多房棘球蚴源性外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

冶賡博 陳功富 崔紫煙 吳俊杰 黃登亮 尹鳳嬌 王志鑫 于文昊 孔繁玉 樊海寧 任利

摘要：目的 探究不同時(shí)間及濃度多房棘球蚴源性外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。方法 從60只造模BALB/c小鼠中隨機(jī)選取4只，應(yīng)用7.0T MRI觀察腹腔病灶生長(zhǎng)情況；解剖造模小鼠，通過(guò)腹腔病灶提取原頭節(jié)進(jìn)行體外培養(yǎng)，超速離心法從培養(yǎng)上清中提取外泌體，透射電鏡及蛋白質(zhì)免疫印跡法鑒定外泌體表征。將未加外泌體處理的巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組設(shè)為對(duì)照組，不同濃度多房棘球蚴來(lái)源外泌體與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組（10 μg/mL組、50 μg/mL組），分別共培養(yǎng)48 h和72 h，顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)變化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)極化狀態(tài)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果 7.0T MRI顯示小鼠腹腔內(nèi)彌漫分布、大小不等的病灶形成；多房棘球蚴源性外泌體直徑100 nm左右，呈杯型或茶托型，其表面標(biāo)志物CD9、TSG101和CD63表達(dá)陽(yáng)性。共培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞拉長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，主要呈多角形；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)48 h，對(duì)照組CD16/32、CD206、CD369陽(yáng)性率分別為（99.53±0.06）%、（90.27±0.21）%、（2.40±0.20）%；與對(duì)照組相比，除10 μg/mL外泌體組CD369陽(yáng)性率［（0.80±0.00）%］降低（P＜0.05），其余組別CD16/32、CD206、CD369陽(yáng)性率均明顯升高（P值均＜0.000 1）；共培養(yǎng)72 h，對(duì)照組CD16/32、CD206、CD369陽(yáng)性率分別為（99.67±0.06）%、（85.47±0.55）%、（6.60±0.20）%，實(shí)驗(yàn)組CD16/32、CD206、CD369陽(yáng)性率較對(duì)照組均明顯升高（P值均＜0.05）。ELISA結(jié)果示：共培養(yǎng)48 h，對(duì)照組IL-6及TNFα水平分別為（58.53±15.52） pg/mL、（320.70±5.30）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組外泌體濃度為50 μg/mL時(shí)IL-6［（98.81±15.55） pg/mL］較對(duì)照組升高（P＜0.05）；共培養(yǎng)72 h，對(duì)照組IL-6及TNFα水平分別為（76.22±9.68）pg/mL、（323.90±87.37）pg/mL，當(dāng)外泌體濃度為10 μg/mL時(shí)TNFα水平［（164.20±14.17）pg/mL］較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）；當(dāng)外泌體濃度為50 μg/mL時(shí)IL-6水平［（99.52±8.35）pg/mL］較對(duì)照組升高（P＜0.05）。結(jié)論 多房棘球蚴源性外泌體可調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，且在濃度為10 μg/mL，共培養(yǎng)72 h后，可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M2樣極化，具體方式有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：棘球蚴病， 肝； 外泌體； 巨噬細(xì)胞； 小鼠， 近交BALB C

基金項(xiàng)目：青海省科技廳項(xiàng)目（2019-ZJ-7031）

Effect of exosomes derived from Echinococcus multilocularis on macrophage polarization： A preliminary study

YE Gengbo1，2， CHEN Gongfu1，2， CUI Ziyan1，2， WU Junjie1，2， HUANG Dengliang2， YIN Fengjiao1，2， WANG Zhixin1，2， YU Wenhao1，2， KONG Fanyu1，2， FAN Haining1，2， REN Li1，2. （1. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery， The Affiliated Hospital of Qinghai University， Xining 810001， China; 2. Qinghai Province Key Laboratory of Hydatid Disease Research， Xining 810001， China）

Corresponding author：

REN Li， renliweimin_xn@126.com （ORCID：0000-0001-6306-3533）

Abstract：

Objective To investigate the effect of exosomes derived from Echinococcus multilocularis on macrophage polarization after treatment for different durations and concentrations. Methods A total of 60 BALB/c mice were used for modeling， among which 4 mice were selected to observe the growth of abdominal lesions on 7.0T MRI. The mice for modeling were dissected， and the protoscoleces was taken from the abdominal lesion and cultured in vitro; ultracentrifugation was used to extract the exosomes from the supernatant， and transmission electron microscopy and Western blotting were used for the characterization of exosomes. The macrophages without exosome treatment were established as control group， and the macrophages co-cultured with different concentrations of exosomes derived from Echinococcus multilocularis were established as experimental group （10 μg/mL group and 50 μg/mL group） and were cultured for 48 and 72 hours. The morphological changes of macrophages were observed under a microscope， and flow cytometry and ELISA were used to observe polarization state. A one-way analysis of variance was used for comparison of normally distributed continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results The results of 7.0T MRI showed the formation of diffuse lesions with different sizes in the abdominal cavity of mice， and the exosomes derived from Echinococcus multilocularis were approximately 100 nm in diameter and were cup-shaped or saucer-shaped， with the positive expression of the surface markers CD9， TSG101， and CD63. After co-culture， most of the cells in the experimental group were elongated with an irregular and polygonal shape. Flow cytometry showed that after 48 hours of co-culture， the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 in the control group were 99.53%±0.06%， 90.27%±0.21%， and 2.40%±0.20%， respectively; compared with the control group， except that the 10 μg/mL exosome group had a significant reduction in the positive rate of CD369 （0.80%±0.00%） （P＜0.05）， all the other groups had a significant increase in the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 （all P＜0.000 1）; after 72 hours of co-culture， the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 in the control group were 99.67%±0.06%， 85.47%±0.55%， and 6.60%±0.20%， respectively， and compared with the control group， the experimental group had significant increases in the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 （all P＜0.05）. ELISA showed that after 48 hours of co-culture， the levels of IL-6 and TNFα in the control group were 58.53±15.52 pg/mL and 320.70±5.30 pg/mL， respectively， and when the exosome concentration was 50 μg/mL， the level of IL-6 in the experimental group was 98.81±15.55 pg/mL， which was higher than that in the control group （P＜0.05）; after 72 hours of co-culture， the levels of IL-6 and TNFα in the control group were 76.22±9.68 pg/mL and 323.90±87.37 pg/mL， respectively， and when the exosome concentration was 10 μg/mL， the level of TNFα was 164.20±14.17 pg/mL， which was significantly lower than that in the control group （P＜0.05）; when the exosome concentration was 50 μg/mL， the level of IL-6 was 99.52±8.35 pg/mL， which was significantly higher than that in the control group （P＜0.05）. Conclusion Exosomes derived from Echinococcus multilocularis can regulate macrophage polarization and induce M2-like polarization of macrophages after co-culture at a concentration of 10 μg /mL for 72 hours， and further studies are needed to clarify the specific method.

Key words：

Echinococcosis， Hepatic； Exosomes； Macrophages; Mice， Inbred BALB C

Research funding：

Project of Qinghai Provincial Department of Science and Technology （2019-ZJ-7031）

棘球蚴病俗稱(chēng)包蟲(chóng)病，分為細(xì)粒棘球蚴病和多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）。AE由于浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移特點(diǎn)，故有“蟲(chóng)癌”之稱(chēng)，對(duì)人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)威脅更為嚴(yán)重［1］。巨噬細(xì)胞是先天免疫的重要成員，M1型巨噬細(xì)胞可分泌如TNFα、IL-6及低水平IL-10等促炎因子，還可通過(guò)上調(diào)MHC-Ⅱ類(lèi)分子和共刺激分子CD40、CD80及CD86，幫助機(jī)體抵御多種病原體的侵害［2］;M2型可表達(dá)IL-10、TGFβ等抗炎分子，并通過(guò)高表達(dá)CD206、CD301和CD369等受體發(fā)揮吞噬作用［3-4］?，F(xiàn)研究［5-6］認(rèn)為M2型巨噬細(xì)胞極化與維持慢性炎癥、免疫抑制及腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。巨噬細(xì)胞在受到不同微環(huán)境刺激后，通過(guò)M1/M2表型的轉(zhuǎn)化，發(fā)揮不同的功能。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡外小體，被視為細(xì)胞間“通訊特工”，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中起著重要作用［7］。

當(dāng)多房棘球蚴侵入機(jī)體后，與宿主建立的復(fù)雜免疫抑制機(jī)制能成功使其躲避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷并長(zhǎng)期存活［8-9］，多項(xiàng)研究表明，血吸蟲(chóng)［10］、馬來(lái)絲蟲(chóng)［11］、弓形蟲(chóng)［12］等寄生蟲(chóng)源性外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化從而協(xié)助免疫逃逸，然而，多房棘球蚴來(lái)源的外泌體影響巨噬細(xì)胞表型和功能的研究較少見(jiàn)。本研究擬采用多房棘球蚴源性外泌體體外刺激巨噬細(xì)胞，利用流式和ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化，旨在探討多房棘球蚴源性外泌體是否具有促巨噬細(xì)胞極化的能力，為進(jìn)一步研究多房棘球蚴感染免疫逃逸新機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠60只，雌性，體質(zhì)量16～18 g，10周齡，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司［生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2019-0008］；種鼠為長(zhǎng)爪沙鼠1只，體質(zhì)量65 g，由青海大學(xué)包蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供［生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（浙）2019-0002］；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)均為：SYXK（青）2020-0001。

1.2 主要試劑及設(shè)備 J774A.1小鼠單核巨噬細(xì)胞（上海澤葉生物有限公司）；無(wú)外泌體胎牛血清（上海逍鵬生物科技有限公司）；IL-6（美國(guó)Abcam公司）；TNFα（南京森貝伽生物科技有限公司）；CD369、CD206、CD16/CD32（美國(guó)eBioscience 公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠麻醉劑為異氟烷（深圳瑞沃德生命有限公司，試劑編號(hào)：R510-22-8）和氧氣的混合氣體；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；Bruker Biospin 70/16小動(dòng)物專(zhuān)用7.0TMRI掃描系統(tǒng)（德國(guó)Bruker公司）；透射電子顯微鏡（日本TEM，Joel 公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；高速離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）； SDS-PAGE蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 7.0T MRI掃描 BALB/c小鼠腹腔感染原頭節(jié)4個(gè)月后，隨機(jī)選取4只置于密閉麻醉箱內(nèi)給予異氟烷與氧氣混合氣體麻醉，以俯臥位置于掃描床上，Bruker Biospin 70/16小動(dòng)物專(zhuān)用7.0TMRI掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描，了解腹腔病灶生長(zhǎng)情況以確定造模成功。

1.3.2 原頭節(jié)的提取 頸椎脫臼法處死感染多房棘球蚴的BALB/c模型小鼠，無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，分離出腹腔中多房棘球蚴病灶組織，無(wú)菌PBS液沖洗3次，刀片切碎至糊狀，80目及300目濾網(wǎng)分別反復(fù)過(guò)濾，獲得乳白色原頭節(jié)，置于含10%無(wú)外泌體胎牛血清及1 mL 5%雙抗的培養(yǎng)基中，于37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，裝入50 mL離心管，800×g離心5 min，吸取培養(yǎng)上清，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 外泌體提取及BCA定量 超速離心法提取上清中外泌體：4 ℃、300×g離心10 min，取上清；2 000×g離心10 min、去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，取上清；0.22 μm無(wú)菌濾器濾過(guò)以進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片；將濾過(guò)液在4 ℃ 140 000×g離心2 h，棄上清，PBS重懸沉淀，獲得的沉淀即為外泌體。鑒定：將沉淀重懸于100 μL PBS中，TEM觀察形態(tài)，Western Blot檢測(cè)特異性表面標(biāo)志物CD63、CD9和TSG101的表達(dá)，納米顆粒追蹤分析儀分析其直徑。為避免降解于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將?biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋為2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.062 5 mg/mL，外泌體稀釋為20 μL作為待測(cè)樣本，以PBS作空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)；將200 μL BCA工作液和25 μL樣品加在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中并充分混勻，37 ℃靜置30 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄OD562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的上清液體積計(jì)算出上清液的蛋白濃度，以外泌體樣品的蛋白濃度作為外泌體濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)照組：未加外泌體的巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組：多房棘球蚴來(lái)源外泌體與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)（10 μg/mL組、50 μg/mL組）。分別培養(yǎng)48 h、72 h后，流式和ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（M1：IL-6、TNFα、CD16/32；M2：CD206、CD369）的表達(dá)情況，并在顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞比例變化 刺激巨噬細(xì)胞48 h、72 h后，當(dāng)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%～80%時(shí)，收集細(xì)胞；1 300 r/min、離心3 min，棄上清；PBS 洗滌細(xì)胞沉淀，1 300 r/min、離心3 min，棄上清；重復(fù)上一步驟；100 μL PBS溶液配成混懸細(xì)胞沉淀并加入熒光抗體10 μL，4? ℃、避光條件下孵化0.5 h；離心并收集細(xì)胞，PBS 清洗細(xì)胞后置于離心機(jī)中，以1 300 r/min離心3 min，吸除上清；200 μL PBS溶液配置成混懸細(xì)胞沉淀，混勻并轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔滴入200 μL，上機(jī)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化指標(biāo)。

1.3.6 極化相關(guān)因子的檢測(cè) 用ELISA法檢測(cè)IL-6及TNFα：收集各組上清液，參考操作說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)各組細(xì)胞因子，據(jù)OD值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本濃度，所有檢測(cè)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，并用GraphPad Prism 8.3.0軟件繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 7.0T MRI掃描結(jié)果 與正常小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組：腹腔內(nèi)可見(jiàn)彌漫分布、大小不等的多房囊性和少量囊實(shí)性病灶；T1WI：呈多房囊狀，部分較大的病灶內(nèi)可見(jiàn)等信號(hào)的分隔；邊界顯示清楚（圖1a）。T2WI：呈高信號(hào)及混雜信號(hào)，部分可見(jiàn)囊實(shí)性改變，實(shí)性成分周邊見(jiàn)多發(fā)小囊泡結(jié)構(gòu)，部分肝臟受侵（圖1b）。

2.2 多房棘球蚴源性外泌體鑒定 觀察到多房棘球蚴源性外泌體呈杯型或茶托型，雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑100 nm左右，背景清晰，無(wú)污染（圖2a）；Western Blot結(jié)果顯示，標(biāo)志物CD9和TSG101表達(dá)陽(yáng)性，CD63表達(dá)為弱陽(yáng)性（圖2b）；本實(shí)驗(yàn)使用超速離心法提取的外泌體，結(jié)構(gòu)、大小、濃度及表面標(biāo)志物均符合要求。

2.3 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察 共培養(yǎng)48 h、72 h后，顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組細(xì)胞多呈橢圓形或圓形，而經(jīng)過(guò)不同濃度外泌體處理后，共培養(yǎng)48 h和72 h實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞拉長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，主要呈多角形（圖3）。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 共培養(yǎng)48 h：與對(duì)照組相比，除10 μg/mL外泌體組CD369陽(yáng)性率降低，其余組別CD16/32、CD206、CD369陽(yáng)性率均明顯升高（P值均＜0.000 1）；共培養(yǎng)72 h：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD16/32、CD206、CD369陽(yáng)性率較對(duì)照組均明顯升高（P值均＜0.05）（表1）。隨共培養(yǎng)時(shí)間及外泌體濃度變化，相關(guān)分子呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)（圖4、5）。

2.5 ELISA檢測(cè)結(jié)果 共培養(yǎng)48 h：與對(duì)照組相比，50 μg/mL外泌體組IL-6水平升高（P＜0.05）；共培養(yǎng)72 h：與對(duì)照組相比，當(dāng)外泌體濃度為10 μg/mL時(shí)TNFα水平明顯下降（P＜0.05）；當(dāng)外泌體濃度為50 μg/mL時(shí)IL-6水平較對(duì)照組升高（P＜0.05）（表2）。TNFα的濃度呈現(xiàn)先下降后升高趨勢(shì)，在濃度為10 μg/mL 時(shí)，下降顯著（圖6）。

2.6 M2/M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子比值 將未予外泌體刺激的巨噬細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，對(duì)M2/M1型巨噬細(xì)胞的比值進(jìn)一步行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，濃度為10 μg/mL 刺激72 h后，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子占比顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.000 1），再增加外泌體濃度時(shí)，其比值出現(xiàn)下降趨勢(shì)（表3，圖7）。

3 討論

1983年，Pan和Johnstone兩位學(xué)者在實(shí)驗(yàn)時(shí)意外發(fā)現(xiàn)了直徑30～150 nm 的小囊泡［13］，以此開(kāi)啟了外泌體世界的大門(mén)。從最初被視為細(xì)胞排出廢物的途徑［14］，到Raposo等［15］在1996年，提出外泌體參與抗原呈遞和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，促使其重新受到研究者們的關(guān)注。近年來(lái)，已證實(shí)寄生蟲(chóng)也能分泌外泌體或者刺激宿主細(xì)胞分泌外泌體［9，16-17］，與宿主細(xì)胞進(jìn)行交流，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種病理生理反應(yīng)，對(duì)寄生蟲(chóng)的致病力、繁殖力以及免疫逃逸等均產(chǎn)生重要作用。巨噬細(xì)胞因極高的可塑性和異質(zhì)性而被視為免疫系統(tǒng)的精靈，起初以原始巨噬細(xì)胞（M0型）處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到外界不同環(huán)境因素誘導(dǎo)時(shí)，引起表型和功能的變化，稱(chēng)為巨噬細(xì)胞極化［18］。其中M1型和M2型功能迥異，在不同環(huán)境下相互轉(zhuǎn)化、相互制衡。

有研究［19］證實(shí)，AE患者在行肝臟切除手術(shù)后，巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加，說(shuō)明巨噬細(xì)胞在AE的發(fā)展過(guò)程中起了作用。也有研究［20］表明，AE患者的肝組織和外周血中，M2/M1比值較健康人群明顯升高。課題組在前期研究［21］中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多房棘球蚴感染小鼠后，宿主可分泌IL-6、TNFα等炎性細(xì)胞因子，上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，幫助宿主清除病原體；同時(shí)，感染多房棘球蚴小鼠的巨噬細(xì)胞也可向M2型極化，再次證實(shí)多房棘球蚴致病過(guò)程中存在巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，使其逃避機(jī)體內(nèi)免疫殺傷作用，繼而發(fā)生一系列病理?yè)p傷。然而，在AE致病過(guò)程中，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的物質(zhì)尚不明確。前期在AE患者外周血、病灶囊液中分離獲得外泌體發(fā)現(xiàn)，從病灶囊液上清中提取的外泌體蛋白含量顯著高于外周血；也在棘球蚴體外培養(yǎng)上清中分離得到外泌體，并發(fā)現(xiàn)外泌體相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)陽(yáng)性，故推測(cè)多房棘球蚴分泌的外泌體在感染機(jī)體和在發(fā)生免疫逃逸的過(guò)程中可能扮演重要角色。

本研究通過(guò)構(gòu)建多房棘球蚴腹腔感染小鼠模型，將7.0T MRI掃描應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)了解模型鼠腹腔病灶生長(zhǎng)情況后，適時(shí)提取多房棘球蚴原頭節(jié)，用無(wú)外泌體的胎牛血清培養(yǎng)原頭節(jié)并分離上清，成功獲取并鑒定多房棘球蚴源性外泌體。在后續(xù)進(jìn)行外泌體與巨噬細(xì)胞分組共培養(yǎng)時(shí)，觀察到巨噬細(xì)胞發(fā)生形態(tài)的變化，提示外泌體使巨噬細(xì)胞發(fā)生極化。再利用流式細(xì)胞技術(shù)和ELISA分別檢測(cè)M1和M2型相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明多房棘球蚴源性外泌體可使巨噬細(xì)胞發(fā)生M1及M2樣極化，這與前期研究結(jié)果相一致，即感染多房棘球蚴小鼠病灶中出現(xiàn) M1型和M2型巨噬細(xì)胞雙重浸潤(rùn)。通過(guò)進(jìn)一步觀察，當(dāng)外泌體濃度為10 μg/mL培養(yǎng)72 h后，M1型巨噬細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞因子TNFα明顯下降，同時(shí)，M2型巨噬細(xì)胞有關(guān)表面分子CD206及CD369表達(dá)水平顯著增加（P值均＜0.05），這表明多房棘球蚴源性外泌體使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。隨后又進(jìn)行 M2/M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)表面分子比值分析，結(jié)果顯示以外泌體濃度為10 μg/mL時(shí)培養(yǎng)72 h，與對(duì)照組相比，CD369/（CD16/32）和CD206/（CD16/32）的比值明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.000 1），而且隨著外泌體濃度的增加，M2/M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的比值呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明外泌體濃度為10 μg/mL 時(shí)，M2 型巨噬細(xì)胞明顯增多。因此，體外研究實(shí)驗(yàn)認(rèn)為多房棘球蚴源性外泌體在濃度為10 μg/mL時(shí)是促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化最佳濃度。

綜上所述，在多房棘球蚴感染過(guò)程中，存在巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換；而本研究肯定了多房棘球蚴源性外泌體在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；當(dāng)外泌體濃度為10 μg/mL，共培養(yǎng)72 h后能有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，這可能是多房棘球蚴通過(guò)重塑宿主免疫狀態(tài)，幫助多房棘球蚴逃脫宿主免疫殺傷作用的新機(jī)制。但外泌體中何種物質(zhì)以及通過(guò)何種信號(hào)通路發(fā)揮作用，還需在此基礎(chǔ)上結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)及蛋白組學(xué)等方面的研究，進(jìn)而闡明AE致病過(guò)程中，宿主-宿主、宿主-寄生蟲(chóng)間復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，尋找新型治療靶點(diǎn)，為AE診斷的新型生物標(biāo)志物、臨床藥物開(kāi)發(fā)研究方面奠定基礎(chǔ)。

倫理學(xué)聲明：本研究于2019年7月3日經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會(huì)審批，批號(hào)為P-SL-2019042，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：冶賡博、陳功富負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)論文；黃登亮、崔紫煙、吳俊杰負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，數(shù)據(jù)整理；孔繁玉、于文昊、尹鳳嬌查閱文獻(xiàn)，分析數(shù)據(jù)；任利、樊海寧、王志鑫負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫(xiě)論文并最后定稿。

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收稿日期：

2022-09-27；錄用日期：2022-11-22

本文編輯：林姣