此仍需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以實(shí)現(xiàn)HDV核酸即時(shí)檢測(cè)。

    5.4 微滴式數(shù)字PCR(ddPCR) ddPCR是在傳統(tǒng)定量qPCR基礎(chǔ)上研發(fā)的新一代技術(shù),可以對(duì)RNA進(jìn)行定量。ddPCR的主要原理是利用微流控技術(shù)生成油包水乳化微滴顆粒,以每個(gè)油包水的微滴小顆粒作為反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR擴(kuò)增及后續(xù)熒光檢測(cè)。與96孔/384孔qPCR相比,ddPCR可以增加反應(yīng)體系的數(shù)量,精簡(jiǎn)操作步驟。ddPCR具有技術(shù)成熟、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),是目前應(yīng)用最廣泛的PCR技術(shù)之一。ddPCR的關(guān)鍵步驟有微滴生成、微滴操控、微滴檢測(cè)。ddPCR微滴發(fā)生器可將帶熒光的PCR反應(yīng)體系分隔成數(shù)千甚至上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴,RNA分子在各微滴顆粒中隨機(jī)分布,每個(gè)微滴顆粒都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系。經(jīng)PCR擴(kuò)增后,分析儀對(duì)每個(gè)微滴顆粒進(jìn)行檢測(cè),將熒光模擬信號(hào)數(shù)字化,有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”,無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”;根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例,最終通過(guò)分析軟件直接給出目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)濃度,因此不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn),完全不依賴于Ct值的鑒定,所以ddPCR受擴(kuò)增效率的影響大幅度降低,對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大幅度提高[40-41]。與qPCR相比,ddPCR具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)ddPCR的定量不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線;(2)ddPCR檢測(cè)RNA比qPCR具有更高的靈敏性和特異性。目前ddPCR的相關(guān)方法建立及臨床驗(yàn)證已陸續(xù)在HIV、HBV以及新冠病毒中開(kāi)展[41-43]。

    2022年,先后有兩項(xiàng)研究[44-45]通過(guò)ddPCR技術(shù)建立了HDV RNA的檢測(cè)方法并進(jìn)行了臨床驗(yàn)證。意大利學(xué)者Olivero等[44]檢測(cè)HDV質(zhì)粒及20例HDV陽(yáng)性患者的血清樣本,對(duì)比了RT-qPCR與ddPCR的靈敏性及特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用相同引物和探針(涵蓋HDV的8種基因型)的情況下,RT-qPCR與ddPCR的靈敏性、特異性和檢測(cè)下限相似。然而在研究中,ddPCR的檢測(cè)范圍與RT-qPCR存在差異。RT-qPCR的線性范圍為1×10~1×108 IU/mL,ddPCR定量線性動(dòng)態(tài)范圍為1×10~1×106 IU/mL。這與ddPCR的定量方式有關(guān),在較高的RNA濃度下(1×107和1×108 IU/mL),反應(yīng)被過(guò)量的目標(biāo)分子飽和,而檢測(cè)到的陰性樣本量較少,無(wú)法應(yīng)用泊松分布來(lái)計(jì)算起始樣品中靶分子的含量。同年,我國(guó)學(xué)者Xu等[45]通過(guò)使用ddPCR檢測(cè)梯度稀釋的HDV全基因型的通用質(zhì)粒(pMD19T),證明所建立方法的檢測(cè)下限(0.29 IU/mL vs 650.00 IU/mL)和定量檢測(cè)下限(76 IU/mL vs 7 315.82 IU/mL)均優(yōu)于RT-qPCR。該研究同時(shí)使用ddPCR和RT-qPCR檢測(cè)44例(30例HDV感染和14例HBV感染)患者血清樣本,證明ddPCR的特異性優(yōu)于RT-qPCR(24/44 vs 10/44)。此外,Xu等還應(yīng)用3種檢測(cè)方法(ELISA、RT-qPCR及ddPCR)對(duì)728例HBV陽(yáng)性患者的血清樣本進(jìn)行了HDV篩查,在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌和,ELISA檢測(cè)的HDV抗體陽(yáng)性率分別為1.1%、3.3%、2.7%和7.1%,RT-qPCR檢測(cè)HDV RNA陽(yáng)性率分別為0、16.67%、15.4%和20%,ddPCR檢測(cè)HDV陽(yáng)性率分別為0、33.33%、30.77%和60%。證明ddPCR和RT-qPCR的技術(shù)性能具有高度的可比性,并且提示在肝衰竭患者中存在更高的HDV陽(yáng)性率。以上研究表明,ddPCR是一種可重復(fù)性高、不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線以及操作簡(jiǎn)便的方法,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

    6 展望

    越來(lái)越多的流行病學(xué)研究表明,HDV的全球患病率遠(yuǎn)高于先前的估計(jì)值。HDV感染的快速實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)于識(shí)別、監(jiān)測(cè)和控制疾病傳播具有重要的意義。RNA檢測(cè)是診斷HDV的金標(biāo)準(zhǔn),亦是監(jiān)測(cè)HDV治療效果的重要指標(biāo)。目前,不同的HDV RNA檢測(cè)方法靈敏度差異較大,主要原因在于缺乏國(guó)際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)比較不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果。不同實(shí)驗(yàn)室及技術(shù)人員在HDV RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量等一系列操作過(guò)程中存在差別,因此需要開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法,建立標(biāo)準(zhǔn)化程序,例如樣本類型、提取方法、引物/探針設(shè)計(jì)、使用儀器和報(bào)告數(shù)據(jù)方式等,以進(jìn)一步提高靈敏度和特異度,降低假陰性率,更早地識(shí)別丁型肝炎患者,及時(shí)控制HDV傳播。

    此外,低收入和中等收入國(guó)家或地區(qū)的醫(yī)療保健體系不完善,對(duì)HDV的認(rèn)識(shí)不足,普及HDV感染的嚴(yán)重性,進(jìn)行HDV篩查,以推動(dòng)丁型肝炎的早期檢測(cè)、早期診斷、早期治療,對(duì)降低丁型肝炎的危害,減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)有重大意義。部分HDV的高發(fā)區(qū)地處偏遠(yuǎn),缺乏大型儀器設(shè)備和專業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè),因此研發(fā)快速、便捷、不依賴儀器設(shè)備及對(duì)檢測(cè)人員要求低的HDV檢測(cè)新方法,以實(shí)現(xiàn)HDV的即時(shí)檢測(cè),是未來(lái)的主要研發(fā)重點(diǎn)。

    利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:高耀負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文;任鋒、段鐘平負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路并最后定稿。

    參考文獻(xiàn):

    [1]

    STOCKDALE AJ, KREUELS B, HENRION M, et al. The global prevalence of hepatitis D virus infection: Systematic review and meta-analysis[J]. J Hepatol, 2020, 73(3): 523-532. DOI: 10.1016/j.jhep.2020.04.008.

    [2]RIZZETTO M, CANESE MG, ARIC S, et al. Immunofluorescence detection of new antigen-antibody system (delta/anti-delta) associated to hepatitis B virus in liver and in serum of HBsAg carriers[J]. Gut, 1977, 18(12): 997-1003. DOI: 10.1136/gut.18.12.997.

    [3]CHEN S, REN F, HUANG X, et al. Underestimated prevalence of HIV, hepatitis B virus (HBV), and hepatitis D virus (HDV) triple infection globally: systematic review and meta-analysis[J]. JMIR Public Health Surveill, 2022, 8(11): e37016. DOI: 10.2196/37016.

    [4]MIAO Z, ZHANG S, OU X, et al. Estimating the global prevalence, disease progression, and clinical outcome of hepatitis delta virus infection[J]. J Infect Dis, 2020, 221(10): 1677-1687. DOI: 10.1093/infdis/jiz633.

    [5]European Association for the Study of the Liver. EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection[J]. J Hepatol, 2017, 67(2): 370-398. DOI: 10.1016/j.jhep.2017.03.021.

    [6]SARIN SK, KUMAR M, LAU GK, et al. Asian-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatitis B: a 2015 update[J]. Hepatol Int, 2016, 10(1): 1-98. DOI: 10.1007/s12072-015-9675-4.

    [7]TERRAULT NA, LOK A, MCMAHON BJ, et al. Update on prevention, diagnosis, and treatment of chronic hepatitis B: AASLD 2018 hepatitis B guidance[J]. Hepatology, 2018, 67(4): 1560-1599. DOI: 10.1002/hep.29800.

    [8]WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. Guidelines for the prevention, care and treatment of persons with chronic hepatitis B infection[R]. Geneva: World Health Organization, 2015.

    [9]WONG SK, LAZINSKI DW. Replicating hepatitis delta virus RNA is edited in the nucleus by the small form of ADAR1[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(23): 15118-15123. DOI: 10.1073/pnas.232416799.

    [10]LI J, WANDS J. Hepatitis B and D viral receptors[J]. Hepatology, 2016, 63(1): 11-13. DOI: 10.1002/hep.28131.

    [11]GIERSCH K, BHADRA OD, VOLZ T, et al. Hepatitis delta virus persists during liver regeneration and is amplified through cell division both in vitro and in vivo[J]. Gut, 2019, 68(1): 150-157. DOI: 10.1136/gutjnl-2017-314713.

    [12]DNY P. Hepatitis delta virus genetic variability: from genotypes I, II, III to eight major clades?[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2006, 307: 151-171. DOI: 10.1007/3-540-29802-9_8.

    [13]CAREDDA F, ROSSI E, DARMINIO MONFORTE A, et al. Hepatitis B virus-associated coinfection and superinfection with delta agent: indistinguishable disease with different outcome[J]. J Infect Dis, 1985, 151(5): 925-928. DOI: 10.1093/infdis/151.5.925.

    [14]ROMEO R, FOGLIENI B, CASAZZA G, et al. High serum levels of HDV RNA are predictors of cirrhosis and liver cancer in patients with chronic hepatitis delta[J]. PLoS One, 2014, 9(3): e92062. DOI: 10.1371/journal.pone.0092062.

    [15]WRANKE A, WEDEMEYER H. Antiviral therapy of hepatitis delta virus infection - progress and challenges towards cure[J]. Curr Opin Virol, 2016, 20: 112-118. DOI: 10.1016/j.coviro.2016.10.002.

    [16]TAN YC, LEE GH, HUANG DQ, et al. Future anti-HDV treatment strategies, including those aimed at HBV functional cure[J]. Liver Int, 2022. DOI: 10.1111/liv.15387. [Online ahead of print]

    [17]KOH C, HELLER T, GLENN JS. Pathogenesis of and new therapies for hepatitis D[J]. Gastroenterology, 2019, 156(2): 461-476. DOI: 10.1053/j.gastro.2018.09.058.

    [18]ZIGNEGO AL, DENY P, FERAY C, et al. Amplification of hepatitis delta virus RNA sequences by polymerase chain reaction: a tool for viral detection and cloning[J]. Mol Cell Probes, 1990, 4(1): 43-51. DOI: 10.1016/0890-8508(90)90038-2.

    [19]MADEJN A, CASTILLO I, BARTOLOM J, et al. Detection of HDV-RNA by PCR in serum of patients with chronic HDV infection[J]. J Hepatol, 1990, 11(3): 381-384. DOI: 10.1016/0168-8278(90)90225-g.

    [20]MADEJN A, CASTILLO I, COTONAT T, et al. Significance of low HDV replication levels during the natural history of HDV infection. Long-term follow-up[J]. J Hepatol, 1993, 17(Suppl 3): S157-S160. DOI: 10.1016/s0168-8278(05)80443-x.

    [21]YAMASHIRO T, NAGAYAMA K, ENOMOTO N, et al. Quantitation of the level of hepatitis delta virus RNA in serum, by real-time polymerase chain reaction—and its possible correlation with the clinical stage of liver disease[J]. J Infect Dis, 2004, 189(7): 1151-1157. DOI: 10.1086/382133.

    [22]LE GAL F, GORDIEN E, AFFOLABI D, et al. Quantification of hepatitis delta virus RNA in serum by consensus real-time PCR indicates different patterns of virological response to interferon therapy in chronically infected patients[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(5): 2363-2369. DOI: 10.1128/JCM.43.5.2363-2369.2005.

    [23]KIM HS, KIM SJ, PARK HW, et al. Prevalence and clinical significance of hepatitis D virus co-infection in patients with chronic hepatitis B in Korea[J]. J Med Virol, 2011, 83(7): 1172-1177. DOI: 10.1002/jmv.22095.

    [24]MAKHLOUF NA, MORSY KH, MAHMOUD AA. Hepatitis D virus infection among hepatitis B virus surface antigen positive individuals in Upper Egypt: Prevalence and clinical features[J]. J Infect Public Health, 2019, 12(3): 350-356. DOI: 10.1016/j.jiph.2018.12.001.

    [25]MOATTER T, ABBAS Z, SHABIR S, et al. Clinical presentation and genotype of hepatitis delta in Karachi[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(18): 2604-2607. DOI: 10.3748/wjg.v13.i18.2604.

    [26]SCARPONI CF, KROON EG, VIEIRA DS, et al. Molecular epidemiology of Hepatitis delta virus infection in Minas Gerais state from Brazil, an area outside the hyperendemic region of the Amazon Basin[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2019, 114: e190074. DOI: 10.1590/0074-02760190074.

    [27]JACHS M, BINTER T, SCHMIDBAUER C, et al. Hepatitis D virus (HDV) prevalence in Austria is low but causes considerable morbidity due to fast progression to cirrhosis[J]. United European Gastroenterol J, 2021, 9(10): 1119-1127. DOI: 10.1002/ueg2.12163.

    [28]RAMIA S, EL-ZAATARI M, SHARARA AI, et al. Current prevalence of hepatitis delta virus (HDV) infection and the range of HDV genotypes in Lebanon[J]. Epidemiol Infect, 2007, 135(6): 959-962. DOI: 10.1017/S0950268806007643.

    [29]MELO DA SILVA E, KAY A, LOBATO C, et al. Non-F HBV/HDV-3 coinfection is associated with severe liver disease in Western Brazilian Amazon[J]. J Med Virol, 2019, 91(6): 1081-1086. DOI: 10.1002/jmv.25411.

    [30]CASTELNAU C, LE GAL F, RIPAULT MP, et al. Efficacy of peginterferon alpha-2b in chronic hepatitis delta: relevance of quantitative RT-PCR for follow-up[J]. Hepatology, 2006, 44(3): 728-735. DOI: 10.1002/hep.21325.

    [31]WOLTERS LM, VAN NUNEN AB, HONKOOP P, et al. Lamivudine-high dose interferon combination therapy for chronic hepatitis B patients co-infected with the hepatitis D virus[J]. J Viral Hepat, 2000, 7(6): 428-434. DOI: 10.1046/j.1365-2893.2000.00254.x.

    [32]BOTELHO-SOUZA LF, SOUZA VIEIRA D, DE OLIVEIRA DOS SANTOS A, et al. Characterization of the genotypic profile of hepatitis delta virus: Isolation of HDV genotype-1 in the western Amazon region of Brazil[J]. Intervirology, 2015, 58(3): 166-171. DOI: 10.1159/000431040.

    [33]CELIK I, KARATAYLI E, CEVIK E, et al. Complete genome sequences and phylogenetic analysis of hepatitis delta viruses isolated from nine Turkish patients[J]. Arch Virol, 2011, 156(12): 2215-2220. DOI: 10.1007/s00705-011-1120-y.

    [34]KARATAYL1 E, ALTUNOGˇLU Y, KARATAYL1 SC, et al. A one step real time PCR method for the quantification of hepatitis delta virus RNA using an external armored RNA standard and intrinsic internal control[J]. J Clin Virol, 2014, 60(1): 11-15. DOI: 10.1016/j.jcv.2014.01.021.

    [35]KATSOULIDOU A, MANESIS E, ROKKA C, et al. Development and assessment of a novel real-time PCR assay for quantitation of hepatitis D virus RNA to study viral kinetics in chronic hepatitis D[J]. J Viral Hepat, 2013, 20(4): 256-262. DOI: 10.1111/jvh.12000.

    [36]SELVEY S, THOMPSON EW, MATTHAEI K, et al. Beta-actin—an unsuitable internal control for RT-PCR[J]. Mol Cell Probes, 2001, 15(5): 307-311. DOI: 10.1006/mcpr.2001.0376.

    [37]DHANASEKARAN S, DOHERTY TM, KENNETH J, et al. Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification[J]. J Immunol Methods, 2010, 354(1-2): 34-39. DOI: 10.1016/j.jim.2010.01.004.

    [38]LE GAL F, BRICHLER S, SAHLI R, et al. First international external quality assessment for hepatitis delta virus RNA quantification in plasma[J]. Hepatology, 2016, 64(5): 1483-1494. DOI: 10.1002/hep.28772.

    [39]WANG C, SHEN X, LU J, et al. Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system for rapid detection of HDV genotype 1[J]. Lett Appl Microbiol, 2013, 56(3): 229-235. DOI: 10.1111/lam.12039.

    [40]KOJABAD AA, FARZANEHPOUR M, GALEH H, et al. Droplet digital PCR of viral DNA/RNA, current progress, challenges, and future perspectives[J]. J Med Virol, 2021, 93(7): 4182-4197. DOI: 10.1002/jmv.26846.

    [41]LIU X, FENG J, ZHANG Q, et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets[J]. Emerg Microbes Infect, 2020, 9(1): 1175-1179. DOI: 10.1080/22221751.2020.1772679.

    [42]CAVIGLIA GP, ABATE ML, TANDOI F, et al. Quantitation of HBV cccDNA in anti-HBc-positive liver donors by droplet digital PCR: A new tool to detect occult infection[J]. J Hepatol, 2018, 69(2): 301-307. DOI: 10.1016/j.jhep.2018.03.021.

    [43]CASSIDY N, FISH CS, LEVY CN, et al. HIV reservoir quantification using cross-subtype multiplex ddPCR[J]. iScience, 2022, 25(1): 103615. DOI: 10.1016/j.isci.2021.103615.

    [44]OLIVERO A, ROSSO C, CIANCIO A, et al. Clinical application of droplet digital PCR for hepatitis delta virus quantification[J]. Biomedicines, 2022, 10(4): 792. DOI: 10.3390/biomedicines10040792.

    [45]XU L, ZHANG X, CAO Y, et al. Digital droplet PCR for detection and quantitation of hepatitis delta virus[J]. Clin Transl Gastroenterol, 2022, 13(7): e00509. DOI: 10.14309/ctg.0000000000000509.

    收稿日期:

    2023-02-21;錄用日期:2023-03-21

    本文編輯:葛俊

    猜你喜歡
    診斷
    常見(jiàn)羽毛球運(yùn)動(dòng)軟組織損傷及診斷分析
    淺談豬喘氣病的病因、診斷及防治
    信息技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)在當(dāng)代汽車維修中的應(yīng)用分析
    紅外線測(cè)溫儀在汽車診斷中的應(yīng)用
    科技視界(2016年21期)2016-10-17 18:28:05
    窄帶成像聯(lián)合放大內(nèi)鏡在胃黏膜早期病變?cè)\斷中的應(yīng)用
    淺析智能變電站二次設(shè)備的運(yùn)行診斷及其調(diào)試
    最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久久久中文| 中文资源天堂在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久久久久久久久久免费av| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费黄色在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产v大片淫在线免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日韩精品有码人妻一区| 免费大片18禁| 麻豆乱淫一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 深夜a级毛片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国内精品美女久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一个人看视频在线观看www免费| 在线观看av片永久免费下载| 综合色av麻豆| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人综合一区亚洲| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久久久久久久久久丰满| 不卡视频在线观看欧美| 免费看a级黄色片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一本一本综合久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 免费观看在线日韩| 少妇的逼好多水| 大片免费播放器 马上看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 97超碰精品成人国产| av网站免费在线观看视频 | 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 人妻系列 视频| 少妇的逼水好多| 22中文网久久字幕| 国产精品三级大全| 午夜激情欧美在线| 色5月婷婷丁香| 免费高清在线观看视频在线观看| 舔av片在线| xxx大片免费视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲国产欧美人成| 久久人人爽人人片av| 午夜免费观看性视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 天堂网av新在线| 看十八女毛片水多多多| 美女黄网站色视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产色婷婷99| 一区二区三区高清视频在线| av一本久久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 高清视频免费观看一区二区 | 内地一区二区视频在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区亚洲一区在线观看| 水蜜桃什么品种好| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产亚洲精品久久久com| 国产乱人偷精品视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 老司机影院成人| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 婷婷六月久久综合丁香| 大香蕉97超碰在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 免费大片黄手机在线观看| 九色成人免费人妻av| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品一区二区三区人妻视频| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 看十八女毛片水多多多| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产高清在线一区二区三| av.在线天堂| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日日啪夜夜撸| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产成年人精品一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国国产精品蜜臀av免费| 免费观看性生交大片5| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产视频内射| 草草在线视频免费看| 国产探花在线观看一区二区| 人妻一区二区av| 国产一区二区三区综合在线观看 | 在线观看一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品久久久久久av不卡| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜福利在线在线| 精品久久久久久久末码| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 极品教师在线视频| 黄色日韩在线| 日本wwww免费看| 国产免费视频播放在线视频 | 日本wwww免费看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 免费少妇av软件| 国产精品综合久久久久久久免费| 一级毛片电影观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲在久久综合| 久久国产乱子免费精品| 69av精品久久久久久| 欧美 日韩 精品 国产| 国产探花极品一区二区| 免费观看a级毛片全部| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产91av在线免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 日日撸夜夜添| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 搡老妇女老女人老熟妇| 晚上一个人看的免费电影| 久久久欧美国产精品| 日日啪夜夜撸| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲不卡免费看| 欧美区成人在线视频| xxx大片免费视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美激情国产日韩精品一区| www.色视频.com| 高清欧美精品videossex| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 天堂√8在线中文| 国产中年淑女户外野战色| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成人午夜精彩视频在线观看| 69人妻影院| 午夜福利在线观看吧| 国产精品熟女久久久久浪| videossex国产| 性插视频无遮挡在线免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产久久久一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 五月玫瑰六月丁香| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 午夜福利在线观看吧| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 床上黄色一级片| 午夜福利在线观看吧| 国产色婷婷99| 成人国产麻豆网| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 在线免费十八禁| 国产精品不卡视频一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 超碰97精品在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 成年人午夜在线观看视频 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99热这里只有是精品在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 真实男女啪啪啪动态图| 婷婷色综合大香蕉| 国产美女午夜福利| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 97超视频在线观看视频| 极品教师在线视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲一区高清亚洲精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜亚洲福利在线播放| av专区在线播放| eeuss影院久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 白带黄色成豆腐渣| 少妇的逼好多水| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产黄片美女视频| 日韩大片免费观看网站| 少妇熟女欧美另类| 我的老师免费观看完整版| 视频中文字幕在线观看| 看黄色毛片网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 青春草国产在线视频| av天堂中文字幕网| 亚洲国产欧美人成| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 18禁动态无遮挡网站| 国产成人精品久久久久久| 18禁在线播放成人免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品国产三级普通话版| 亚洲欧美一区二区三区国产| 高清午夜精品一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久99精品国语久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品一区二区在线观看99 | 精品国内亚洲2022精品成人| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热全是精品| 国产精品一区二区性色av| 一夜夜www| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av.av天堂| 美女高潮的动态| 午夜福利网站1000一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 岛国毛片在线播放| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美潮喷喷水| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日日啪夜夜撸| 51国产日韩欧美| 插逼视频在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 日韩国内少妇激情av| 男女边吃奶边做爰视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品一及| 丝瓜视频免费看黄片| 中文欧美无线码| 能在线免费观看的黄片| 人体艺术视频欧美日本| 美女内射精品一级片tv| www.av在线官网国产| 成人特级av手机在线观看| av线在线观看网站| 黄片wwwwww| 少妇人妻精品综合一区二区| 边亲边吃奶的免费视频| av国产久精品久网站免费入址| 欧美+日韩+精品| 有码 亚洲区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久精品久久久久久久性| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲国产最新在线播放| 看十八女毛片水多多多| 91久久精品国产一区二区成人| 中文资源天堂在线| 乱人视频在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 性色avwww在线观看| www.av在线官网国产| 一级二级三级毛片免费看| 可以在线观看毛片的网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩制服骚丝袜av| 欧美成人a在线观看| 尾随美女入室| 久久久久久久午夜电影| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国精品久久久久久国模美| 真实男女啪啪啪动态图| 国产真实伦视频高清在线观看| 一区二区三区免费毛片| 少妇高潮的动态图| 亚洲欧洲国产日韩| 国产一级毛片在线| 亚洲av国产av综合av卡| 最近视频中文字幕2019在线8| 又爽又黄a免费视频| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜福利高清视频| 一级毛片久久久久久久久女| 麻豆成人av视频| 在线观看一区二区三区| 国产精品伦人一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费观看性生交大片5| 久久久精品免费免费高清| 少妇丰满av| 国产精品一二三区在线看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品一区在线观看国产| 97超碰精品成人国产| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日日啪夜夜爽| 男人舔女人下体高潮全视频| 最近的中文字幕免费完整| 日本免费在线观看一区| 午夜老司机福利剧场| 赤兔流量卡办理| 高清av免费在线| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品456在线播放app| 伦理电影大哥的女人| 国产高清有码在线观看视频| 国产成人freesex在线| 国产三级在线视频| 99热这里只有是精品在线观看| 久久精品人妻少妇| 丰满少妇做爰视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一级片'在线观看视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品成人久久久久久| 精品久久国产蜜桃| 日韩欧美一区视频在线观看 | 免费电影在线观看免费观看| 婷婷色av中文字幕| 少妇人妻一区二区三区视频| 国模一区二区三区四区视频| 全区人妻精品视频| 激情 狠狠 欧美| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲av免费高清在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产最新在线播放| 看免费成人av毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产淫语在线视频| 国产视频首页在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 成人性生交大片免费视频hd| 国产黄片美女视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久鲁丝午夜福利片| 嫩草影院新地址| 亚洲精品视频女| 久久韩国三级中文字幕| 黄色欧美视频在线观看| 国产成人福利小说| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日日啪夜夜撸| 老司机影院成人| 国产有黄有色有爽视频| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产在线男女| 欧美一区二区亚洲| 国产精品不卡视频一区二区| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久国产网址| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本免费在线观看一区| 在现免费观看毛片| 亚洲av二区三区四区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲成人av在线免费| 亚洲最大成人av| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久久伊人网av| av在线老鸭窝| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产成年人精品一区二区| 中文字幕久久专区| 美女国产视频在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩伦理黄色片| 99热全是精品| 深夜a级毛片| 乱系列少妇在线播放| 亚洲av二区三区四区| 能在线免费看毛片的网站| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美成人a在线观看| 人妻一区二区av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99久久精品一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲欧美精品专区久久| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美精品v在线| 中文字幕制服av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本黄色片子视频| 午夜福利在线在线| 久久久久久久国产电影| 亚洲成人av在线免费| 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级黄片播放器| 国产av码专区亚洲av| 成年人午夜在线观看视频 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品久久久噜噜| 国产精品久久久久久久电影| av免费观看日本| 免费观看无遮挡的男女| 免费看不卡的av| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久韩国三级中文字幕| 97超碰精品成人国产| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲av国产av综合av卡| 色播亚洲综合网| 日韩成人伦理影院| 国产精品久久久久久精品电影| 人妻系列 视频| 免费看不卡的av| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 成人无遮挡网站| 看免费成人av毛片| 久久综合国产亚洲精品| 日韩一区二区视频免费看| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲不卡免费看| 欧美成人a在线观看| 插逼视频在线观看| 日韩av在线大香蕉| 日韩成人伦理影院| 国产亚洲最大av| 青春草视频在线免费观看| 嫩草影院精品99| 少妇熟女aⅴ在线视频| 美女内射精品一级片tv| 最近中文字幕2019免费版| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国内精品美女久久久久久| 欧美另类一区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av卡一久久| 九草在线视频观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 国产中年淑女户外野战色| 国产不卡一卡二| 熟女人妻精品中文字幕| 黄片wwwwww| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 午夜免费观看性视频| 午夜亚洲福利在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产69精品久久久久777片| 亚洲av成人精品一二三区| 成人二区视频| 国产精品一及| 国产综合懂色| 国产精品精品国产色婷婷| 中文字幕制服av| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费少妇av软件| 久久久久久伊人网av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产av码专区亚洲av| 一个人免费在线观看电影| 国产老妇女一区| 免费黄色在线免费观看| 男女边摸边吃奶| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久久成人免费电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | a级一级毛片免费在线观看| 日韩强制内射视频| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品人妻久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 熟女电影av网| 99热全是精品| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日本av手机在线免费观看| 国产av码专区亚洲av| 日韩一区二区三区影片| av免费在线看不卡| 中国美白少妇内射xxxbb| 大片免费播放器 马上看| 国产乱人视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 在线观看免费高清a一片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品国内亚洲2022精品成人| 色哟哟·www| 免费大片黄手机在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 婷婷色综合大香蕉| 日本黄色片子视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 内地一区二区视频在线| 色哟哟·www| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人亚洲精品一区在线观看 | 男的添女的下面高潮视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 深夜a级毛片| 午夜精品一区二区三区免费看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲性久久影院| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 搞女人的毛片| 久久午夜福利片| 岛国毛片在线播放| 97热精品久久久久久| 免费大片黄手机在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美人与善性xxx| 免费av毛片视频| 成人综合一区亚洲| 美女黄网站色视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜免费观看性视频| 免费观看a级毛片全部| 欧美3d第一页| 亚洲精品成人久久久久久| 一级av片app| 欧美精品一区二区大全| 韩国高清视频一区二区三区| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜老司机福利剧场| 搞女人的毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 一级毛片电影观看| 在线观看人妻少妇| 精品久久久久久电影网| 99热这里只有是精品50| 黄片wwwwww| 韩国av在线不卡| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 能在线免费观看的黄片| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av免费在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品乱久久久久久| 成人欧美大片| 中国国产av一级| 国产精品一区二区三区四区免费观看| videossex国产| 午夜福利高清视频| 久久久久网色| 黄片无遮挡物在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线观看免费高清a一片| 尾随美女入室| 丝袜美腿在线中文| 欧美日本视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产激情偷乱视频一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| av在线老鸭窝| 久久久久久伊人网av| videossex国产| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品一区二区三区人妻视频|