竹葉花椒黃酮粗提液純化工藝及抗氧化性研究

周孟焦，何鑫柱, ，李朝俊, ，梁曉峰,

1. 四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校川西北中藥材資源研究與開發(fā)利用實(shí)驗(yàn)室（綿陽 621010）；2. 西南科技大學(xué)材料與化學(xué)學(xué)院（綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC），長期以來被認(rèn)為是花椒的野生品種，與花椒相比，具有更多的風(fēng)味成分，其活性成分豐富，藥理作用廣泛，可直接食用或以調(diào)料入味，或用于醫(yī)藥行業(yè)，隨著竹葉花椒種植面積的不斷增加，迫切需要拓寬竹葉花椒在其他行業(yè)的應(yīng)用[1-4]。研究表明，竹葉花椒果皮中含有豐富的活性物質(zhì)，黃酮含量在竹葉花椒活性物質(zhì)中占比大，具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抗衰老[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等多種藥理作用。從竹葉花椒中提取天然黃酮類化合物有助于提高對(duì)其藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)，對(duì)高效開發(fā)竹葉花椒資源的轉(zhuǎn)化利用具有重要意義。

聚酰胺樹脂和大孔吸附樹脂被廣泛應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的純化精制。聚酰胺樹脂富含酰胺基團(tuán)，分離和脫色效果好。大孔吸附樹脂為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定、吸附容量大。二者吸附機(jī)理決定其對(duì)活性物質(zhì)的純化方面存在差異，將其聯(lián)用可充分發(fā)揮兩者優(yōu)勢，提供一種高效的純化方法[9-12]。

試驗(yàn)以蘆丁為對(duì)照品，利用分光光度法測定純化后樣品的總黃酮含量；研究聚酰胺和大孔吸附樹脂對(duì)竹葉花椒黃酮的吸附和解吸能力，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化聚酰胺-大孔吸附樹脂聯(lián)用純化黃酮的工藝參數(shù)，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為竹葉花椒黃酮的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉花椒（產(chǎn)地四川綿陽，干燥備用）。

蘆?。ㄉ虾０⒗∩萍脊煞萦邢薰荆?；聚酰胺（0.250~0.600 mm，即30~60目，D101大孔吸附樹脂，上海麥克林生化科技股份有限公司）；無水乙醇（分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-MC-1型實(shí)驗(yàn)室微波合成儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；BSA124S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；UV-315紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 竹葉花椒黃酮粗提液的制備

取適量干燥竹葉花椒，乙醇溶液為提取溶劑，放入實(shí)驗(yàn)室微波合成儀中，設(shè)置提取條件，石油醚除去脂溶性雜質(zhì)，即得竹葉花椒粗提液。

精密量取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL 0.2 mg/mL的蘆丁溶液于7支試管中，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]，在510 nm處對(duì)竹葉花椒提取物含量進(jìn)行測定。得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程A=0.79C+ 0.001 57，R2=0.999 6。

1.3.2 樹脂預(yù)處理

1.3.2.1 聚酰胺預(yù)處理

將聚酰胺在95%乙醇中攪拌10 h，洗去乙醇后在5 mol/L氫氧化鈉中攪拌5 h，水洗至流出液pH 7，在5 mol/L醋酸溶液中攪拌5 h，水洗至流出液pH 7[14]。

1.3.2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理

將大孔吸附樹脂在95%乙醇攪拌24 h，洗去乙醇后在5%氫氧化鈉溶液中攪拌24 h，水洗至流出液pH 7，經(jīng)5%鹽酸溶液攪拌24 h，水洗至流出液pH 7[15]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在層析柱中加入一定比例的聚酰胺和大孔吸附樹脂，以蒸餾水為填充溶劑，精密量取一定濃度的竹葉花椒黃酮提取液加入層析柱中，水洗，以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇為洗脫液，設(shè)置洗脫條件，收集洗脫液，測定流出液吸光度，計(jì)算黃酮濃度，按（1）和（2）計(jì)算樹脂的吸附率和解吸率。

式中：Q為樹脂吸附量，mg/g；C0為竹葉花椒黃酮粗提液質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為經(jīng)樹脂吸附后乙醇中黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；M為樹脂質(zhì)量，g；C2為乙醇溶液中竹葉花椒黃酮濃度，mg/mL；V1為乙醇溶液體積，mL。

聚酰胺-大孔吸附樹脂聯(lián)用法的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 單因素試驗(yàn)條件

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面因素水平表

1.3.5 竹葉花椒黃酮體外抗氧化活性研究

按文獻(xiàn)[3]的方法，以蘆丁和維生素C為陽性對(duì)照，取2 mL不同濃度的竹葉花椒黃酮提取液和2 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液，混勻，黑暗下反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度；以蘆丁和維生素C為陽性對(duì)照，取2 mL不同濃度的竹葉花椒黃酮提取液和2 mL ABTS溶液，混勻，靜置6 min，在734 nm處測定吸光度。根據(jù)式（3）計(jì)算提取液對(duì)自由基清除率。

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mL自由基溶液的吸光度；A1為2 mL竹葉花椒提取液+2 mL自由基溶液的吸光度；A2為2 mL竹葉花椒提取液+2 mL無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮粗提液純化的單因素試驗(yàn)

2.1.1 聚酰胺與大孔吸附樹脂用量比的選擇

由表3可知，由于聚酰胺與大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)存在差異，不同樹脂用量比對(duì)有效成分吸附具有影響，樹脂用量比3︰5（g/g）時(shí)，樹脂對(duì)總黃酮的吸附率最高。故選擇3︰5（g/g）為竹葉花椒富集純化的最佳樹脂用量比。

表3 聚酰胺與大孔吸附樹脂用量比對(duì)吸附率的影響

2.1.2 竹葉花椒黃酮粗提液的質(zhì)量濃度的選擇

由圖1可知：在1~6 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，吸附率上升較快，吸附率在上竹葉花椒黃酮粗提液質(zhì)量濃度達(dá)到6 mg/mL時(shí)，可達(dá)80.67%，濃度繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮在樹脂中的因黏度過大而擴(kuò)散緩慢，雜質(zhì)在樹脂上的吸附增加，同時(shí)也會(huì)超過樹脂的飽和吸附量，使總黃酮得不到充分的吸收，而造成部分黃酮的損失。故選擇6 mg/mL為竹葉花椒黃酮粗提液富集純化的質(zhì)量濃度。

圖1 竹葉花椒黃酮粗提液的濃度對(duì)吸附率的影響

2.1.3 竹葉花椒黃酮粗提液流速的選擇

由圖2可知：竹葉花椒黃酮粗提液流速1.5 mL/min時(shí)，樹脂吸附率為78.41%，流速繼續(xù)增加時(shí)，樹脂吸附率反而降低。流速比較慢時(shí)，樹脂上的活性位點(diǎn)能充分吸附黃酮，但會(huì)降低樹脂的吸附效率。流速太快，總黃酮與樹脂表面活性部位相互作用時(shí)間過短，黃酮還未被樹脂充分吸附就會(huì)隨著溶液，造成損失。故選擇1.5 mL/min為竹葉花椒黃酮粗提液富集純化的流速。

圖2 竹葉花椒黃酮粗提液流速對(duì)吸附率的影響

2.1.4 樹脂洗脫溶劑的選擇

由圖3可知：樹脂洗脫溶劑濃度在20%~60%范圍內(nèi)，樹脂對(duì)黃酮的解吸率增加明顯，解吸率在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，可達(dá)86.67%，隨著濃度繼續(xù)增加，樹脂的解吸率開始降低?？赡苁且?yàn)橹袢~花椒黃酮粗提液為混合物，目標(biāo)物更多地溶于60%乙醇溶液而容易被洗脫下來，乙醇體積分?jǐn)?shù)再增加，雜質(zhì)在高體積分?jǐn)?shù)乙醇中溶解增加隨乙醇而流出，故選擇體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為竹葉花椒富集純化的洗脫溶劑。

圖3 樹脂洗脫溶劑濃度對(duì)解吸率的影響

2.1.5 乙醇溶液流速的選擇

由圖4可知：乙醇溶液流速在0.5~2 mL/min范圍內(nèi)，樹脂的解吸率比較穩(wěn)定，洗脫流速2 mL/min時(shí)，樹脂的解吸率可達(dá)77.66%，能將總黃酮較多地洗脫下來，洗脫流速大于2 mL/min，乙醇與黃酮接觸不充分就開始流出，大多數(shù)黃酮仍吸附在樹脂上，降低樹脂的洗脫率，故乙醇溶液流速選擇2 mL/min。

圖4 乙醇溶液流速對(duì)解吸率的影響

2.1.6 乙醇溶液收集量的選擇

由圖5可知：乙醇溶液收集量在2.5~4 BV范圍內(nèi)，樹脂解吸率隨收集量的增加而提高較快，收集量達(dá)到4 BV時(shí)，樹脂解吸率可達(dá)86.16%，超過4 BV時(shí)解吸率反而降低?？赡苁且?yàn)橄疵撘河昧枯^少時(shí)，不能將樹脂上的黃酮完全洗脫下來，收集量達(dá)到4 BV時(shí)，能較多地將黃酮洗脫下來，但乙醇溶液收集量再增加，會(huì)將雜質(zhì)一同洗出，同時(shí)也造成洗脫劑的浪費(fèi)，故乙醇溶液收集量選擇4 BV。

圖5 乙醇溶液收集量對(duì)解吸率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸分析

表4的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的回歸方程為：總黃酮含量Y=86.41-1.70A+1.04B-0.78C+0.26AB+0.56AC-0.052BC- 7.79A2-4.63B2-0.62C2。式中：Y為總黃酮含量；A為樹脂用量比，g/g；B為樹脂洗脫溶劑，mg/mL；C為乙醇溶液收集量，BV。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5可知：模型P＜0.001，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著，失擬項(xiàng)P=0.385 3，失擬項(xiàng)不顯著，模型的決定系數(shù)R2=0.994 8，說明方程回歸效果好，校正決定系數(shù)Radj2=0.988 2，表明模型是可靠的，用該模型分析和預(yù)測竹葉花椒總黃酮含量可靠。由F值判斷，3個(gè)因素影響竹葉花椒總黃酮含量的順序?yàn)锳（樹脂用量比）＞B（樹脂洗脫溶劑）＞C（乙醇溶液收集量）。

表5 方差分析

2.2.2 響應(yīng)面曲線分析

觀察響應(yīng)面可直觀得到變量間交互作用的顯著程度，由圖6可知，樹脂用量比和乙醇溶液收集量的交互作用對(duì)總黃酮含量的影響最大，樹脂用量比和樹脂洗脫溶劑的體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)總黃酮含量的影響次之，樹脂洗脫溶劑的體積分?jǐn)?shù)和乙醇溶液收集量的交互作用對(duì)總黃酮含量的影響最小。

圖6 兩因素交互作用對(duì)竹葉花椒總黃酮含量影響的響應(yīng)曲面（左）和等高線圖（右）

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

在PA與MAR用量比3︰5（g/g）、樹脂洗脫溶劑60%、乙醇溶液收集量4.5 BV、其他條件不變的條件下，設(shè)置3組平行試驗(yàn)，總黃酮平均含量為87.35%，含量基本穩(wěn)定，表明該回歸模型具有可靠性。

2.3 竹葉花椒黃酮體外抗氧化活性分析

由圖7可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，3種物質(zhì)清除自由基的能力與自身的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，樣品質(zhì)量濃度較低時(shí)對(duì)自由基的清除能力不明顯，隨著質(zhì)量濃度的增加，其所對(duì)應(yīng)的自由基清除能力也增加。在同一濃度下，各組分對(duì)自由基清除率的順序依次為維生素C＞純化黃酮＞未純化黃酮。由此可見竹葉花椒黃酮提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)。

圖7 竹葉花椒總黃酮對(duì)DPPH自由基（上）、ABTS自由基清除能力（下）

3 結(jié)論

確定以聚酰胺-大孔吸附樹脂聯(lián)用純化竹葉花椒黃酮粗提液的最佳工藝參數(shù)：聚酰胺與大孔吸附樹脂用量比3︰5（g/g）、竹葉花椒黃酮粗提液的質(zhì)量濃度6 mg/mL、竹葉花椒黃酮粗提液的流速1.5 mL/min、60%乙醇作為樹脂洗脫溶劑、乙醇溶液流速2 mL/min、乙醇溶液收集量4 BV，在此條件下總黃酮平均含量為87.35%。聚酰胺、大孔吸附樹脂聯(lián)用對(duì)竹葉花椒黃酮類物質(zhì)有較好的吸附和解吸作用，能夠明顯減少提取液中雜質(zhì)，使有效成分含量增多。竹葉花椒黃酮的抗氧化活性雖然低于維生素C，但在一定濃度下具有抗氧化活性，純化后黃酮抗氧化活性優(yōu)于純化前黃酮。后續(xù)將進(jìn)一步研究竹葉花椒黃酮相關(guān)指紋圖譜、抗氧化性能及其譜效關(guān)系，揭示影響其抗氧化性的分子機(jī)理，為竹葉花椒的綜合開發(fā)與利用提供理論支撐。