不同飼喂條件下蜂王漿品質(zhì)及抗氧化能力評(píng)價(jià)

喬棟 ，黎洪霞，劉肇龍，宋梅，龐杰，陳蘭珍

1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（福州 350002）；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所（北京 100093）

蜂王漿是年輕工蜂出生后第5天至第14天之間由咽下腺和下頜腺分泌的黃白色酸性物質(zhì)，用于喂養(yǎng)工蜂前三天的幼蟲和蜂后的一生[1]。蜂王漿富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[2]，大量相關(guān)研究表明蜂王漿具有抗氧化活性[3]、胰島素樣作用、改善糖尿病、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等功能特性。蜂王漿的內(nèi)在組分決定了生物活性功能[4]，但是蜂王漿的生產(chǎn)質(zhì)量受到多方面的影響，如蜂群群勢(shì)、足夠的食物供應(yīng)（包括蜂蜜和花粉）、適宜的溫度（20~30 ℃），以及良好的自然環(huán)境（無農(nóng)藥或微量農(nóng)藥）等。已有研究表明，蜜粉源的差異會(huì)影響蜂王漿質(zhì)量[5-6]。在外界蜜粉源缺乏時(shí)，為保證蜂王漿的持續(xù)性產(chǎn)出，蜂農(nóng)會(huì)進(jìn)行人工飼喂來補(bǔ)充蜂群生產(chǎn)必需的蛋白質(zhì)和糖分，但是在生產(chǎn)中添加人工飼料是一個(gè)有爭議的話題[7]。已有研究表明工蜂在不同采食下會(huì)影響蜂王漿產(chǎn)量，部分糖分發(fā)生變化，其次人工飼料可能會(huì)刺激下咽腺發(fā)育[8-10]。

對(duì)于飼喂產(chǎn)生的蜂王漿質(zhì)量仍沒有明確定論。此次研究通過比較工蜂采食天然蜜粉源、飼喂糖水和飼喂代花粉三種不同飼喂條件下蜂王漿的品質(zhì)差異，并通過體外抗氧化測(cè)定方法研究了不同蜂王漿的體外抗氧化活性差異，對(duì)不同飼喂條件下蜂王漿的質(zhì)量變化差異提供數(shù)據(jù)支撐，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蜂王漿提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

蜂王漿樣品均采集于湖北省鐘祥市，根據(jù)蜂群不同采食情況對(duì)所產(chǎn)蜂王漿進(jìn)行分類，即天然組和飼喂組，天然組指蜂王漿在生產(chǎn)過程中蜂群食物完全來自天然蜂蜜和蜂花粉，飼喂組指蜂王漿在生產(chǎn)過程中人為添加白糖水和代花粉飼喂蜂群。試驗(yàn)樣品有采食天然花粉和花蜜生產(chǎn)的蜂王漿（TRWJ）、采食天然花粉并人工飼喂白糖水生產(chǎn)的蜂王漿（WTWJ）和采食天然蜂蜜并人工飼喂代花粉生產(chǎn)的蜂王漿（WFWJ），三種類別蜂王漿共計(jì)76個(gè)樣品。樣品信息見表1，樣品采集完成后立即保存在-18 ℃冰箱中備用直到檢測(cè)。

表1 蜂王漿樣品采集信息

Biofuge離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；KQ218超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex Mixer QL-866渦旋混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；PX124ZH電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；Synergyneo2 Alpha酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；752紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司）。

牛血清白蛋白Ⅴ（北京索萊寶科技有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G250、維生素C、2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽、靛藍(lán)胭脂紅、乙酸鈉（上海源葉生物科技有限公司）；磷酸、苯酚（上海吉至生化科技有限公司）；濃硫酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；沒食子酸、水楊酸（河北百靈威超精細(xì)材料有限公司）；硫酸亞鐵（西隴科學(xué)股份有限公司）；30%過氧化氫、過硫酸鉀（福晨化學(xué)試劑有限公司）。

1.1 試驗(yàn)方法

1.1.1 水溶性蛋白含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11-12]方法，并略作修改。稱取0.1 g牛血清白蛋白溶解于純水定容至100 mL，梯度為0，40，80，120，160，180和200 μg/mL，各取0.2 mL不同質(zhì)量濃度稀釋液于1.5 mL試管中，加入1 mL考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)液，立即渦旋15 s，混勻后靜置5 min，在波長595 nm處測(cè)定吸光度，以牛血清蛋白系列濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=3.449x+0.661，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

稱取0.5 g蜂王漿定容10 mL純水中，渦旋2 min，4 ℃下超聲10 min，12 000 r/min下離心20 min，取上清液并將上清液進(jìn)行稀釋，取50 μL加入950 μL純水渦旋混勻待測(cè)。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法對(duì)樣品測(cè)定水溶性蛋白含量，將測(cè)定的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其含量。

1.1.2 總糖含量測(cè)定

參考方法[13-14]進(jìn)行改進(jìn)。稱取50 mg葡萄糖溶于純水并定容至50 mL，配制梯度濃度為0，80，160，240，320和400 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制80%苯酚作為儲(chǔ)備液，使用前稀釋成5%苯酚工作液，在具塞試管中依次加入0.2 mL不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.2 mL 5%苯酚，再迅速加入1 mL濃硫酸，渦旋使其充分混勻，靜置10 min，在波長490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.006x+0.063 6，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999。

稱取0.5 g蜂王漿定容于10 mL去離子水，渦旋混勻后超聲10 min，12 000 r/min下離心20 min，取上清液稀釋20倍，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，將吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量。

1.1.3 葡萄糖氧化酶測(cè)定

參考權(quán)淑靜等[15]，采用褪色光度法，并略作改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL過氧化氫工作液于具塞比色管，依次加入0.3 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和0.26 mL靛藍(lán)胭脂紅溶液，補(bǔ)水至總體系為5 mL，混勻后置于100 ℃沸水中加熱13 min，取出后用冰水冷卻3~5 min，終止反應(yīng)，在波長612 nm處用蒸餾水做參比，測(cè)定其吸光度。以過氧化氫溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-0.360 4x+0.847，相關(guān)系數(shù)R2=0.990。將蜂王漿樣品上清液稀釋為25 mg/mL，取0.4 mL于具塞試管中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中加熱孵育30 min，取出后按照上述操作過程，依次加入工作液，計(jì)算產(chǎn)生過氧化氫的含量，計(jì)算葡萄糖氧化酶的活性。酶活力單位規(guī)定為：37 ℃條件下，1 min內(nèi)催化葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生1 μg過氧化氫所需的酶量為1 U。

1.1.4 總酚酸測(cè)定

參考Balkanska等[16]方法。稱取50 mg沒食子酸溶于乙醇中定容于50 mL容量瓶，配成1 000 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液用純水稀釋成0，10，20，40，60，80和100 μg/mL質(zhì)量濃度梯度，取0.2 mL不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品于試管中，依次加入0.2 mL 1 mol/L福林酚顯色液和1 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液，用水補(bǔ)至3 mL，混勻后靜置避光反應(yīng)30 min時(shí)，在波長760 nm處測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.006 8x+0.066 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

配制100 mg/mL蜂王漿溶液樣品并稀釋成20 mg/mL，按照標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)過程依次添加反應(yīng)溶劑，反應(yīng)后上機(jī)檢測(cè)吸光度。

1.1.5 蜂王漿抗氧化活性

1.1.5.1 總抗氧化能力測(cè)定

總抗氧化能力測(cè)定方法采用ABTS自由基清除率法[17]。配制7 mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液，取等體積溶液于黑暗中反應(yīng)12~16 h，得ABTS反應(yīng)液（ABTS+·），反應(yīng)液以1∶45體積比用去離子水稀釋至在734 nm下吸光度為0.70±0.02。以維生素C為當(dāng)量并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，維生素C質(zhì)量濃度梯度為0，10，20，40，60和80 μg/mL，取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入200 μL反應(yīng)液避光反應(yīng)8 min，在波長734 nm處測(cè)定吸光度。配制100 mg/mL樣品，按照上述操作方法進(jìn)行反應(yīng)，避光反應(yīng)8 min后測(cè)定蜂王漿樣品吸光度，抗氧化能力以VC當(dāng)量表示。

1.1.5.2 羥基自由基·OH清除率

參考湯興楠等[18]方法配制9.0 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L的過氧化氫儲(chǔ)備溶液。操作過程：配制VC標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，稱取1.0 g維生素C定容于50 mL容量瓶，稀釋成0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和0.9 mg/mL質(zhì)量濃度梯度，選擇10 mL試管依次加入0.5 mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、適量水、0.5 mL的9 mmol/L硫酸亞鐵和0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入0.5 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液，混勻后在37 ℃水浴靜置30 min，在波長510 nm處測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，反應(yīng)重復(fù)測(cè)定3次。清除率根據(jù)式（1）計(jì)算，反應(yīng)溶劑添加劑量如表2所示。

表2 反應(yīng)溶劑添加劑量

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為蜂王漿樣品的吸光度；A2為未加反應(yīng)液的吸光度。

1.2 數(shù)據(jù)處理

獲得數(shù)據(jù)通過SPSS 24.0軟件做單因素方差分析（One-way ANOVA）和相關(guān)性分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異，利用Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼喂條件對(duì)蜂王漿成分影響

蜂王漿中的主蛋白（MRJPS）為水溶性蛋白質(zhì)，目前已經(jīng)鑒定出9種不同蛋白質(zhì)（MRJP1~MRJP9），研究表明蜂王漿水溶性蛋白質(zhì)具有多種生物活性功能[19]。水溶性蛋白是由工蜂的咽下腺和上顎腺分泌，而蜜蜂發(fā)育和分泌蜂王漿所需的蛋白質(zhì)、能量來源于外界花粉，已有研究表明蜜蜂食用不同蜂花粉會(huì)顯著影響主蛋白基因表達(dá)[20]。試驗(yàn)探究了不同飼喂條件對(duì)工蜂分泌蜂王漿水溶性蛋白的影響，結(jié)果如表3所示。天然組、飼喂糖水和代花粉三組的水溶性蛋白含量在54.85~59.48 mg/g之間，飼喂代花粉組水溶性蛋白含量最高，為59.48 mg/g，與WTWJ組存在極顯著性差異（P＜ 0.01），表明飼喂代花粉相比飼喂糖水能夠顯著提高水溶性蛋白含量。TRWJ與WTWJ之間存在極顯著差異（P＜0.01），說明采食天然花粉花蜜生產(chǎn)蜂王漿水溶性蛋白含量優(yōu)于飼喂糖水生產(chǎn)的蜂王漿。TRWJ與WFWJ之間不存在顯著性差異，與天然蜜粉源相比較飼喂代花粉不會(huì)影響水溶性蛋白含量。

表3 不同飼喂條件所產(chǎn)蜂王漿組分含量

工蜂咽下腺是分泌蜂王漿的主要器官之一，有研究表明不同食料會(huì)改變工蜂咽下腺的腺泡表面積，對(duì)工蜂的生長發(fā)育和蜂王漿的生產(chǎn)有一定的影響[21]。蜜蜂營養(yǎng)缺乏會(huì)對(duì)工蜂下頜腺的合成能力有顯著的負(fù)面影響[22]。以上結(jié)果表明飼喂白糖后對(duì)工蜂分泌蛋白產(chǎn)生影響導(dǎo)致含量降低。因?yàn)榘被崾堑鞍踪|(zhì)基本組成成分，其濃度變化可以反映蜂王漿蛋白質(zhì)含量變化[23]，有研究證實(shí)分別喂食工蜂蜂蜜和白糖會(huì)導(dǎo)致蜂王漿氨基酸含量存在顯著差異且蜂蜜組含量優(yōu)于白糖組[24]，與此次研究結(jié)果相似，喂食白糖組蜂王漿水溶性蛋白含量最低，表明飼喂條件不同是導(dǎo)致水溶性蛋白含量差異的重要原因。

糖類占蜂王漿的7.5%~15%，葡萄糖和果糖約占總糖90%，此外還有其他少量的糖，如蔗糖、麥芽糖和海藻糖等[25]。如表3所示，蜂王漿總糖含量在110.50~ 112.69 mg/g之間，TRWJ、WTWJ和WFWJ三組之間不存在顯著性差異，而且WTWJ含量略低于TRWJ，表明飼喂糖水不會(huì)導(dǎo)致蜂王漿總糖含量升高。研究結(jié)果表明不同飼喂條件不會(huì)影響蜂王漿總糖的含量。

葡萄糖氧化酶是蜜蜂咽下腺分泌的一種酶，參與D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過氧化氫，在冷凍條件下其活性保持穩(wěn)定[26]。如表3所示，不同蜂王漿葡萄糖氧化酶活性在1 022.24~1 092.70 U/（g·0.5 h）之間，天然組、喂糖和喂代花粉組內(nèi)無明顯差異，表明不同飼喂條件不會(huì)影響葡萄糖氧化酶活性。此外，通過表3數(shù)據(jù)看出三組蜂王漿的總糖與葡萄糖氧化酶含量無顯著性差異，但含量存在相反的趨勢(shì)。有研究表明葡萄糖氧化酶活性受到底物葡萄糖的影響產(chǎn)生底物抑制[27]，并且葡萄糖氧化酶通過化學(xué)反應(yīng)會(huì)消耗葡萄糖產(chǎn)生過氧化氫，使蜂王漿中葡萄糖含量下降，說明葡萄糖氧化酶含量可能與蜂王漿中總糖含量存在一定關(guān)聯(lián)性。

如表3所示：不同蜂王漿總酚酸含量差異不明顯，平均含量在3.18~3.23 mg/g之間，與Nabas等[28]測(cè)定結(jié)果相符合，天然組、喂糖和喂代花粉組內(nèi)無明顯差異，說明不同飼喂條件不會(huì)顯著影響總酚酸的含量。

2.2 不同飼喂條件對(duì)蜂王漿體外抗氧化活性影響

如圖1所示：蜂王漿總抗氧化能力以VC當(dāng)量表示，在1.91~2.28 mg/g之間，羥自由基清除率在60.81%~ 62.26%之間，WFWJ的總抗氧化能力最高，VC當(dāng)量為2.28 mg/g，與TRWJ存在極顯著性差異（P＜0.01），與WTWJ之間無顯著性差異。結(jié)果表明人工飼喂代花粉生產(chǎn)的蜂王漿其體外總抗氧化能力均高于喂糖和天然蜜粉源生產(chǎn)的蜂王漿，而喂食糖水與天然蜜粉源生產(chǎn)的蜂王漿相比其體外總抗氧化能力有略微升高，但無顯著性差異。不同飼喂條件能夠影響蜂王漿體外總抗氧化能力。

圖1 不同飼喂蜂王漿體外抗氧化指標(biāo)

蜂王漿的羥自由基清除率在60.81%~62.26%之間，如圖1所示，不同飼喂條件下生產(chǎn)的蜂王漿羥自由基清除率無顯著差異，表明不同飼喂條件不會(huì)對(duì)蜂王漿羥自由基清除能力產(chǎn)生影響。

2.3 相關(guān)性分析

為進(jìn)一步分析不同飼喂蜂王漿成分之間的關(guān)系，對(duì)蜂王漿測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)做Pearson相關(guān)性分析，如表4所示。葡萄糖氧化酶活性與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，葡萄糖氧化酶和總糖中的葡萄糖發(fā)生潛在抑制或降解反應(yīng)導(dǎo)致存在負(fù)相關(guān)性，而相關(guān)性系數(shù)（r= -0.304）較小的原因可能是蜂王漿中其他物質(zhì)也會(huì)影響葡萄糖氧化酶活性。葡萄糖氧化酶與總抗氧化能力（r=0.349）、羥自由基清除率（r=0.625）都存在極顯著正相關(guān)，主要由于葡萄糖氧化酶分解葡萄糖產(chǎn)生的過氧化氫提高了體外抗氧化能力?？偡优c總糖呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.396），有研究表明多酚能夠與蛋白相互作用抑制酶活性，其次多酚能夠產(chǎn)生過氧化氫減緩葡萄糖分解速率[29]，這可能是導(dǎo)致總酚和總糖負(fù)相關(guān)的原因。總酚與蜂王漿水溶性蛋白或游離氨基酸發(fā)生共價(jià)作用能夠提高蛋白的熱穩(wěn)定性[30]，使得蜂王漿容易熱分解的蛋白質(zhì)組分能夠穩(wěn)定保存，導(dǎo)致總酚與水溶性蛋白呈極顯著正相關(guān)。

表4 不同飼喂蜂王漿指標(biāo)相關(guān)性分析

3 結(jié)論

研究表明不同飼喂條件會(huì)影響蜂王漿水溶性蛋白含量，喂代花粉生產(chǎn)的蜂王漿水溶性蛋白最高，采食天然蜜粉源生產(chǎn)的蜂王漿次之，喂糖生產(chǎn)的蜂王漿水溶性蛋白最低。不同飼喂條件對(duì)蜂王漿總糖、總酚、葡萄糖氧化酶活性沒有顯著影響，說明飼喂條件不是影響其含量的主要因素。蜂王漿的總抗氧化性與飼喂條件有關(guān)，喂粉生產(chǎn)的蜂王漿總抗氧化能力最高，其次是喂糖生產(chǎn)的蜂王漿，采食天然蜜粉源生產(chǎn)的蜂王漿總抗氧化能力最低。但是在羥自由基清除能力上不同飼喂蜂王漿之間無顯著性差異，后續(xù)將通過多種抗氧化方法進(jìn)一步研究不同飼喂蜂王漿的抗氧化能力。相關(guān)性分析表明蜂王漿內(nèi)在組分之間存在關(guān)聯(lián)，葡萄糖氧化酶與總糖之間存在極顯著負(fù)相關(guān)，與抗氧化能力存在極顯著正相關(guān)，總酚和總糖存在極顯著負(fù)相關(guān)。蜂群在人工飼喂代花粉和糖水后生產(chǎn)的蜂王漿品質(zhì)沒有下降，在養(yǎng)蜂生產(chǎn)蜂王漿階段可以考慮人工飼喂。