微藻育種方法研究進展

周琳琳，郭辰濤，鐘晨輝，林 琪*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.上海海洋大學，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；3.海洋生物種業(yè)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361013)

微藻是一類光合效率高、生長速度快的自養(yǎng)型生物，細胞結(jié)構(gòu)為單細胞，通常以二分裂方式增殖，且細胞周期短，具有易培養(yǎng)、適應(yīng)性強等特點[1-2]。微藻可以利用簡單的元素合成具有獨特結(jié)構(gòu)和生理功能的生物活性物質(zhì)，在人類生產(chǎn)與生活中，引起了廣泛的關(guān)注[3]。作為初級生產(chǎn)者，微藻不僅能將無機環(huán)境中的物質(zhì)能量同化吸收，促進生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)，同時還能伴隨產(chǎn)生油脂、蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸等多種活性物質(zhì)[4-5]?；谖⒃遄陨淼奶攸c，其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用廣泛分布在生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域中。在農(nóng)業(yè)方面，因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，微藻常作為魚類、貝類的優(yōu)質(zhì)飼料[6]。在生態(tài)環(huán)境方面，微藻能夠利用水中的有機物，包括碳、氮、磷等，并釋放溶解氧到水體中，因此其也常被用于廢水處理，包括生活廢水、工業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水[7]。同樣，微藻在生物能源及食品藥品等領(lǐng)域也備受關(guān)注。由于化石燃料的局限性，微藻作為第三、第四代生物燃料的生產(chǎn)生物已成為當下的一個研究熱門，小球藻[8]、微擬球藻[9]在生物柴油制備方面應(yīng)用較多。在食品藥品方面，螺旋藻[10-11]、裂殖壺藻[12]、雨生紅球藻[13]等含有的生物活性物質(zhì)也常被用于開發(fā)食品、藥品和保健品等。

微藻的育種經(jīng)歷了漫長的發(fā)展過程，最早可以追溯到1957年的稱重法，這是自然分離選育的一種方法，Moazami N等[14]用此方法篩選得到了2株高油脂含量的微藻。自然分離選育還包括平板劃線法、稀釋法、微吸管法和 96 孔板法等。但是傳統(tǒng)自然選育周期長，同時伴隨著選育品質(zhì)性狀不穩(wěn)定、生物質(zhì)產(chǎn)量低等缺點，限制了微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展[15]，因此將一些新興的技術(shù)手段用于微藻種質(zhì)資源的創(chuàng)新，對微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有深遠的意義。本文綜述了不同方法在微藻育種領(lǐng)域的研究成果，并分析了其存在的優(yōu)勢和不足，以期為后續(xù)的微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究提供參考。

1 微藻育種的應(yīng)用

微藻雖然含有許多高附加值的產(chǎn)品，如油脂、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)、蝦青素等，但原始藻株的生產(chǎn)能力有限，因此提高微藻的油脂含量、生長速度、光合作用效率等性狀對于推動微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展是十分必要的。隨著育種技術(shù)應(yīng)用于微藻，目前已經(jīng)選育出許多性狀優(yōu)良的突變藻株，并且被廣泛應(yīng)用在生產(chǎn)和生活中。

1.1 水產(chǎn)飼料

微藻含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)元素以及各類生物活性物質(zhì)，可以滿足水產(chǎn)動物的營養(yǎng)需求，能有效促進水產(chǎn)動物的生長發(fā)育，提高抗逆能力[16]。但微藻生物量、生長速度、環(huán)境適應(yīng)能力等都存在局限性，因此選育出生物量高、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強的藻株成為了飼料微藻的選育目標之一。已有相關(guān)研究報道，如夏金蘭等[17]通過紫外線誘變小球藻獲得了1株耐高溫的突變藻株，這使小球藻最適生長溫度提高到了35℃；Ong S C等[18]通過甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)溶液誘變小球藻，使小球藻的生長溫度提高到了40℃。

1.2 修復(fù)水環(huán)境

近年來，隨著“綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖”理念的提出，日益突出的環(huán)境問題也被提上了議程。作為微生物一類，微藻被認為是天然的凈化者[19]，自1957年，利用微藻去除水體中的氮、磷等營養(yǎng)鹽這一觀點被Oswald W J等[20]提出來之后，有研究發(fā)現(xiàn)，小球藻對水體中氮和磷的去除率分別可達86%和78%[21-22]，此外，Rugnini L等[23]利用小球藻和鏈帶藻去除水介質(zhì)中重金屬Cu和Ni，在混合金屬溶液中的去除率分別達到了95%和90%。

1.3 碳中和

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，二氧化碳的排放量逐年增加，對自然環(huán)境造成了嚴重的影響[24]。微藻通過光合作用，可以將大氣中CO2轉(zhuǎn)化為有機物，從而實現(xiàn)碳中和。越來越多的科學家發(fā)現(xiàn)，藻類的CO2固定率大約為12%，利用藻類捕獲和固定環(huán)境中的CO2是一種安全有效的方式[25]，因此提高CO2的固定率成為微藻育種的目的之一。Zhu Y等[26]采用60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻獲得的突變株對CO2的固定率提高了22.4%；Yang B等[27]通過過表達小球藻的果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(Fructose-1，6-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA)，使得細胞固定二氧化碳的效率提高了24.7%。

1.4 生物柴油

生物柴油作為一種清潔能源越來越受到人們的重視。微藻能夠在有機物和CO2存在的情況下生產(chǎn)脂質(zhì)，并且微藻細胞產(chǎn)生的脂質(zhì)的性質(zhì)與柴油相似，因此可以將微藻用于生物柴油的制備[28]。但由于微藻細胞個體小，油脂含量低，以小球藻為例，小球藻細胞大小為3～8 μm，油脂含量占細胞干重的20%[29]，相對于人類的生產(chǎn)活動是遠遠不夠的，因此培育出高油脂含量的藻株是微藻育種的主要目標之一。盡管通過藻類制備生物柴油還處于初級階段，同時生產(chǎn)成本高昂，導(dǎo)致其無法與化石能源競爭，但微藻生物柴油仍然是未來生物能源主要的來源之一[30]。

1.5 活性物質(zhì)

微藻中含有的生物活性物質(zhì)也常被添加于食品、保健品、藥品等產(chǎn)品中。微藻中含有的不飽和脂肪酸，主要包括EPA和 DHA。其中，EPA可以調(diào)節(jié)血脂，保護心腦血管，常用作為老年人保健品的重要添加物；DHA除了有保護心腦血管的作用，還是大腦成長，發(fā)育的重要物質(zhì)，常被用于嬰幼兒食品[31-32]。螺旋藻含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素等，具有提高人體免疫力、抗衰老等作用[10]，因此也常被用于保健品。蝦青素作為一種抗氧化劑，也用來作為食品、保健品以及生物飼料的重要添加物。雨生紅球藻中蝦青素的含量為1.5%～10.0%，被稱為天然蝦青素的“濃縮品”，因此雨生紅球藻已成為提取蝦青素的主要微藻[33-34]。

2 微藻育種方法

目前，常見的微藻育種方法主要包括2種：誘變育種和新興的分子育種。誘變育種是指通過物理、化學或者二者相結(jié)合的方式處理藻細胞，造成遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，再通過定向的篩選、培育，來獲得目的性狀優(yōu)良的目標藻株[35]。分子育種是指將分子生物學技術(shù)應(yīng)用于育種，主要在分子水平上對基因進行改造，從而改變性狀。分子育種能夠定向地控制基因表達，它可以實現(xiàn)微藻育種的定點突變，彌補誘變育種的不定向性[16]。

2.1 物理誘變

物理誘變主要用α射線、β射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發(fā)變異，引起分子結(jié)構(gòu)改變，誘發(fā)染色體異位、缺失、重組或斷裂等，從而引起后代性狀產(chǎn)生變異[36]。常用的物理誘變主要包括紫外線(Ultraviolet ray，UV)、射線、重離子束(Linear energy transfer，LET)、常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、激光、超聲波和太空射線[35]。

2.1.1 紫外誘變

紫外誘變是通過UV照射藻類細胞DNA，導(dǎo)致藻細胞DNA雙鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)變異，堿基錯配，從而形成突變體[15]。紫外誘變操作簡便易上手，因此其在微藻誘變中被廣泛應(yīng)用。

通過UV照射藻細胞時，功率范圍一般為10～30 W、照射距離為10～40 cm、輻射時間選取在30～900 s之間，并且在致死率為80%～95%的范圍內(nèi)選取突變株。目前，通過紫外誘變已經(jīng)選育出油脂含量高、DHA含量高的微藻[12，37-39]，

具體情況見表1。

表1 紫外誘變在微藻育種中的研究成果Tab.1 Research results of UV mutagenesis in microalgae breeding

2.1.2 射線誘變

射線包括X射線、γ射線、α射線、β射線等，是一種能量高、穿透力強的電離輻射源。射線誘變是指輻射造成DNA分子共價鍵斷裂或者分子缺失，當修復(fù)出錯時造成突變，進而獲得突變體[40]。γ射線相對于其他射線具有更強的穿透力，可誘變藻株產(chǎn)生多種活性代謝物，如酶和維生素等[41-42]。目前在微藻的育種中多使用60Co-γ誘變原始藻株，射線的誘變劑量一般為100～1 600 Gy，獲得的突變株的油脂含量有較大幅度的提高[43-45]，具體見表2。

表2 60Co-γ射線誘變選育高油脂藻株研究成果Tab.2 Results of 60Co-γ ray mutagenesis and breeding of high lipid algae

2.1.3 重離子束誘變

離子輻射源包括質(zhì)子、氦和帶正電的重離子等，長期以來被用作微生物和植物育種的誘變劑[46]。其中使用較多的是重離子，而LET是指被剝掉或部分剝掉外圍電子后的帶正電的原子核通過大型加速器裝置加速而形成的具有能量的射線。相較于傳統(tǒng)的誘變源，LET具有傳能線密度大、相對生物學效應(yīng)高、損傷后修復(fù)效應(yīng)小、能量沉積的空間分辨性好等生物學優(yōu)勢[47]。目前，誘變實驗中使用較多的LET主要是碳離子束，使用的碳離子的能量為80 MeV/μ，密度為31 keV/μm，誘變劑量通常在10～160 Gy之間，并且獲得了性狀優(yōu)良的藻株[9，48-50]，具體見表3。

表3 重離子束誘變育種的研究成果Tab.3 Research results of heavy ion beam mutagenesis breeding

2.1.4 常壓室溫等離子體誘變

ARTP 誘變是通過釋放活性粒子，作用于微生物的細胞壁或細胞膜，使其結(jié)構(gòu)和通透性發(fā)生變化，引起基因損傷，致使突變，從而獲得性狀優(yōu)良的藻株。相較于其他誘變方法，ARTP誘變具有高效、穩(wěn)定、無毒、環(huán)保、成本低等優(yōu)點[51]。

采用ARTP誘變時，一般是在功率為80～120 W、通氣量為10 ～12 SLM、距離為2～5 mm的條件下進行的，誘變時間選取在10～150 s之間。利用ARTP選育出的突變株性狀優(yōu)良，表現(xiàn)在油脂含量高、蝦青素含量高等[52-55]，具體見表4。

表4 ARTP在微藻育種中的研究成果Tab.4 Research results of ARTP in microalgae breeding

2.2 化學誘變

化學誘變是指使用一些導(dǎo)致基因突變的化學誘變劑，使遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，從而獲得性狀優(yōu)良的突變株。在生物育種中，化學誘變對于獲得優(yōu)良性狀的誘變體是一個高效且簡單的方法，這是因為化學誘變能夠在DNA非致死點反復(fù)誘變，由此可產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)[56-57]。目前常用的化學誘變劑主要是烷化劑，包括EMS、亞硝基胍(Nitrosoguanidine，NTG)、硫酸二乙酯(Diethylsulfate，DES)等。化學誘變對基因的損害較小，具有特異性，并且具有操作簡單、成本低、突變范圍廣等優(yōu)點，在誘變育種中被廣泛使用。近年來，化學誘變在寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、雨生紅球藻(Haematococcupluvialis)、柵藻(Desmodesmussp.)等均獲得突變株[56-59]。

使用化學誘變劑誘變微藻時，采用較多的方法是在固定的時間內(nèi)，采用不同濃度的誘變劑[58-61]進行實驗，這有利于縮短實驗時長。如NTG誘變微藻，NTG的濃度范圍一般在1～5 g/mL之間，誘變時間通常設(shè)定為10～60 min。具體見表5。

表5 不同化學試劑誘變微藻研究成果Tab.5 Research results of mutagenesis of microalgae by different chemical reagents

2.3 分子育種

分子育種，是一種新興的手段，包括基因工程育種和基因編輯育種?；蚬こ逃N，也被稱為轉(zhuǎn)基因育種，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)，使之能在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達，以改變生物原有的遺傳特性獲得新品種。當前，外源基因?qū)爰毎麅?nèi)的技術(shù)主要包括電轉(zhuǎn)法、微粒轟擊法(基因槍法)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、玻璃珠攪拌法、自然轉(zhuǎn)化法、細菌接合法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[62]。近年來，Crispr/cas9等基因編輯育種技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于微藻[63]，與基因工程育種不同的是，基因編輯是對特定基因進行修飾，沒有外源基因的導(dǎo)入。這2種新興的育種方式具有針對性強、穩(wěn)定性強的特點，能夠通過定向改造遺傳物質(zhì)獲得較理想的突變藻株[15]。

相對于傳統(tǒng)的育種技術(shù)，新興的微藻育種還處于初級階段。三角褐指藻作為模式生物，無論是基因工程，還是基因編輯技術(shù)，都有廣泛的應(yīng)用，在微藻育種中的主要目標產(chǎn)物為脂質(zhì)、甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)等[63-67]，具體見表6。

表6 分子育種在微藻育種中的研究成果Tab.6 Research results of molecular breeding in microalgae breeding

3 微藻育種存在的問題及解決方法

雖然微藻育種技術(shù)已經(jīng)發(fā)展多年，但微藻育種仍然處于一個發(fā)展階段，并存在以下幾個問題：1)產(chǎn)量和品質(zhì)互相矛盾。在藻類育種的過程中，篩選得到生產(chǎn)率高、性狀優(yōu)良的品種是最理想的結(jié)果。但實際情況中，產(chǎn)量和品質(zhì)卻很少能同時提高，研究發(fā)現(xiàn)這可能是控制品質(zhì)和產(chǎn)量的基因是相互連鎖的，提高一種性狀的基因表達會影響其他基因的表達，很難一起提高，甚至產(chǎn)生抑制作用，這是因為微藻是單細胞生物，其繁殖體系使基因間的連鎖難以打破[68]。2)誘變因子及誘變劑量難以精確控制。不同種類微藻誘變因子和誘變劑量是不同的，因此在育種時如何選擇誘變因子及誘變劑量是目前誘變育種的一大難題。研究發(fā)現(xiàn)，同一種類的微藻，不同的誘變因子均能篩選出性狀優(yōu)良的藻株。尤其是化學試劑的誘變劑量更加難以確定，化學誘變劑處理強度的衡量通常用暴露劑量，而不是吸收劑量，因為吸收劑量一般情況下無法確定，但對遺傳物質(zhì)產(chǎn)生作用的卻是吸收劑量，因此化學誘變中化學物質(zhì)的誘變劑量通常是一個估計值[69]。3)篩選難度大。誘變后的藻株樣本容量較大，但并非所有的誘變株都是符合誘變目的的藻株，因此需要對誘變后的藻株進行篩選，以獲得所需的藻株。另外，篩選出的藻株還需要連續(xù)培養(yǎng)幾代，確保遺傳物質(zhì)能夠穩(wěn)定遺傳。篩選出性狀優(yōu)良的藻株是一個費時費力的過程。

針對微藻育種技術(shù)存在的問題，可以從以下兩個方面解決：一方面，研究人員需要熟悉不同藻種的生理特性，選擇最適合的育種方法，或者還可以通過物理誘變和化學誘變相結(jié)合即復(fù)合誘變方法，從而選育出最佳的藻株；另一方面，微藻誘變育種與當前先進的基因工程相結(jié)合，如可以通過基因組重測序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)組分析等技術(shù)，從DNA、蛋白水平上揭示表型與基因型之間的聯(lián)系，掌握誘變作用機理，從而實現(xiàn)高效、定向誘變育種。

4 展望

不同的誘變方法有各自的優(yōu)劣勢。物理誘變方法操作簡單、易上手，也是目前使用最為廣泛的方法，但其設(shè)備要求高，前期投入成本較大；化學誘變方法彌補了物理誘變投入成本過高的不足，但化學試劑可能具有毒性，這加大了實驗操作的風險；基因工程育種相對前兩種方法，克服了誘變方向的隨機性，實現(xiàn)了定點誘變，但我國目前與基因工程育種相關(guān)的實驗做得相對較少，技術(shù)相對不成熟，并且基因工程目前還存在爭議，因此還需要進一步研究。

盡管我國微藻誘變育種仍處于初級階段，但近年來研究者們利用誘變方法仍然培育出了許多含油量高、生長速率快、生物量高的藻株，這為未來優(yōu)化選育技術(shù)和提高藻株性狀奠定了堅實的基礎(chǔ)。此外，可將微藻育種與實際生產(chǎn)結(jié)合起來，根據(jù)實際需求動態(tài)地調(diào)整目標，促進微藻的可持續(xù)發(fā)展。通過誘變方法選育性狀優(yōu)良的藻株，提高微藻自身含有的天然高附加值產(chǎn)物含量，推動微藻育種的高效發(fā)展，為微藻產(chǎn)業(yè)鏈帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。