原花青素提取及分離純化方法的研究進(jìn)展

張媛雯，趙琳，鄭天翔，陳語(yǔ)欣，譚偉

棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院（棗莊 277160）

原花青素（procyanidine，PC）是一類(lèi)在植物中廣泛存在的多酚化合物，是一種天然的抗氧化物。1961年首次從英國(guó)山楂新鮮果實(shí)中提取出該物質(zhì)，至今已有40多年的歷史[1]。原花青素是一類(lèi)黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，也稱(chēng)縮合單寧[2]，具有強(qiáng)有力的抗氧化、清除自由基能力，對(duì)人體微循環(huán)有特殊改善的雙重功效，以高效、低毒、高生物利用率而著稱(chēng)[3]?？萍嫉倪M(jìn)步與消費(fèi)者對(duì)食品感官要求的不斷提高，推動(dòng)了國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)原花青素分離、純化領(lǐng)域的研究。該文主要對(duì)原花青素的提取、分離、純化方法進(jìn)行綜述，旨為原花青素的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 原花青素的提取方法

目前，國(guó)內(nèi)外主要采用有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助提取、超臨界CO2萃取、微波輔助提取及酶提取等方法提取原花青素。從操作難易程度、提取率、能源消耗、適用性等方面對(duì)5種方法進(jìn)行對(duì)比，如表1所示。

1.1 有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑提取法是依據(jù)不同成分在不同有機(jī)溶劑中溶解度不同的原理，將活性成分從原料中提取出來(lái)。因操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，有機(jī)溶劑提取法已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化操作，但在提取過(guò)程中易造成熱不穩(wěn)定成分的破壞，同時(shí)存在有機(jī)溶劑使用量大、提取物雜質(zhì)含量較高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。不同的研究者所用有機(jī)溶劑種類(lèi)不同，提取率也有所不同。安鳴等[4]以廢酒花為原料，分別用50%的乙醇與70%的丙酮提取原花青素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%乙醇的提取量（45.36 mg/g）明顯大于70%丙酮的提取量（21.94 mg/g）。只德賢等[5]用65%乙醇提取白刺果原花青素，得率平均值為17.289±0.402 mg/g。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波能夠破碎植物細(xì)胞壁，便于溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使植物中有效成分與溶劑結(jié)合，提高提取率[6]。該法具備高效、適用性廣、提取率高且提取藥液雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，常與有機(jī)溶劑法共用。錢(qián)玉玲等[7]優(yōu)化了蔓越莓原花青素的超聲波輔助提取條件，以50%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），70 ℃下提取40 min時(shí)，原花青素得率高達(dá)11.65%。譚永鵬等[8]以50%乙醇為提取劑提取黑枸杞中原花青素，當(dāng)料液比1∶29（g/mL），220 W超聲26 min時(shí)，原花青素得率為6.10%。

1.3 微波輔助提取法

在微波環(huán)境中提取活性成分，使目的組分加速溶出的同時(shí)不會(huì)造成活性成分的結(jié)構(gòu)破壞[9]。該法提取效率高、熱效率高，具有短時(shí)、節(jié)能、控制方便、對(duì)活性物質(zhì)破壞小等[10-11]優(yōu)點(diǎn)。張星和等[12]通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了火棘果原花青素提取工藝，采用85%乙醇，料液比1∶40（g/mL），560 W微波80 s，提取率最高為12.51 mg/g。Neto等[13]采用共晶溶劑（ESs）與微波輔助相結(jié)合的方式提取葡萄皮渣中的原花青素，不僅大大縮短提取時(shí)間，而且提高了提取得率和平均聚合度。李瑞麗等[14]以50%乙醇為提取劑，在料液比1∶6（g/mL），80 ℃微波處理20 min，葡萄籽原花青素的提取量為51.77 mg/g。在眾多試驗(yàn)結(jié)果中，比較不同提取方法原花青素的提取率，微波輔助提取法所得原花青素提取率最高。

1.4 超臨界二氧化碳萃取法

超臨界二氧化碳萃取法通過(guò)控制溫度和壓力，改變超臨界二氧化碳的密度和溶解能力，使它與待分離物質(zhì)接觸，有選擇地把極性不同、沸點(diǎn)不同和分子量不同的成分萃取出來(lái)，然后通過(guò)減壓升溫，使超臨界CO2變?yōu)闅怏w，被萃取物質(zhì)析出，從而達(dá)到了分離純化的目的[15]。胡佳興等[16]以甲醇為夾帶劑從葡萄籽中萃取原花青素，在萃取壓力32 MPa，萃取溫度40 ℃，CO2流量為10 L/h的條件下萃取60 min，原花青素含量最高，為11.424 mg/g。顏雪琴等[17]以乙醇為夾帶劑萃取石榴皮中的原花青素，當(dāng)采用65%的乙醇、料液比1∶1.3（g/mL）、CO2流速為5 L/h、35 MPa下提取58 min時(shí)提取率為3.40%。該法適合萃取固態(tài)物質(zhì)，溶解速率高、無(wú)毒無(wú)污染，但設(shè)備要求高，投資大，難以推廣。

1.5 酶提取法

酶提取法主要是利用各種生物酶分解植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)擴(kuò)散、溶解，可避免原花青素的活性遭到破壞。該法易于操作、條件溫和、綠色無(wú)污染，是一項(xiàng)前景廣闊的技術(shù)[18]。韓卓等[19]優(yōu)化了紫薯原花青素的提取方法，在料液比1∶30（g/mL），pH為6.2，添加150 μg/mL纖維素酶，43 ℃下酶解65 min，原花青素提取率為5.039%。楊豆等[18]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了果膠酶和纖維素酶提取葡萄籽中原花青素的提取工藝，在料液比1∶21（g/mL）、pH 5，添加1.0%的復(fù)合酶、50 ℃酶解60 min的條件下，所得提取率為3.805%。

2 原花青素的純化分離方法

經(jīng)提取后的原花青素仍含有多糖、黃酮類(lèi)化合物、蛋白等雜質(zhì)，需進(jìn)一步分離純化后，才能進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、功能性研究或工業(yè)應(yīng)用。通過(guò)對(duì)多項(xiàng)分離純化方法的應(yīng)用與了解，總結(jié)了各類(lèi)工藝的特點(diǎn)，見(jiàn)表2。

表2 分離純化工藝特點(diǎn)

2.1 大孔樹(shù)脂吸附法

大孔吸附樹(shù)脂因其價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然植物活性成分的分離、純化，在原花青素純化研究領(lǐng)域應(yīng)用最多。大孔樹(shù)脂種類(lèi)豐富，常用的有聚酰胺、ADS-17、AmberliteXAD-16、AB-8等。譚永鵬[20]用AB-8大孔樹(shù)脂純化黑枸杞原花青素，當(dāng)上樣量5 BV，上樣流速2.0 mL/min，用50%乙醇洗脫，洗脫流速2.0 mL/min，洗脫量6 BV時(shí)，得到的原花青素純度為86.75%。Musdzalifah等[21]將紅高粱種子中的原花青素分別用大孔樹(shù)脂D101和AB-8進(jìn)行吸附分離，結(jié)果表明后者對(duì)原花青素有更高的吸附能力，其吸附容量可達(dá)34.65 mg/g，回收率為79.64%。伍勇等[22]從巨峰葡萄籽中提取原花青素后，用HPD-400大孔樹(shù)脂純化粗提液，上樣流速為1.0 mL/min，用50%乙醇在pH 7.5的條件下洗脫，經(jīng)純化后的原花青素純度可達(dá)94.17%。

經(jīng)大孔樹(shù)脂初步純化后的原花青素仍含有較多雜質(zhì)，純度較低，因此還需再次進(jìn)行純化。紀(jì)秀鳳等[23]采用HPD100大孔樹(shù)脂對(duì)紅樹(shù)莓籽原花青素吸附后，分別用40%和60%的乙醇洗脫得到低聚原花青素、高聚原花青素，最后利用聚酰胺二次純化，在最佳工藝條件（上樣液體積100 mL，上樣液2 mg/mL，上樣流速1.5 mL/min，解吸流速1.5 mL/min，70%的乙醇作為解吸劑，解吸劑體積為150 mL）下，得到的低聚原花青素純度為71.09%，較初步純化純度提高了18.73%。王丹陽(yáng)[24]先用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)葡萄籽原花青素進(jìn)行初步純化，純度達(dá)77.34%，再利用Sephadex LH-20進(jìn)一步純化，洗脫液濃縮后原花青素含量為90.52%。

2.2 膜分離過(guò)濾法

膜分離技術(shù)興起于20世紀(jì)初，于60年代發(fā)展為將物質(zhì)分離提純的新興技術(shù)，是一種物理篩分技術(shù)。膜分離的種類(lèi)有微濾（micro filtration，MF）、超濾（ultra filtration，UF）、納濾（nano filtration，NF）、電滲析（electrodialysis，ED）、反滲透（reverse osmosis，RO）[25]。該技術(shù)綠色、高效、易操作，在水相溶劑中亦可使用，并不會(huì)發(fā)生相變。

陳文良等[26]采用微濾、超濾的膜分離技術(shù)分離純化葡萄籽低聚原花青素，在1.0 MPa的操作壓力下，選擇10萬(wàn)道爾分子量規(guī)格的膜，制得產(chǎn)品的截留率最低，且低聚原花青素的含量較高。張娣等[27]用膜分離和樹(shù)脂吸附相結(jié)合的方法純化蓮房原花青素，在最適宜工藝條件下超濾獲得透過(guò)液，再用HZ-806樹(shù)脂純化，得到的原花青素純度在81%以上，高于直接進(jìn)行膜分離的原花青素純度。Bazinet等[28]采用電滲析和超濾膜結(jié)合技術(shù)純化濃縮紅莓汁中的原花青素和花青素，兩者總濃度分別提高了34.8%和52.9%。

膜分離技術(shù)在常溫下進(jìn)行，不會(huì)破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)，熱敏性物質(zhì)也可采用該技術(shù)。但其過(guò)濾設(shè)備價(jià)格高昂，生產(chǎn)成本高，難以工業(yè)推廣。

2.3 凝膠色譜法

凝膠色譜法可用于原花青素提取液經(jīng)初次純化后進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，提高純度，與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）聯(lián)用，可進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。Tovopearl-HW-40、Sephadex LH-20和Sepherdex 75HR是常用的凝膠色譜填料。

Ling等[29]利用Me2CO/H2O萃取蓮子房原花青素，Sephadex LH-20色譜柱進(jìn)行純化，得到純度大于98%的產(chǎn)物。Kawahara等[30]使用Amberlite XAD-1180N、Toyopearl HW40F和Sepacore C-18反相閃蒸柱層析法，把紅小豆的原花青素濃縮成5個(gè)餾分。Pedan等[31]通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱，將原花青素B2和C1二聚體和三聚體成功分離。張馳等[32]用大孔樹(shù)脂層析法分離純化沙棘果中的原花青素時(shí)含量高達(dá)71.9%，該粗品經(jīng)SephadexLH-20柱分離，50%乙醇作為流動(dòng)相，可純化至95%以上。楊雪娜[33]用Sephadex LH-20凝膠柱純化從龍眼、冷撒果果皮中的原花青素，得到了高純度的原花青素。

凝膠色譜法可以分離不同類(lèi)型的原花青素，分離純化效果最好，節(jié)省時(shí)間，提高效率，但其設(shè)備昂貴，維護(hù)成本高，投資大，不易推廣。

2.4 高速逆流色譜法

高速逆流色譜技術(shù)（HSCCC）是依據(jù)化合物在不相溶兩相間的分配能力不同，對(duì)植物中天然活性物質(zhì)進(jìn)行分離的液液分配色譜技術(shù)[34]。

Luo等[35]采用高速逆流色譜法對(duì)白葡萄皮中原花青素不同組分進(jìn)行純化，在3 mL/min流速、兩相系統(tǒng)為己烷-乙酸乙酯-水、950 r/min轉(zhuǎn)速的情況下，純化后組分純度可達(dá)90%以上。左春穎等[36]采用高速逆流色譜法將葡萄籽原花青素分離為6個(gè)組分，所得原花青素以高聚體為主要存在形式，低聚體占比少，總產(chǎn)率達(dá)85.1%。

高速逆流色譜技術(shù)是一種新興的分離提純技術(shù)，其避免了載體對(duì)提取物的污染和吸附，溶劑使用量少，同時(shí)具有高效、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備成本高，不宜推廣。

3 結(jié)語(yǔ)

原花青素具有廣泛的生物活性，從天然植物中提取分離純化原花青素，綠色、無(wú)公害，可用于藥品、食品和化妝品等領(lǐng)域。與國(guó)外的研究相比，國(guó)內(nèi)關(guān)于原花青素提取分離純化的研究?jī)?nèi)容多樣性、提取技術(shù)的先進(jìn)性等方面仍稍有欠缺，因此，國(guó)內(nèi)的原花青素仍有較高的研究?jī)r(jià)值。